Queremos reconocer el espíritu de cooperación de todos los miembros Caldwell laboratorio. A Basil O&#39;Connor Scholar Award de la Fundación March of Dimes y un premio de carrera de la National Science Foundation para GAC, así como una ciencia de Investigación de Pregrado Programa de Becas del Instituto Médico Howard Hughes de la Universidad de Alabama, han financiado la excitabilidad neuronal y epilepsia de investigación en el Laboratorio de Caldwell.

Aldicarb paradigma de la exposición <ol><li> En el primer día, asegúrese de que al menos treinta gusanos jóvenes etapa adulta de cada genotipo y de cada repetición estará disponible para los ensayos de aldicarb en el segundo día. Lo mejor es que un experimentador selecciona cincuenta o más gusanos etapa L4 en placas NGM fresco (mejor sin nistatina), que contienen E. coli (preferiblemente OP50) como fuente de alimento y crecer durante 12-24 horas a una temperatura constante y permisiva (20 º C a 22 ° C es el mejor, aunque el 25 ° C está bien). </li><li> En el segundo día, hacer una solución de 100 mM de valores de aldicarb con un 70% de etanol (EtOH) y el 30% ddH 2 O. Corre la cantidad apropiada de aldicarb en placas NGM menos nistatina con volúmenes definidos para alcanzar las concentraciones deseadas aldicarb. Estamos constantemente utilizan 0,5 mM aldicarb por la chapa del 37,5 l de 100 mM de aldicarb en 7,5 ml NGM placas. Permita que las placas de aldicarb se seque durante unos 30-60 minutos a temperatura ambiente. No es necesario para romper las tapas. Por otra parte, el aldicarb se puede agregar a NGM y almacenadas a 4 ° C durante una semana. &nbsp;</li><li> Después de los volúmenes de secado, placa uniforme de E. coli (preferiblemente OP50) en el centro de cada plato aldicarb y seco para otro 30-60 minutos a temperatura ambiente. Estamos constantemente placa 25 l de OP50, lo que crea un césped de alimentos suficientemente grande para mantener los gusanos se concentró en un pequeño punto sin hacinamiento. &nbsp;</li><li> Cuando el césped está seco de alimentos, se puede proceder con los ensayos de aldicarb. Debido a la naturaleza subjetiva de las pruebas de aldicarb, es muy recomendable que los experimentos se realizó &quot;a ciegas&quot;. Un colega del investigador principal podría volver a etiquetar las placas originales con los gusanos que se vaya a analizar. Asimismo, el compañero puede transferir los gusanos de las placas originales de las placas aldicarb cifrados inmediatamente antes de iniciar un temporizador. Si el experimentador prevé ensayar una cepa particular de los gusanos con un fenotipo característico, como la falta de coordinación, entonces también debe haber un control con un fenotipo similar para reducir el sesgo. Además, lo mejor es que el experimentador ensayos de una cepa de tipo salvaje, así como una cepa resistente y una cepa hipersensible, en paralelo a ayudar a normalizar los experimentos. El experimentador debe esforzarse para analizar un número consistente de los gusanos para cada repetición. Estamos constantemente analizar treinta gusanos de un solo genotipo para cada repetición. También llevamos a cabo al menos tres réplicas para cada experimento. Un investigador experimentado debe ser capaz de analizar por lo menos seis cepas a la vez. &nbsp;</li><li> Cuente el número de gusanos paralizados por la insistencia de una manera consistente cada gusano con un alambre de platino. Constantemente nuestros productos gusanos dos veces en la cabeza y dos en la cola cada 30 minutos para un total de tres horas. Cese de la faringe de bombeo también se puede utilizar para definir la parálisis, pero sólo si el investigador emplea una definición coherente de la parálisis en todos los ensayos. Además, vale la pena señalar que algunos gusanos, especialmente aquellos que son resistentes a aldicarb, puede intentar gatear fuera del plato. En este caso, el experimentador puede extenderse la misma cantidad de ácido palmítico, una barrera física para la locomoción gusano, alrededor de las placas aldicarb. Difundimos 25 L de 10 mg de ácido palmítico / ml EtOH. </li></ol> PTZ paradigma de la exposición <ol><li> En el primer día, asegúrese de que al menos treinta gusanos jóvenes etapa adulta de cada genotipo y de cada repetición estará disponible para los ensayos de PTZ en el segundo día. Lo mejor es que un experimentador selecciona cincuenta o más gusanos etapa L4 en placas NGM fresco (mejor sin nistatina), que contienen E. coli (preferiblemente OP50) como fuente de alimento y crecer durante 12-24 horas a una temperatura constante y permisiva (20 º C a 22 ° C es el mejor, aunque el 25 ° C está bien). </li><li> En el segundo día, hacer un PTZ 0,5 g / ml de solución madre ddH 2 O de PTZ. Corre la cantidad adecuada de PTZ en NGM menos placas de nistatina con volúmenes definidos para alcanzar las concentraciones deseadas PTZ. Porque preferimos dosis-respuesta para los ensayos de PTZ, que la placa de cantidades variables de PTZ en 7,5 ml NGM placas. Por ejemplo, una placa puede 37,5 l de la solución madre PTZ en un plato NGM 7,5 ml de hacer una 5 mg PTZ / ml de solución. Permita que las placas PTZ secar durante aproximadamente 60 a 120 minutos a temperatura ambiente. No es necesario para romper las tapas. Por otra parte, PTZ se puede agregar directamente a NGM, pero debe ser inmediatamente utilizado para los ensayos después de la solidificación. La estabilidad de PTZ es considerablemente menor que la de aldicarb. Por lo tanto, los ensayos con mayores placas PTZ son menos confiables. PTZ deben almacenarse a -20 ° C en un desecador con un agente de secado antes de su uso. Nosotros preferimos descartar PTZ aproximadamente dos meses después de la apertura para garantizar la estabilidad. </li><li> Después de los volúmenes de secado, placa uniforme de E. coli (preferiblemente OP50)en el centro de cada plato PTZ y seco para otro 30-60 minutos a temperatura ambiente. Estamos constantemente placa 25 l de OP50, lo que crea un césped de alimentos suficientemente grande para mantener los gusanos se concentró en un pequeño punto sin hacinamiento. &nbsp;</li><li> Cuando el césped está seco de alimentos, se puede proceder con los ensayos de PTZ. Aunque los ensayos de PTZ son menos subjetivos que los ensayos de aldicarb, todavía es muy recomendable que los experimentos se realizó &quot;a ciegas&quot;. Un colega del investigador principal podría volver a etiquetar las placas originales con los gusanos que se vaya a analizar. Asimismo, el compañero puede transferir los gusanos de las placas originales de las placas PTZ cifrados inmediatamente antes de iniciar un temporizador. Si el experimentador prevé ensayar una cepa particular de los gusanos con un fenotipo característico, como la falta de coordinación, entonces también debe haber un control con un fenotipo similar para reducir el sesgo. Además, lo mejor es que el experimentador ensayos de una cepa de tipo salvaje, así como con las cepas anteriores, o de cuerpo entero convulsiones, en paralelo a ayudar a normalizar los experimentos. El experimentador debe esforzarse para analizar un número consistente de los gusanos para cada repetición. Estamos constantemente analizar treinta gusanos de un solo genotipo para cada repetición. También llevamos a cabo al menos tres réplicas para cada experimento. Un investigador experimentado debe ser capaz de analizar por lo menos tres cepas a la vez. Sin embargo, la frecuencia y la intensidad de las convulsiones inducidas por PTZ alcanzan su pico máximo entre los 15-30 minutos de exposición, y luego atenuar los gusanos se paralizan o, en algunos casos, se aclimate a la droga. </li><li> Cuente el número de &quot;epilepsia-como&quot; gusanos convulsiones cada 30 minutos para un total de una hora. Lo mejor es anotar el número de gusanos con convulsiones anterior, lo que llamamos &quot;cabeza-bobs&quot;, independientemente de la cantidad de gusanos con convulsiones de todo el cuerpo, la parálisis de todo el cuerpo, lo que llamamos &quot;tónico&quot;, o una combinación de convulsiones anterior con parálisis BWM, lo que llamamos &quot;tónico-clónicas&quot;. La mayoría de los gusanos de un solo genotipo presentan sólo un tipo de convulsión. Sin embargo, tónico-clónicas gusanos a menudo se vuelven completamente tónica, por lo que se debe continuar con el ensayo de los últimos 30 minutos, incluso si todos los gusanos ya han expuesto convulsiones. Además, vale la pena señalar que algunos gusanos pueden intentar arrastrarse fuera del plato. En este caso, el experimentador puede extenderse la misma cantidad de ácido palmítico alrededor de las placas PTZ. Difundimos 25 L de 10 mg de ácido palmítico / ml EtOH. </li></ol> Las respuestas de comportamiento de una selección de C. elegans mutantes de transmisión sináptica de aldicarb y PTZ <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> Nombre mutante </th><th> Función sináptica </th><th> Comportamiento sin Drogas </th><th> Respuesta de comportamiento para Aldicarb (en comparación con el tipo salvaje N2) </th><th> La respuesta conductual a PTZ </th></tr><tr><td> tom-1 (ok188) </td><td> inhibe la transmisión sináptica </td><td> falta de coordinación </td><td> mayor tasa de parálisis </td><td> indistinguible de la de tipo salvaje </td></tr><tr><td> unc-43 (n498n1186) </td><td> complejo </td><td> falta de coordinación </td><td> mayor tasa de parálisis </td><td> todo el cuerpo las convulsiones </td></tr><tr><td> unc-25 (e156) </td><td> facilita la transmisión de GABA </td><td> falta de coordinación </td><td> mayor tasa de parálisis </td><td> convulsiones anterior, todo el cuerpo parálisis </td></tr><tr><td> SNB-1 (md247) </td><td> promueve la transmisión sináptica </td><td> falta de coordinación </td><td> reducción del tipo de parálisis </td><td> convulsiones anterior </td></tr><tr><td> UNC-4 (e120) </td><td> promueve la transmisión de ACh </td><td> falta de coordinación </td><td> reducción del tipo de parálisis </td><td> indistinguible de la de tipo salvaje </td></tr></tbody></table> Dos estimulantes neural, un inhibidor de la acetilcolinesterasa, llamado aldicarb, y un antagonista de los receptores GABA, llamada pentilentetrazol (PTZ), se puede utilizar de manera complementaria para caracterizar C. elegans mutantes sináptica de la transmisión. El exceso de excitación acetilcolina (ACh) se acumula en el cuerpo del gusano de la pared las uniones neuromusculares (NMJs) de mutaciones deletéreas en los reguladores negativos de la ACh transmisión (por ejemplo, tom-1 y unc-43) o reguladores positivos de la inhibitoria de transmisión de GABA (por ejemplo, unc-25). Por el contrario, los niveles de excitación ACh en NMJs gusano se ven disminuidos por las mutaciones deletéreas en los reguladores positivos de la transmisión sináptica en general (por ejemplo, SNB-1) o ACh genes específicos de la transmisión (por ejemplo, UNC-4). En comparación con los gusanos de tipo salvaje N2, gusanos mutantes con transmisión elevada excitación ACh en NMJs presentan aumento de las tasas de aldicarb parálisis inducida, mientras que los gusanos mutantes con la transmisión de baja excitación ACh demostrar los tipos reducidos del aldicarb parálisis inducida. Aunque PTZ altera la sincronía neuronal en C. elegans músculos de la pared del cuerpo, no a diferencia de aldicarb, PTZ también antagoniza inhibidor GABA en los músculos de la cabeza C. elegans. Como resultado, la sensibilidad aldicarb no pueden predecir con precisión la sensibilidad PTZ. Gusanos mutantes con defectos específicos en regul negativo o positivoción de la transmisión de acetilcolina son indistinguibles de los gusanos N2 de tipo salvaje en la presencia de PTZ, mientras que los gusanos mutantes con defectos en la regulación positiva de la transmisión sináptica en general o defectos específicos en la exposición de la transmisión inhibitoria GABA robusta PTZ convulsiones inducidas anterior. Por otra parte, unc-43 la pérdida de función de mutantes pantalla de cuerpo entero convulsiones en presencia de PTZ y probablemente tienen más anomalías en la transmisión sináptica, que contribuyen a las respuestas medicamento único.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

Los protocolos actuales para la exposición con aldicarb C. elegans no permiten distinguir entre los experimentadores de mutantes con déficits específicos en la transmisión de acetilcolina y los mutantes con un déficit generalizado en la transmisión sináptica, ya que ambas clases de mutantes presentan resistencia a aldicarb. Del mismo modo, el aldicarb no se puede utilizar para determinar si los mutantes tienen un déficit específico en la transmisión de GABA o fallas generalizadas de regular negativamente la transmisión d...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

El nematodo Caenorhabditis elegans, se ha convertido en un modelo de recurso para el estudio de la neurotransmisión. C. elegans es único entre los modelos animales, como la anatomía y la conectividad de su sistema nervioso se ha determinado a partir de microfotografías electrónicas y refinado por los ensayos farmacológicos. En este video, se describe cómo dos estimulantes complementarias neural, un inhibidor de la acetilcolinesterasa, llamado aldicarb, y un ácido gamma-aminobutírico (GABA), antagonista de los receptores, llamados pentilentetrazol (PTZ), puede ser empleado para caracterizar específicamente la señalización en C. elegans las uniones neuromusculares (NMJs) y facilitar la comprensión de los circuitos neuronales antagónicos. De 302 neuronas de C. elegans, diecinueve GABAérgicas de tipo D de las neuronas motoras inervan los músculos de la pared del cuerpo (OCM), mientras que cuatro neuronas GABAérgicas, llamado MER, los músculos inervan la cabeza. Por el contrario, treinta y nueve neuronas motoras expresar el neurotransmisor excitador, la acetilcolina (ACh), y antagonizar la transmisión GABA en el OCM para coordinar la locomoción. La naturaleza antagónica de las neuronas motoras colinérgicas y GABAérgicas en el cuerpo NMJs muro fue determinado inicialmente por la ablación por láser y posteriormente reforzado por la exposición al aldicarb. Aguda de la exposición al aldicarb en una parálisis de tiempo-por supuesto-o la dosis de respuesta de tipo salvaje gusanos. Sin embargo, la pérdida de transmisión excitatoria ACh confiere resistencia a aldicarb, como menos ACh se acumula en NMJs gusano, que conduce a una menor estimulación de la OCM. La resistencia a aldicarb se puede observar con los mutantes función ACh-sean generales o específicos sináptica. De acuerdo con antagonistas GABA y la transmisión de acetilcolina, la pérdida de transmisión de GABA, o la incapacidad de regular negativamente la liberación de ACh, confiere hipersensibilidad al aldicarb. Aunque la exposición aldicarb ha conducido al aislamiento de los homólogos de los genes del gusano numerosos neurotransmisión, la exposición aldicarb por sí sola no puede determinar de manera eficiente las funciones predominantes de los genes y las vías en las neuronas específicas de C. elegans motor. Para ello, hemos introducido un enfoque complementario experimental, que utiliza PTZ. Mutantes neurotransmisión mostrar fenotipos clara, distinta de la parálisis inducida por el aldicarb, en respuesta a PTZ. De tipo salvaje gusanos, así como mutantes con inhabilidades específicas para lanzar o recibir ACh, no muestran la sensibilidad evidente para PTZ. Sin embargo, los mutantes GABA, así como en general la función sináptica mutantes, mostrar convulsiones anterior en un tiempo-por supuesto-o la dosis de respuesta. Mutantes que no pueden regular negativamente la liberación de neurotransmisores en general y, por tanto, segregan cantidades excesivas de acetilcolina en OCM, se paralizan en el PTZ. Los fenotipos PTZ-inducida de las clases discretas mutantes indican que un enfoque complementario con aldicarb y paradigmas PTZ exposición en C. elegans puede acelerar nuestra comprensión de la neurotransmisión. Por otra parte, los videos que demuestran cómo llevamos a cabo ensayos farmacológicos deberían establecer métodos coherentes para C. elegans la investigación.

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Este video muestra cómo utilizar dos estimulantes neural, aldicarb y pentilentetrazol (PTZ), de manera complementaria para estudiar la función sináptica en el nematodo C. elegans. Con este enfoque complementario también puede ser utilizado para arrojar luz sobre los mecanismos conservado evolutivamente de sincronía neuronal modular y tiene implicaciones para la epilepsia y las convulsiones.

Paradigmas para la caracterización farmacológica de C. elegans mutantes transmisión sináptica

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vistas.  University of Alabama. Este video muestra cómo utilizar dos estimulantes neural, aldicarb y pentilentetrazol (PTZ), de manera complementaria para estudiar la función sináptica en el nematodo C. elegans. Con este enfoque complementario también puede ser utilizado para arrojar luz sobre los mecanismos conservado evolutivamente de sincronía neuronal modular y tiene implicaciones para la epilepsia y las convulsiones.

Video: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit ensayos para las convulsiones en la epilepsia de los mutantes Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...