Faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs

Résumé

Nous avons développé une technologie basée sur le film de silice mésoporeuse mince pour la récupération sélective des protéines de faible poids moléculaire et des peptides à partir de sérum humain. Les propriétés physico-chimiques de nos puces mésoporeux ont été finement réglé pour fournir un contrôle substantiel dans l'enrichissement peptide et par conséquent le profil du protéome sérique à des fins diagnostiques.

Résumé

L'identification de biomarqueurs circulants détient un grand potentiel pour des approches non invasives dans le diagnostic précoce et le pronostic, ainsi que pour la surveillance de l'efficacité thérapeutique. ^1-3 Le protéome circulant de bas poids moléculaire (LMWP) composé de petites protéines versées à partir de tissus et de cellules ou de fragments peptidiques issus de la dégradation protéolytique de grandes protéines, a été associée à l'état pathologique chez les patients et reflète probablement l'état de la maladie. ^4,5 dépit de ces applications cliniques potentielles, l'utilisation de la spectrométrie de masse (MS) pour profiler l'LMWP de les fluides biologiques s'est avérée très difficile en raison de la grande plage dynamique des concentrations des protéines et des peptides dans le sérum. ⁶ Sans prétraitement de l'échantillon, une partie des protéines plus très abondants masquer la détection de faible abondance des espèces dans le sérum / plasma. Actuelles protéomique des approches fondées sur, comme deux dimensions sur gel de polyacrylamide-elméthodes ectrophoresis (2D-PAGE) et de la protéomique fusil de chasse sont de main-d'œuvre, à faible débit et de l'adéquation offre limitée pour des applications cliniques. ^7-9 Par conséquent, une stratégie plus efficace est nécessaire pour isoler LMWP à partir de sang et de permettre le dépistage à haut débit d'échantillons cliniques .

Ici, nous présentons un moyen rapide, efficace et fiable multi-fractionnement système basé sur des puces de silice mésoporeuse de cibler spécifiquement et enrichir LMWP. ^10,11 mésoporeux de silice (MPS) de couches minces avec des caractéristiques ajustables à l'échelle nanométrique ont été fabriqués en utilisant la voie modèle copolymère tribloc . Utilisation des modèles différents de polymère et la concentration de polymère dans la solution de précurseur, les différentes distributions de tailles de pores, les pores, les structures de connexion et les propriétés de surface ont été déterminée et appliquée pour la récupération sélective des protéines de faible masse. L'analyse syntaxique sélective des peptides enrichis en sous-classes différentes en fonction de leurs propriétés physico-chimiques enHance l'efficacité de la récupération et la détection des espèces de faible abondance. En combinaison avec la spectrométrie de masse et l'analyse statistique, nous avons démontré la corrélation entre les caractéristiques nanophase des films minces de silice mésoporeuse et la spécificité et l'efficacité de la récolte de masse protéome faible. Les résultats présentés ici révèlent le potentiel de la technologie à base de nanotechnologie pour offrir une alternative puissante aux méthodes conventionnelles pour la récolte de LMWP liquides biologiques complexes. En raison de la capacité de régler les propriétés des matériaux, la capacité de production à faible coût, la simplicité et la rapidité de la collecte de l'échantillon, et les exigences relatives aux échantillons très réduits pour l'analyse, cette nanotechnologie roman une incidence considérable sur le domaine de la recherche sur les biomarqueurs protéomiques et protéomique clinique l'évaluation.

Protocole

1. La fabrication de puces

1. Créer la solution de revêtement pour la puce en commençant par la solution de précurseur de silicate hydrolysé. Mélanger 14 ml de tétraéthylorthosilicate (TEOS) avec 17 ml d'éthanol, 6,5 mL d'eau déminéralisée et de 0,5 mL de HCl 6M sous forte agitation (1200 tours par minute) en utilisant une plaque chauffante remuer. Chauffer cette solution à 80 ° C pendant 2 heures, en maintenant l'agitation constante.
2. Préparer des solutions de polymères en ajoutant l'souhaitée tri-bloc coploymer (pluronic F127, L121 et P123) à 10 ml d'éthanol à température ambiante sous forte agitation. Compléter le mélange en ajoutant 7,5 ml de la solution de silicate (provenant de l'étape 1.1) dans la solution de copolymère tri-séquencé suivie par 2 heures de forte agitation à température ambiante. Cela représente la solution de revêtement final.
3. Appliquer une ml de solution de revêtement à une tranche de silicium 4 pouces par centrifugation à une vitesse de 1500 tours par minute pendant 20 secondes. Puis chauffer à 80 ° C pendant 12 heures.
4. Chauffer les films de supprimer su organiquerfactant en élevant la température de 1 ° C par minute à 425 ° C, puis cuire au four pendant 5 heures.
5. Pré-traiter la surface de la silice mésoporeuse puce (MPS) avec l'oxygène de plasma incinération (Plasma Asher - Mars Plasma System). (Taux de O Flow _2: 80 sccm, puissance: 300 W, temps: 10 minutes).
6. Facultatif modification chimique de surface: puces silanate dans organosilane 3% dans un mélange méthanol: eau DI (19:1) solution pendant 72 heures à température ambiante dans un mélange N ₂ boîte à gants. Rincer successivement avec du méthanol et de l'eau DI. Cure puces à 110 ° C pendant 15 minutes dans un four à chaleur tournante à commande.

2. Exemple de pré-traitement

1. Ajouter TFA et ACN à chaque échantillon de sérum de telle sorte que les concentrations finales sont TFA 0,01% et 5% ACN. Vortex pour mélanger.
2. Agiter ces échantillons sur une table de vortex agitateur à température ambiante pendant 30 minutes.

3. Fractionnement du sérum

1. Pré-cuire puces pendant la nuit dans un four à 160 ° C. Alternativement, le stockagee les jetons dans un dessiccateur jusqu'au moment de servir pour éviter l'hydratation de la surface de l'eau dans l'air ambiant.
2. Utilisation de l'air comprimé à dépoussiérer les particules pouvant se trouver sur la surface de la puce.
3. Couper préfabriqué, acheté CultureWell chambré lamelle d'inclure le nombre souhaité de puits. Lamelle propre avec de l'éthanol à 100%, puis les placer sur la surface de la puce MPS. Appuyez sur le bas lamelle avec une pince pour assurer une étanchéité complète à puce.
4. Introduire à la pipette 10 uL d'échantillon de sérum dans chaque puits 3 mm. Incuber pendant 30 minutes dans une chambre humide à température ambiante.
5. Introduire à la pipette de sérum jusqu'à de puits et de les jeter. Introduire à la pipette 10 uL d'eau déminéralisée à chaque puits pour se laver de plus grosses protéines. Répétez 4 fois.
6. Prélever 5 pi de tampon d'élution (0,1% de TFA + 50% ACN) à chaque échantillon. Pipeter de haut en bas de 30 fois tout en se déplaçant autour de la pointe de pipette dans le puits pour mélanger le tampon d'élution. (À appliquer uniquement tampon d'élution à 1-2 échantillons à la fois pour prévenir tampon d'élutionde s'évaporer aussi rapidement).
7. Après le mélange, pipeter tout le tampon d'élution et placer dans un microtube avant d'être prêt à effectuer l'analyse MALDI-TOF.
8. Afin d'imiter la complexité d'un échantillon biologique et d'évaluer l'effet d'enrichissement dans la récolte espèces de faible poids moléculaire avec notre système de fractionnement sur puce, nous avons choisi et assemblé un mélange standard de protéines et de peptides de comptage vingt-six espèces différentes avec un large gamme de poids moléculaires (900-66 500 Da) et IP (4.0 à 10.2) et des concentrations de 0,5 à 8 (pmol / ul) (voir la liste des protéines dans le tableau 1).

4. MALDI-TOF analyse des peptides

1. Spot de 0,5 ul de l'échantillon à la plaque cible MALDI et laisser sécher.
2. Spot 0,5 matrice pi (α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD), 5 g / L) ou une solution saturée d'acide trans-3 ,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamique (SA) dans de l'acétonitrile contenant 50% et du TFA 0,1% permettent de co-cristallisation.
3. Spot de 0,5 pi de solution d'étalonnage à chaque tache d'étalonnage et laisser sécher.
4. Insérez la plaque cible en spectromètre de masse MALDI-TOF. La machine doit être configurée en mode réflecteur positive avec une intensité laser de 4200 et 3000 coups par échantillon. La gamme de masse choisie devrait être de 800 à 5000 Da avec une masse de la cible de 2000 Da.
5. Effectuer la même analyse MALDI-TOF en mode linéaire, mais changer la gamme de masse de 900 à 10.000 Da ou 3000 à 70.000 Da et une masse de la cible de 5000 Da.

5. Analyse des données

1. Les spectres brut ont été traitées avec le logiciel ConvertPeakList et les données ont été exportées vers un logiciel de prétraitement SpecAlign. Tous les spectres ont été alignées en utilisant la méthode de corrélation PAFFT et les intensités ont été normalisées à courant ionique total (CIT) dans chaque spectre correspondant. Tous les spectres ont été lissés et débruitées avec un facteur de 4 et 0,5, respectivement. Les pics ont été détectés avec une base de référence de 0,5 fenêtre de masse, du 21 et la hauteurratio de 1,5, les valeurs négatives ont été retirés avant l'analyse.
2. Classification hiérarchique a été réalisée en utilisant Cluster 3.0 et visualisées avec le logiciel Mapletree. Spectrométrie de masse MALDI données (m / z intensités des pics) est une transformation logarithmique, normalisée, et centré médiane. Corrélation de Pearson a été utilisée pour calculer la distance entre les échantillons, et le regroupement de liaison complète a été effectuée.
3. Un étudiant indépendant t-test a été utilisé pour la comparaison entre les groupes (n = 2 groupes) pour chaque pic détecté MS avant l'analyse classification non supervisée hiérarchique. Une P-value de 0,02 ou moins est considérée comme significative pour sélectionner des peptides et des protéines différentiellement récoltés parmi les différentes puces protéomiques mésoporeux (grands pores vs petits pores).

6. Les résultats représentatifs

Comme le montre la figure 1, dans cette étude, nous avons fabriqué une série de films minces de silice mésoporeuse avec une variété de nanotextures et exhaustive exploré lautilisation sélective dans ir figure capture et l'enrichissement de peptides et de protéines LMW à partir de sérum humain. 2a et b représentent les spectres MS de l'échantillon non traité sérum pour des peptides dans la plage de 900 à 10 000 Da et pour des protéines dans la gamme de 3000 ~ 70000 Da, respectivement . Ces spectres illustrer la suppression du signal dans la région LMW en raison de la présence de puits ionisé, hautement abondante, de poids moléculaire élevé (HMW) des protéines telles que l'albumine. Figure 2c et d représentent les spectres MS de l'échantillon de sérum après fractionnement par le L121 MPS (taille de pores, 6 nm). La majorité des grosses molécules ont été épuisés, ce qui entraîne un enrichissement significatif des composants LMW. Comme un contrôle, le même échantillon de sérum a été appliqué sur une surface non poreuse de la silice pure à évaluer la spécificité des films minces MPS pour la récupération LMWP. Comme on peut le voir dans la figure 2e et f, il n'y avait pas de récolte importante de pepmarées ou des protéines de la silice non poreuse. Ainsi, il peut être conclu que c'était l'architecture mésoporeux et non l'affinité surface de la silice, qui constitue le facteur prédominant dans l'enrichissement de LMWP.

Des variations contrôlées avec précision dans la taille des pores peut être obtenue par l'utilisation de copolymères avec différentes longueurs de bloc hydrophobes. En utilisant les protéines et conçus mélange des peptides, l'effet de la taille des pores sur le peptide LMW et l'efficacité de récupération des protéines a été étudié à l'aide MPS films minces préparées à partir de quatre agents tensioactifs Pluronic (F127, P123, L121, L121 et plus l'agent de gonflement) avec différents rapports de volumes des composants hydrophiles et hydrophobes pour former des tailles de pores de 3,7 nm, 5.2, 7.4 nm nm, et de 9,0 nm, respectivement. Cette gamme de tailles de pores conduit à la reprise d'un répertoire différent des peptides et des protéines à partir du même échantillon de sérum par la taille et l'exclusion forme (figure 3). Les spectres de protéines à haut poids moléculaire demonstrate l'échelle moléculaire de coupure de chaque type de puce. En plus de la déplétion dépendant de la taille des protéines HMW, le fractionnement sur puce de la solution normes affiche un différentiel et l'enrichissement sélectif d'espèces LMW associés à des tailles de pores. Le regroupement dans les deux sens hiérarchique présenté dans la figure 3b montre le motif d'enrichissement LMW normes obtenu avec le MSC différent. Même si tous les peptides sont en dessous de la moléculaire de coupure des puces, il existe une corrélation positive entre la taille des pores et le poids moléculaire des espèces piégées. Le MSC avec des pores dilatés, jusqu'à 9 nm, de préférence récolter plus grands peptides, tandis que les petits peptides sont récupérés de manière plus efficace par les puces avec des pores plus petits. La transformation structurelle de l'arrangement mésoporeux a été réalisée en ajustant la concentration du polymère modèle. Augmentation de la concentration du polymère matrice permet une courbure réduite interfaciale entre les phasesde l'eau, le copolymère, et le silicate de, par conséquent l'ouverture de la progression d'un interdépendants sphérique à une structure cylindrique. Pluronic F127, avec son poids moléculaire élevé, possède ce degré élevé de la périodicité structurelle. En augmentant la concentration de F127 dans la solution de départ, différents nanostructures MPS couches minces périodiques peuvent être obtenus auprès de nanostructure 3D à nanostructure 2D. Les cubes en 3D et en nid d'abeille nanostructures hexagonales, possédant l'interconnectivité nanopore plus désirable et la morphologie nanopore plus accessible, présentent des performances supérieures dans sélectivement enrichir peptides LMW que la structure hexagonale 2D, même si elles partagent les mêmes distributions de taille des pores et l'moléculaires même seuil pour le sérum fractionnement (figure 4). Nous avons également rationalisé la conjugaison de composés organo-silane sur des puces MPS en introduisant un plasma d'oxygène incinération de prétraiter la surface de la puce. Pour étudier l'effet qualitatif électrostatique sur selective sur puce d'enrichissement, nous utilisons les protéines et les peptides mélange. L'analyse de la solution MS protéomique normes fractionné sur des puces MPS préparés avec L121 et conjuguée avec les groupes chimiques fonctionnels est présenté dans la Figure 5. Le chargé positivement et négativement chargé des peptides et des protéines LMW sont capturés sur le anionique et les puces cationiques respectivement. La comparaison quantitative des puces MPS multiples pour récupérer les peptides avec une charge nette positive est affiché sur la figure 5a. Les puces avec une charge négative et les puces sans aucune modification (avec une charge négative mineure à l'origine) présentent un enrichissement significativement plus élevé pour ces peptides que les puces modifiées avec APTES (-NH _2). A l'inverse, les puces chargées positivement MPS possèdent une capacité exceptionnelle pour récupérer ces peptides avec une charge nette négative, comme l'a démontré sur la figure 5b. Alors α-endorphine ne montre pas un changement significatif due à son PI autour de 6.

Figure 1. Principe de MPS puces fractionnement et l'enrichissement LMW. Après l'échantillon de taches sur la surface, des protéines et des peptides LMW sont piégés dans les pores tout en les espèces plus grandes reste en dehors des pores et sont enlevés au cours des étapes de lavage. Les fractions enrichies sont ensuite élués et analysés par MALDI.

Figure 2. L'enrichissement Peptide utilisant les puces de silice mésoporeux à couches minces. MALDI profils MS à la fois dans la gamme de faible masse (900 à 10 000 Da) et la plage de masse élevée (3000 à 70 000 Da) avant (a, b) et après (c, d) le traitement du sérum sur des films minces de silice mésoporeuses ( L121, 6 nm). La reprise moléculaire est significativement réduite lors de l'utilisation des surfaces de silice vierges non poreuses (e, f).

Figure 3. Moléculaire enrichissement de coupure et dépendant de la taille des copeaux MPS. (A) vue agrandie des spectres MALDI démontrer la caractéristique moléculaire de coupure de chaque puces MPS en corrélation avec la taille des pores. (B) le regroupement de deux de manière hiérarchique des fonctions de mixage peptidiques entre les différentes puces. L'intensité de la couleur rouge ou jaune indique la concentration en peptide parent. Pores plus grands renforcée la récolte des grandes peptides (3600 à 8500 Da), tandis que les petits peptides (de 900 à 3500 Da) sont préférentiellement récupéré à partir des puces avec des pores plus petits.

Figure 4. Caractérisations physiques de films minces MPS et la récupération sélective avec différentes nanostructures. Modèles XRD a, b, c), TEM (encart a, b, c), le Pluronic F127 à des concentrations différentes dans la solution de précurseur: 4,0 ×10 ^-3 M (a), 6,0 × 10 ^-3 M (b), et 8,0 × 10 ^-2 M (c). Graphique à barres (d) de l'intensité de la détection illustrant la récupération sélective des peptides sur 3D et 3D cubes hexagonaux F127 puces protéomiques (CUB et Hex, respectivement). Les différentes modifications structurelles présenter un enrichissement sélectif.

Figure 5. Charge spécifique de récupération pour les puces avec des fonctions de surface différentes. Graphique à barres de l'intensité de la sclérose en plaques de détection de peptides sélectivement capturés sur les puces fonctionnalisés. En fonction de leur point isoélectrique, les peptides sont chargés positivement ou négativement à un pH de 7,0. (A) peptides positifs ((1) des-Arg1-bradykinine, (2) bradykinine, (3) la substance P-amide, (4) Neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) sont spécifiquement enrichi sur la charge négative survisages. (B) peptides négatifs ((7) Glu1-fibrinopeptide B, 8) α-endorphine, (9) d'insuline ACTH (18-39), (10), (11) EGF, (12) analogue à l'insuline GFII) sont spécifiquement enrichi sur les surfaces chargées positivement.

Figure 6. Sur puce de stabilisation de sérum fractionné. (A) représentant profils MALDI des peptides et des protéines éluées LMW immédiatement après fractionnement du sérum (en haut) ou après 3 semaines de sur-puce de stockage à température ambiante (en bas). (B) De haut en bas: une analyse de régression linéaire des intensités moyennes de pics détectés MS dans chaque répétition par rapport à 1 pour répliquer fraîchement fractionné le sérum et le sérum après fractionnée puces MPS de stockage à température ambiante 3wk. L'équation, CV et le coefficient de détermination (R ²⁾ sont indiqués.

Discussion

Les preuves s'accumulent que le faible poids moléculaire région du protéome circulatoire est une riche source de biomarqueurs diagnostiques pour la détection précoce de la maladie. Dans cette technologie, nous avons présenté une série de puces de silice mésoporeux avec des tailles de pores différentes, les structures des pores et des modifications de manière sélective enrichir les peptides et les protéines de faible poids moléculaire. Pour évaluer la stabilité des protéines, les puces MPS ont été incubées avec du sérum humain, séché après le lavage, et stockés pour 3wk à température ambiante. Les patrons de protéines / peptides obtenus sont comparables à ceux de sérum fraîchement fractionné (Figure 6a), tel que confirmé par les résultats de l'analyse statistique a montré à la figure 6b. La variabilité des signaux de pointe mesurés par le CV moyen a été estimé à 12,7% pour le sérum brut et à 14,2% pour les échantillons fractionnés. Les variations marginales pourrait être due à la variabilité interne de l'instrument MALDI et a suggéré que l'on-chip de prétraitement et de stockage n'a pas induit de toute modification significative des profils protéiques MS. La même expérience a été réalisée sur silicium poreux non. Le sérum séché récupéré après un stockage sur une surface de silicium a été fractionné sur les puces MPS avant l'analyse MALDI. Le profil des pauvres MS obtenus ont démontré l'avantage de stabilisation de la surface mésoporeux. En analogie avec les mécanismes déjà postulés, nous émettons l'hypothèse que les espèces LMW piégés à l'intérieur des nanopores ont été préservés de la dégradation par l'exclusion de taille de protéases, ou par inhibition stérique de leur activité protéolytique dans l'espace confiné des nanopores. La méthode basée sur la puce MPS pourrait être un outil puissant dans le peptide et le profilage des protéines du complexe LMW étude des fluides biologiques. Les puces sont MPS peu coûteux à fabriquer et de permettre à la production de grande échelle pour atteindre le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons, fournissant des fonctionnalités avantageuses pour le dépistage et exploratoire biola découverte de marqueurs.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tetraethoxysilane	Sigma-Aldrich	131903	98%
Tournette	Brewer Science	Cee 200X
Plasma Asher	Nordson Mars	AP-600
Ellipsomètre spectroscopique	JA Woollam Co.	M-2000DI
MALDI-TOF	Applied Biosystems	Voyager-DE-STR
α-cyano-4-hydroxycinnamique	Sigma-Aldrich Co.	C8982	Matrice pour MALDI-TOF
trans-3 ,5-diméthoxy-4-hydroxyl'acide cinnamique	Sigma-Aldrich Co.	85429	Matrice pour MALDI-TOF
Incorporer la plaque chaude	Thermo Scientific	11-475-30Q
CultureWell chambré lamelle	Sigma-Aldrich	GBL103350	3 mm de diamètre. × profondeur de 1 mm, 3-10 ul, stérile
Pluronic F 127	BASF		PEO 106-70-PPO PEO 106
Pluronic L121	BASF		PEO 5-PPO 70-PEO 5
Pluronic P123	BASF		PEO 20-PPO 70-PEO 20