Este artículo fue financiado por el NIH subvenciones a JER. Me gustaría agradecer al Dr. Alex Gottschalk para proporcionar a los gusanos transgénicos que expresan canales de la rodopsina en las neuronas colinérgicas de motor usado en una de las manifestaciones de grabación.

A. Preparación de las herramientas utilizadas para la disección. <ol><li> La cámara de disección / grabación: Por lo general la construcción de nuestra cámara de grabación de un 1 / 16 de pulgada de hoja magnética, con un agujero circular perforado en el centro, que es lo suficientemente grande para dar cabida a un vaso de 22 mm de diámetro cubierta circular. Las dimensiones exteriores de la cámara dependerá de la platina del microscopio usado para hacer las grabaciones. En el reverso de la hoja magnética, se adjunta un 48 x 60 mm cubierta antideslizante, lo que nos adherimos a la cámara mediante la colocación de una bolita de cera de los tejidos de baja fusión Paraplax inserción en cada esquina de la hoja de cubierta colocada entre el cristal y la cámara . La cera se funde en un plato caliente, placa de cristal hacia arriba, hasta que se forme una capa continua pegando la hoja de la cubierta de la cámara. No deje este paso sin vigilancia ya que la cera se derrite rápidamente. La cámara se debe quitar y se enfría tan pronto como la cera se derrita. El exceso de cera que se ha filtrado a lo largo del borde interior de la cavidad circular de 22 mm se puede eliminar con una ventaja de hoja de afeitar. </li><li> Sylgard recubierto cubreobjetos: La disección se realiza en una de 22 mm, con recubrimiento Sylgard cubreobjetos que se coloca dentro de la cavidad circular de la cámara de grabación. La capa Sylgard ayuda a que el pegamento cianoacrílico se adhieren a la hoja de cubierta que pegar los gusanos hacia abajo y también actúa como un cojín sobre el que romper de nuevo el pegamento punta de la pipeta cuando se tapa. Sylgard está compuesta por frescos de acuerdo a las instrucciones del fabricante (10 piezas base de silicona y 1 parte de endurecedor por peso). Una pequeña gota de Sylgard se coloca en cada hoja de la cubierta y se unta todo con un borde de una hoja de afeitar para hacer una superficie uniforme. El cubreobjetos recubiertos se colocan en grandes recipientes planos cubiertos y se fue en un horno de grado 65 º durante la noche para curar. </li><li> Pipetas: Por lo general, se utiliza el mismo filamento de 1 mm de diámetro exterior de vidrio de borosilicato para generar las pipetas para los gusanos pegando, haciendo incisiones cutícula y el registro de los músculos, con un extractor de electrodos. Es aconsejable sacar un frasco de pipetas antes de intentar una disección de esta etapa puede requerir varios intercambios rápidos de las pipetas. </li><li> Aplicador de cola: cola se carga y se aplica desde la punta de una pipeta de goma, por boca de presión. La pipeta pegado se inserta en un extremo de una pieza de 2 pies de tubería de polietileno con un diámetro interior que coincide con el diámetro exterior de la pipeta (generalmente de 1 mm). El otro extremo de la tubería tiene una punta de pipeta eppendorf que actúa como un pedazo de la boca. </li><li> Extracción de pipeta: Las vísceras gusano debe ser retirado de la cavidad del gusano una vez que la incisión de la cutícula se ha hecho. Esto se logra con un pedazo de tubo conectado a una punta de pipeta eppendorf similar al aplicador de cola pero en este caso la extracción de vidrio punta de la pipeta se rompe lo suficiente para que los huevos y las vísceras para ser fácilmente aspirado fuera de la cavidad del gusano. </li></ol> B. La disección <ol><li> En la cámara de grabación de una línea de cera de corral circular se extrae cerca del perímetro de la cámara a la que se pulsa una hoja de cubierta Sylgard recubiertos firmemente en su lugar (Sylgard capa hacia arriba). Esta línea de cera inmoviliza la hoja de la cubierta e impide la solución de grabación se filtre por debajo y se desprenda de la hoja de la cubierta durante la disección y la grabación. La cámara se llena con una solución de registro extracelular y varios gusanos se colocan en el centro con un pico del gusano. Los gusanos nadar en solución, sin embargo con la práctica, estos gusanos pueden ser pegados sin ningún tipo de procedimientos adicionales, tales como refrigeración para evitar el movimiento. Durante la etapa de entrenamiento, puede ayudar a la práctica los gusanos pegado mutante en el que la natación es afectada (por ejemplo, unc-31 mutantes). </li><li> Un recipiente de pegamento hecho con una tapa de PCR realizada en cera o plastilina, se utiliza para mantener un stock de trabajo de la cola cianoacrílico. Pipetas de cola con punta de dimensiones similares a las pipetas de grabación (normalmente ~ 4 megohmios de resistencia) se utilizan para aplicar el pegamento. Usando el aplicador de cola, una pequeña cantidad de pegamento es absorbida en la pipeta de pegamento, con el alcance de disección para visualizar la punta de la pipeta como el pegamento es absorbido. </li><li> El pegamento cianoacrílico (HistoacrylBlue, Aesulap) se polimeriza en contacto con una solución de registro extracelular, por lo tanto es importante mantener la presión positiva en la pipeta de cola, ya que entra en la solución de la cámara para evitar que el pegamento se endurezca y tapar la pipeta. Tan pronto como la pipeta de cola es en la solución de cámara, un flujo pequeño pero constante de pegamento debe ser aplicado sobre la superficie Sylgard bajo el control de la boca de presión para evitar el taponamiento. Si la pipeta se tapa a veces puede ser desbloqueado por golpeando suavemente la punta en el cristal Sylgard recubiertos. Se recomienda que la práctica antes de intentar pegar a los gusanos de goma. Si habitualmente puede escribir su nombre en la cola en el Sylgard, con letras hechas de líneas más finas que el ancho de los gusanos que están listos para procid a pegar la cutícula del gusano. </li><li> Para pegar un gusano, el uso de presión positiva para adjuntar una pequeña cantidad de pegamento ya sea a la cabeza o la cola del gusano y el gusano dibujar rápidamente hacia la superficie Sylgard. Tratar de unir el gusano cerca del centro de la cámara como los gusanos pegados demasiado cerca del borde será difícil de alcanzar con pipetas de grabación. A continuación, aplicar una corriente constante de pegamento en el borde dorsal de la cutícula de los gusanos de la unión de partida, obligando al gusano en un C-posición con la vulva hacia adentro (para las grabaciones de los músculos ventrales). Las lagunas en esta línea de cola se debe llenar en lo que el gusano está fuertemente unido, para evitar que el gusano se desprenda durante el paso de la incisión cutícula. </li><li> Para hacer la incisión cutícula, cambiar a una pipeta de disección de mano. Esta pipeta debe ser más agudo que el pegamento / grabación de las pipetas y tener un mango corto y robusto. Utilizando la más alta de aumento en el microscopio de disección, alinear la pipeta en paralelo al eje longitudinal del gusano e inserte la punta sobre el punto medio a lo largo del gusano (cerca de la vulva) de hacer la incisión en la interfaz de la cutícula / pegamento. Esta incisión libera la presión hidrostática gusanos obligando a los huevos y los intestinos a través del punto de incisión. Seguir reduciendo la cutícula hacia la cabeza del gusano con un movimiento de corte similar a la apertura de una carta, hasta llegar a la faringe. Cambiar a la pipeta de extracción al vacío de los órganos internos del gusano. Después de limpiar la herida, la cutícula abierta mantendrá su forma cilíndrica. Utilice una pipeta pegado fresco para la soldadura por puntos el borde del corte de la cutícula hacia abajo sobre la superficie Sylgard. Es importante utilizar un mínimo de puntos de pegamento en esta etapa para evitar dañar u ocultar los NMJs. La ventral del nervio espinal y músculos de la pared del cuerpo están expuestos. </li><li> Para quitar la membrana basal que cubre el NMJs, chupar la solución de grabación extracelular de la cámara y aplicar la colagenasa (0.4mg/ml en una solución de registro extracelular) durante unos 10-20 segundos, retirar y lavar varias veces con una solución fresca registro extracelular. Pasar a la etapa de grabación. </li></ol> C. patch-clamp grabación <ol><li> Posición de la cámara de grabación en una platina del microscopio a la derecha con un objetivo de 10X para centrar el gusano. Cambiar a un 40X agua emersión objetivo con coagulación intravascular diseminada y comprobar que los músculos de la pared del cuerpo y el cordón nervioso están intactas. La posición del gusano de modo que el eje longitudinal del gusano es paralelo con el borde frontal del ámbito de aplicación, lo que permite que se introduzcan electrodos en ambos lados de la izquierda y la derecha. </li><li> Parche con el músculo de sujeción estándar parche técnicas. Electrodos de registro de alrededor de 4 resistencia megaohmios funcionan bien. Una vez que el electrodo toca la membrana muscular, aumento de presión negativa hasta que un sello gigohm se obtiene. Para el modo de grabación de células enteras voltaje-clamp, aplicar más de succión y zap la membrana hasta que el sello está roto gigohm. En una buena grabación, los músculos del cuerpo de la pared de los gusanos adultos de tipo salvaje suelen tener una capacidad de la membrana celular de ~ 70 pF y puede ser registrado en forma estable al menos 10 minutos en un potencial de -60 mV con un mínimo de corrientes de retención (~ 50 pA). </li><li> La solución se compone de registro extracelular (en mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl2 5, MgCl 2 4, 10 glucosa, sacarosa 5, HEPES 15 (pH 7,3, 330mOsm ~). La pipeta parche contiene (en mM): KCl 120, KOH 20, MgCl 2 4, (N-tris [hidroximetil]-2-mthyl aminoetano-sulfónico) TES 5, dihidrato CaCl2 0,25, Na 2 4 ATP, sacarosa 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Nota: Estas soluciones de carga artificialmente las células musculares con cloruro, por lo que el GABA mediada por los receptores de corrientes hacia el interior debido a la emanación de cloruro en un potencial de -60 mV. Variaciones sobre estas soluciones se han utilizado (ver las publicaciones para más detalles). </li><li> Evocó la liberación. Normalmente se coloca un segundo electrodo que contiene la solución extracelular en la parte anterior del nervio cordón ventral del músculo parcheado. Esta configuración parche suelto requiere grandes estímulos despolarizantes (del orden de 10 segundos de voltios) de corta duración (1-2ms) para lograr la máxima respuestas evocadas (normalmente 2,0-2,5 nA) de tipo salvaje gusanos. Las limitaciones de este enfoque son: 1) Sólo un reducido número de respuestas evocadas pueden ser entregados antes de que el cordón nervioso está irreversiblemente dañado y 2) Por razones desconocidas, sólo respuestas colinérgicas evocado puede ser obtenido con esta configuración de estimulación. </li><li> La luz activa el canal-rodopsina estimulación. Recientemente, el laboratorio ha generado Gottschalk gusanos transgénicos que expresan las algas de origen rodopsinas canal que despolarizar la membrana a la luz de la estimulación de los subgrupos de neuronas, según el promotor utilizado para dirigir la expresión 4. En el caso de la C. elegans UNM, líneas de expresión de los canales integrados rodopsina, ya sea en las neuronas motoras colinérgicas o neuronas GABAérgicas del motor están dise. Desde el canal de la rodopsina sólo responde a la luz cuando todo-trans retinal se asocia con el resto opsina, gusanos utilizan para esta aplicación deben ser cultivados en las bacterias mezclada con la retina. Un pulso de luz verde se puede utilizar para activar repetidamente el canal de la rodopsina causando la liberación evocada de cualquiera de ACh o GABA, en función de que los gusanos transgénicos se utilizan. Estos gusanos transgénicos se puede cruzar en las cepas mutantes. La ventaja de esta técnica sobre la estimulación eléctrica anteriores incluyen: 1) La luz de activación no causa daño neuronal, lo que permite la repetición de muchos estímulos para llevar a cabo y 2) Evocados liberación de cualquiera de las neuronas GABAérgicas de motor o colinérgicos puede ser independiente de estudio. </li><li> Hiperosmótico inducida por la liberación. Para medir el tamaño de la piscina de la vesícula fácilmente pueden soltar (que refleja la piscina suma de las vesículas preparadas de todo el MNJ en el músculo registrada), de presión a la pipeta con solución hiperosmótico extracelular (ajustado a ~ 850 mOsm por adición de sacarosa adicional) se utiliza. La presión de pulso de aplicaciones de 1-3 segundos produce un aluvión de asíncrono post-sináptica eventos utilizando las soluciones estándar descrito anteriormente. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> Figura 1: Esquema de la C. elegans la disección y la configuración de la grabación neuromuscular Un cubreobjetos Sylgard recubiertas que estén hechas por colocación de una gota de Sylgard a través del vidrio y curado durante la noche se coloca en la cavidad circular de la cámara de registro prefabricados y cubiertas con una solución de grabación. Un gusano coloca en el centro está pegado a la superficie Sylgard a partir de la cabeza o la cola, la aplicación de pegamento en la cara dorsal del gusano, utilizando una pipeta de goma,. Una vez pegado se ha completado, una incisión adyacente a la vulva, en la interfase entre la cutícula y la cola se realiza con una aguja de vidrio y se extendió hacia la cabeza (ver la línea perforada de color rojo). Tras la extracción de las vísceras y los huevos de la cavidad del cuerpo, el borde del corte de la incisión es soldada por puntos con pegamento a la Sylgard exponer el nervio ventral (verde) y los músculos del cuerpo de la pared (en rojo). El músculo ventral-medial anterior de la vulva es patch-pinza y el electrodo de estimulación se coloca arriba en el cordón nervioso. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Figura represenative" width="600" height="404" /> De células enteras, la tensión de los enganches del cuerpo grabaciones músculo de la pared se muestran para cada uno de los tres protocolos de estimulación se ha descrito anteriormente (evocada eléctricamente, la luz y las respuestas evocadas hiperosmótico). En todos los casos el músculo ventral del cuerpo-medial de la pared se fija a -60 mV. A. de tipo salvaje células musculares por lo general exhiben altas tasas de corrientes hacia el interior endógeno en miniatura sináptica en nuestras soluciones de grabación estándar. B. A la despolarización de 2ms del cordón nervioso ventral anterior provoca la liberación sincrónica de varias sinapsis que resulta en una gran respuesta de alrededor de 2-2.5 provocado nA de tipo salvaje gusanos. Rastros representante a la derecha de la traza de tipo salvaje en A y B muestran liberación sináptica en una grave falta de coordinación mutante (UNC-18). El panel C muestra una respuesta a la luz-evocada de la unión neuromuscular de un gusano de tipo salvaje expresar canal rodopsina en las neuronas colinérgicas. Un pulso de luz de 2 ms típicamente produce una respuesta de 1,5 a 1,8 nA. D. La presión de eyección de la solución salina 850 mOsm hiperosmótico en el músculo durante 1 segundo, produce una descarga asincrónica de las corrientes sinápticas en miniatura que representan a la piscina con facilidad-liberable de vesículas.

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La genética organismo modelo C elegans es ideal para el estudio de la transmisión sináptica, a través del análisis funcional de las mutaciones en genes que codifican las proteínas sinápticas. Aquí se ha descrito una técnica de disección que hace que el C. elegans NMJs accesible para el análisis electrofisiológico. El video que acompaña describe los pasos críticos en el C. elegans disección y la configuración de grabación típico utilizado para medir la actividad sináptica. Lo...

dissecting and recording from the c. elegans neuromuscular junction

Neurotransmisión es el proceso por el cual las neuronas de transferencia de información a través de señales químicas para su post-sináptica objetivos, en una escala de tiempo rápido. Este complejo proceso requiere la actividad coordinada de muchas proteínas pre-y post-sináptica para garantizar la conectividad sináptica adecuada, conducción de señales eléctricas, la orientación y el cebado de las vesículas secretoras, sensibles al calcio, la localización de las vesículas de fusión, y la función de los receptores postsinápticos y, finalmente, el reciclaje, mecanismos. Como los neurocientíficos es nuestra meta para dilucidar que las proteínas funcionan en cada uno de estos pasos y comprender sus mecanismos de acción. Registros electrofisiológicos de las sinapsis proporcionar una cuantificables lectura de los hechos subyacentes eléctricos que se producen durante la transmisión sináptica. Al combinar esta técnica con el poderoso conjunto de herramientas moleculares y genéticas disponibles para manipular las proteínas sinápticas en C. elegans, podemos analizar los cambios funcionales resultantes de la transmisión sináptica. El C. elegans NMJs formado entre las neuronas motoras y los músculos de la pared del cuerpo de control de la locomoción, por lo tanto, los mutantes con fenotipos falta de coordinación locomotriz (conocido como unc s) a menudo la transmisión sináptica en estas perturbar una sinapsis. Desde mutantes unc se mantienen en una fuente rica de una fuente de alimento de bacterias, que siguen siendo viables, siempre que conservan la capacidad de bombeo de la faringe para ingerir alimentos. Esto, junto con el hecho de que C. elegans existen como hermafroditas, les permite pasar a la progenie mutante sin la necesidad de que las conductas de apareamiento más detalles. Estos atributos, junto con nuestra capacidad para grabar los últimos de los gusanos NMJs 2,3,7 hacen de este organismo en un excelente modelo para abordar precisamente cómo unc neurotransmisión impacto mutantes. El método de disección implica inmovilizar los gusanos adultos usando un pegamento cianoacrílico con el fin de hacer una incisión en la cutícula del gusano de la exposición del NMJs. Desde C. adultos elegans sólo 1 mm de longitud se realiza la disección con el uso de un microscopio de disección y requiere una excelente coordinación ojo-mano. Grabaciones MNJ se hacen de células enteras voltaje de sujeción individuales del cuerpo las células musculares de la pared y la liberación de neurotransmisores puede ser evocado mediante una variedad de protocolos de estimulación incluyendo la estimulación eléctrica, activado por la luz del canal-rodopsina mediada por la despolarización de 4 y solución salina hiperosmótico, todos los cuales se se describen brevemente.

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Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Aplicación de la electrofisiología de las sinapsis accesibles proporciona una medida cuantificable de la actividad sináptica, útil en el análisis de mutantes sinápticos. Este artículo describe un método de disección utilizado para exponer la uniones neuromusculares (UNM) de<em&gt; Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em&gt; Y discute brevemente algunos de los usos a los que se puede aplicar esta preparación.

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

dissecting-and-recording-from-the-c-elegans-neuromuscular-junction

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K vistas.  University of Illinois, Chicago. Aplicación de la electrofisiología de las sinapsis accesibles proporciona una medida cuantificable de la actividad sináptica, útil en el análisis de mutantes sinápticos. Este artículo describe un método de disección utilizado para exponer la uniones neuromusculares (UNM) de Caenorhabditis elegans (C. elegans) Y discute brevemente algunos de los usos a los que se puede aplicar esta preparación.

Video: Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Resumen

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Capítulos en este video

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

Básico

Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Un método para cultivar embrionarias

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo