Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

Resumo

Nós desenvolvemos uma tecnologia baseada na película fina de sílica mesoporosa para a recuperação selectiva de proteínas de baixo peso molecular e peptídeos a partir de soro humano. As propriedades físico-químicas dos nossos chips mesoporosos foram afinado para proporcionar um controle substancial no enriquecimento de peptídeo e, conseqüentemente, o perfil do proteoma de soro para fins de diagnóstico.

Resumo

A identificação de biomarcadores em circulação tem um grande potencial para abordagens não invasivos no diagnóstico precoce e prognóstico, bem como para o monitoramento da eficácia terapêutica ^1-3. A circulação do proteoma de baixo peso molecular (LMWP), composto de pequenas proteínas lançam a partir de tecidos e células ou fragmentos peptídicos derivados da degradação proteolítica das proteínas maiores, tem sido associado com a condição patológica em pacientes e provavelmente reflecte o estado da doença de ^4,5. Apesar destas aplicações clínicas potenciais, o uso de espectrometria de massa (MS) para determinar o perfil da LMWP partir fluidos biológicos tem provado ser muito difícil devido à grande gama dinâmica de proteínas e de péptidos concentrações no soro. ⁶ Sem amostra pré-tratamento, algumas das proteínas mais abundantes altamente obscurecer a detecção de baixa abundância de espécies no soro / plasma. Actuais proteômica abordagens baseadas, tais como bidimensional em gel de poliacrilamida-elmétodos ectrophoresis (2D-PAGE) e proteómica espingarda são trabalho intensivo de transferência, de baixo e adequação oferta limitada para aplicações clínicas. ^7-9 Portanto, uma estratégia mais eficaz é necessário para isolar LMWP a partir de sangue e permitir que o rastreio de elevado de amostras clínicas .

Aqui, apresentamos uma maneira rápida, eficiente e confiável sistema de fracionamento multi-baseada em chips de sílica mesoporosa especificamente para enriquecer e LMWP. ^10,11 mesoporosos de sílica (MPS) filmes finos com características ajustáveis ​​em nanoescala foram fabricados usando o modelo de copolímero tribloco caminho . Usando modelos de polímero e concentrações diferentes de polímero na solução precursora, as distribuições de poros diferentes de tamanho de poro, estruturas, conectividade e propriedades de superfície foram determinados e aplicados para a recuperação selectiva de proteínas de baixa massa. A análise selectiva dos péptidos enriquecidas em subclasses diferentes de acordo com as suas propriedades físico-químicas vontade enHance a eficiência de recuperação e de detecção de espécies baixa abundância. Em combinação com espectrometria de massa e análise estatística, foi demonstrada a correlação entre as características Nanophase dos filmes de sílica mesoporosa finas ea especificidade e eficácia de colheita de baixa massa proteoma. Os resultados aqui apresentados revelam o potencial da tecnologia baseada em nanotecnologia para fornecer uma poderosa alternativa aos métodos convencionais para a colheita LMWP a partir de fluidos biológicos complexos. Devido à capacidade de ajustar as propriedades do material, a capacidade de produção de baixo custo, a simplicidade e rapidez da coleta de amostra, e os requisitos de amostra muito reduzida para a análise, este romance nanotecnologia irá impactar substancialmente o campo de pesquisa com biomarcadores de proteômica e proteômica clínica avaliação.

Protocolo

1. Fabricação de chips

1. Criar a solução de revestimento para o chip, começando com a solução precursora hidrolisado de silicato. Misturar 14 mL de tetraetilortossilicato (TEOS) com 17 mL de etanol, 6,5 mL de água desionizada e 0,5 mL de HCl 6M sob agitação forte (1200 rpm), utilizando uma agitação da placa quente. Aquecer esta solução a 80 ° C durante 2 horas, mantendo a agitação constante.
2. Prepare soluções poliméricas, adicionando o desejado tri-bloco coploymer (Pluronic F127, L121 e P123) e 10 mL de etanol à temperatura ambiente com agitação forte. Completa-se a mistura por adição de 7,5 ml da solução de silicato (do passo 1.1) para a solução de copolímero tri-bloco seguido por 2 horas de agitação forte à temperatura ambiente. Isto representa a solução de revestimento final.
3. Aplicar 1 mL de solução de revestimento para uma bolacha de silício de 4 polegadas por centrifugação de revestimento a uma taxa de 1500 rpm durante 20 segundos. Em seguida, o calor a 80 ° C durante 12 horas.
4. Aqueça os filmes para remover su orgânicarfactant através do aumento de temperatura de 1 ° C por minuto a 425 ° C e, em seguida cozer durante 5 horas.
5. Pré-tratamento da sílica mesoporosa superfície do chip (MPS) com o oxigênio plasma incineração (Plasma Asher - Março de Plasma System). (O Fluxo _2: 80 sccm, potência: 300 W, tempo: 10 minutos).
6. Modificação química da superfície opcional: chips silanate em organossilano 3% em uma mistura de metanol: água Dl (19:1) solução durante 72 horas à temperatura ambiente em uma caixa de luva N _2. Lavar sequencialmente com metanol e água desionizada. Curar fichas a 110 ° C durante 15 minutos num forno ventilador de accionamento manual.

2. Amostra pré-tratamento

1. Adicionar TFA e ACN para cada amostra de soro de tal forma que as concentrações finais estão TFA 0,01% e 5% ACN. Vórtice para misturar.
2. Agitar estas amostras sobre uma mesa de vórtice agitador à temperatura ambiente durante 30 minutos.

3. Fracionamento de soro

1. Pré-cozer fichas durante a noite num forno a 160 ° C. Alternativamente, store as fichas em um exsicador até estar pronto para usar para evitar a hidratação da superfície por água do ambiente ao ar.
2. Use ar comprimido a poeira de quaisquer partículas que podem estar sobre a superfície do chip.
3. Cortar pré-fabricado, comprado CultureWell câmaras lamela para incluir o número desejado de poços. Lamínula limpa com etanol 100% e depois coloque em MPS superfície do chip. Pressione lamela para baixo com uma pinça para assegurar uma vedação completa com chip.
4. Pipetar 10 de amostra de soro em cada 3 mm bem. Incubar durante 30 minutos numa câmara humidificada a temperatura ambiente.
5. Pipetar até soro de poços e descarte. Pipetar 10 de água desionizada a cada poço para lavar as proteínas maiores. Repita 4 vezes.
6. Pipetar 5 uL de tampão de eluição (0,1% TFA + 50% ACN) para cada poço de amostra. Pipetar cima e para baixo 30 vezes enquanto se move em torno da ponta da pipeta na bem para misturar o tampão de eluição. (Apenas aplicar tampão de eluição de 1-2 amostras de cada vez para evitar tampão de eluiçãoevapore tão rapidamente).
7. Após a mistura, pipetar todos tampão de eluição e colocar num tubo de microcentrífuga de até estar pronto para executar a análise MALDI-TOF.
8. A fim de imitar a complexidade de uma amostra biológica e para avaliar o efeito de enriquecimento na colheita espécies de baixo peso molecular, com o nosso sistema de fraccionamento no chip, foram selecionados e montados de uma mistura padrão de proteínas e péptidos de contagem 20 e seis espécies diferentes, com um amplo gama de pesos moleculares (900-66 500 Da) e PIS (4,0-10,2) e as concentrações de 0,5-8 pmol / uL) (ver a lista de proteína na Tabela 1).

4. MALDI-TOF Análise de Peptídeos

1. UL mancha 0,5 da amostra a MALDI placa de destino e deixa-se secar.
2. Matriz mancha 0,5 uL (α-ciano-4-hidroxicinâmico ácido (CHCA), 5 g / L) ou solução saturada de ácido trans-3 ,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico (SA), em acetonitrilo a 50% contendo TFA a 0,1% e permitir que a co-cristalização.
3. UL mancha 0,5 de solução de calibração para cada ponto de calibração e deixa-se secar.
4. Insira placa-alvo em MALDI-TOF espectrômetro de massa. A máquina deve ser definida para o modo refletor positivo com uma intensidade do laser de 4200 e 3000 tiros por amostra. O intervalo de massas seleccionado deve ser de 800-5000 Da, com uma massa alvo de 2000 Da.
5. Realizar análise de MALDI-TOF mesmo no modo linear, mas alterar o intervalo de massa de 900 a 10.000 Da ou 3000 para 70.000 Da e uma massa de 5000 Da alvo.

5. Análise de Dados

1. Os espectros-prima foram processadas com o software ConvertPeakList e os dados foram exportados para SpecAlign software para pré-processamento. Todos os espectros foram alinhadas utilizando o método de correlação PAFFT e intensidades foram normalizados para a corrente total de iões (TIC) em cada espectro correspondente. Todos os espectros foram suavizadas e de-propalado com o factor de 4 e 0,5, respectivamente. Picos foram detectados com uma linha de base de 0,5 janela de massa, de 21 e alturarácio 1,5, valores negativos foram removidos antes da análise.
2. Agrupamento hierárquico foi realizada utilizando Cluster 3,0 e visualizados com o software Mapletree. MALDI MS Dados (intensidades m / z de pico) foi log-transformada, normalizada e centrada mediana. A correlação de Pearson foi utilizada para calcular a distância entre as amostras, e agrupamento de ligação completa foi realizada.
3. Um estudante independente t-teste foi utilizado para a comparação entre os grupos (n = 2 grupos) para cada pico detectado MS antes da análise de agrupamentos sem supervisão hierárquica. A P-valor de 0,02 ou menor foi considerado significativo para selecionar peptídeos e proteínas diferencialmente colhidas entre os diferentes mesoporosos chips de proteômica (poros grandes contra pequenos poros).

6. Os resultados representativos

Como mostrado na Figura 1, no presente estudo, fabricada de uma série de películas finas de sílica mesoporosa com uma variedade de nanotextures e exaustivamente explorado oIR utilização em selectiva captura e enriquecer péptidos e proteínas LMW a partir de soro humano. Figura 2a e b mostram os espectros de MS da amostra não processada soro para péptidos na gama de 900 a 10.000 Da e para as proteínas na gama de 3.000 ~ 70.000 Da, respectivamente . Estes espectros ilustrar a supressão do sinal na região LMW devido à presença de bem ionizado, muito abundantes, de elevado peso molecular (HMW) proteínas tais como albumina. Figura 2c, d descrevem os espectros de MS da amostra de soro após fraccionamento pelo L121 MPS (tamanho de poro, 6 nm). A maioria das moléculas grandes têm sido esgotado, resultando em um enriquecimento significativo dos componentes LMW. Como controlo, a mesma amostra de soro foi aplicado sobre uma superfície de sílica não porosa puro para avaliar a especificidade dos filmes finos MPS para a recuperação LMWP. Como pode ser visto na Figura 2e e F, não houve colheita significativa de pepmarés ou proteínas a partir da sílica não porosa. Assim, pode concluir-se que era a arquitectura mesoporoso e não a afinidade superfície da sílica que constitui o factor predominam no enriquecimento de LMWP.

Variações controladas com precisão no tamanho dos poros pode ser alcançado através da utilização de copolímeros com diferentes comprimentos de bloco hidrofóbicas. Ao utilizar as proteínas destinadas e mistura péptidos, o efeito do tamanho de poro sobre o péptido LMW e eficácia de recuperação da proteína foi investigada usando MPS filmes finos preparados a partir de quatro surfactantes Pluronic (F127, P123, L121, L121 e mais agente de inchamento) com proporções diferentes de volume dos componentes hidrofílicos e hidrofóbicos para formar tamanhos de poros de 3,7 nm, 5,2 nm, 7,4 nm e 9,0 nm, respectivamente. Esta gama de tamanhos de poros levou à recuperação de um repertório diferente de peptídeos e proteínas partir da mesma amostra de soro através de tamanho e forma de exclusão (Figura 3). Os espectros de proteína em alto peso molecular demonstrate o molecular de corte de cada tipo de chip. Para além da depleção de tamanho-dependente de proteínas HMW, o fraccionamento em chip da solução padrões exibe um diferencial e um enriquecimento selectivo de espécies LMW associados com os tamanhos de poro. O agrupamento de duas vias hierárquico apresentado na Figura 3b mostra o padrão de LMW enriquecimento padrões obtidos com o MSC diferente. Mesmo que todos os péptidos são abaixo da molecular de corte das aparas, há uma correlação positiva entre os tamanhos de poro e do peso molecular das espécies capturados. O MSC com poros grandes, até 9 nm, preferencialmente colher péptidos maiores, enquanto os péptidos mais pequenos são recuperados mais eficientemente por as fichas com poros mais pequenos. A transformação estrutural do arranjo mesoporoso foi realizada por meio do ajuste da concentração do polímero de modelo. O aumento da concentração do polímero modelo resultou em uma curvatura reduzida interfacial entre as fasesda água, o copolímero, eo silicato, consequentemente iniciar a progressão interligados de uma forma esférica e com uma estrutura cilíndrica. Pluronic F127, com o seu elevado peso molecular, possui este elevado grau de periodicidade estrutural. Ao aumentar a concentração de F127 em iniciar solução, diferentes MPS nanoestruturas de película fina periódicas podem ser obtidos a partir nanoestrutura 3D para nanoestrutura 2D. Os 3D cúbicos e favo de mel nanoestruturas hexagonais, possuindo a interconexão nanopore mais desejável e morfologia nanopore mais acessíveis, que apresentam um desempenho superior em selectivamente enriquecendo péptidos LMW do que a estrutura hexagonal 2D, embora eles partilham semelhantes distribuições de tamanho de poro e da mesma moleculares de corte para soro fraccionamento (Figura 4). Nós também simplificado de conjugação a de organo-silano em chips de MPS através da introdução de plasma de oxigénio calcinação para pré-tratamento da superfície do chip. A fim de estudar o efeito qualitativamente electrostática sobre selective enriquecimento on-chip, usamos as proteínas e peptídeos mistura. A análise MS da solução padrões proteômica fraccionado em chips de MPS preparados com L121 e conjugado com os grupos químicos funcionais é apresentada na Figura 5. O carregada positivamente e carregado negativamente os péptidos e proteínas LMW são capturadas no aniónico e os chips catiónicos, respectivamente. A comparação quantitativa de múltiplos chips MPS na recuperação dos péptidos com carga positiva é apresentado na Figura 5a. As fichas com carga negativa e os chips, sem qualquer alteração (com uma carga menor negativo originalmente) exibem enriquecimento significativamente mais elevado para os péptidos do que as fichas modificados com APTES (-NH _2). Inversamente, as fichas carregados positivamente MPS possuir capacidade excepcional para recuperar os péptidos com carga negativa líquida, como demonstrado na Figura 5b. Enquanto α-endorfina não mostra uma mudança significativa due a sua PI em torno de 6.

Figura 1. Princípio da MPS fracionamento fichas e enriquecimento LMW. Depois de amostra manchas na superfície, as proteínas LMW e peptídeos são presos nos poros enquanto as espécies maiores permaneceram fora dos poros e são removidos durante os passos de lavagem. As fracções enriquecidas são então eluído e analisados ​​por MALDI.

Figura 2. Enriquecimento peptídica utilizando os mesoporosos sílica fichas de filme fino. Perfis de MALDI MS, tanto na gama de massa de baixa (900 a 10 000 Da) e da gama de massa de alta (3000 a 70 000 Da) antes (a, b) e depois (c, d) o tratamento de soro nos filmes de sílica mesoporosa finas ( L121, 6 nm). A recuperação molecular é significativamente reduzida quando se utiliza em branco superfícies não porosas de sílica (E, F).

Figura 3. Enriquecimento de corte e dependente do tamanho molecular dos chips de MPS. (A) vista ampliada dos espectros de MALDI demonstrando a característica molecular de corte de cada fichas MPS correlacionando para o tamanho dos poros. (B) agrupamento de duas vias hierárquica das características da mistura de peptídeos entre os chips diferentes. A intensidade da cor vermelho ou amarelo indica a concentração de péptido relativa. Poros maiores melhorada a colheita de péptidos maiores (3600-8500 Da), enquanto que os pequenos péptidos (900-3500 Da) foram preferencialmente recuperado a partir das fichas com poros mais pequenos.

Figura 4. Caracterizações físicas de filmes finos de MPS e recuperação seletiva com nanoestruturas diferentes. Padrões de XRD (a, b, c), TEM (inset a, b, c), Pluronic F127 em diferentes concentrações na solução precursora: 4,0 ×10 M ^-3 (a), 6,0 × 10 ^-3 M (b), e 8,0 × 10 ^-2 M (c). (D) Gráfico de barras da intensidade de detecção ilustrando a recuperação seletiva peptídeos em 3D cúbicos e hexagonais 3D F127 chips de proteômica (CUB e Hex, respectivamente). As diferentes modificações estruturais apresentar um enriquecimento selectivo.

Figura 5. Carga específica de recuperação para as fichas com funções de superfície diferentes. Gráfico de barras da intensidade MS de detecção de péptidos capturados selectivamente sobre as fichas funcionalizados. De acordo com o seu ponto iso-eléctrico, os péptidos são positivamente ou negativamente carregado a pH 7,0. (A) péptidos positivos ((1) des-Arg1-A bradicinina, (2) A bradicinina, (3) substância P-amida, (4) neurotensina, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) são especificamente enriquecido no sur carregado negativamentefaces. (B) péptidos negativos ((7) Glu1-fibrinopeptídeo B, (8) α-endorfina, (9) de insulina ACTH (18-39), (10), (11) EGF (12), semelhante à insulina GFII) são especificamente enriquecida nas superfícies carregadas positivamente.

Figura 6. On-chip de estabilização de soro fraccionado. (A) perfis representativos MALDI de péptidos e proteínas LMW eluída imediatamente após fraccionamento do soro (em cima) ou depois de 3 semanas de no chip de armazenamento à temperatura ambiente (inferior). (B) A partir de cima para baixo: análise de regressão linear das intensidades médios de picos detectados MS em cada repetição em comparação com replicar 1 para recém-fraccionado soro e fraccionado soro 3wk MPS após armazenamento fichas à temperatura ambiente. Equação, CV e coeficiente de determinação (R ²⁾ são indicados.

Discussão

Há evidências de que a região peso molecular baixo do proteoma circulatório é uma fonte rica de biomarcadores de diagnóstico para a detecção precoce da doença. Nesta tecnologia, apresentamos uma série de chips de sílica mesoporosa com diferentes tamanhos de poros, estruturas de poros e modificações para, seletivamente, enriquecem peptídeos e proteínas de baixo peso molecular. Para avaliar a estabilidade da proteína, as fichas de CPM foram incubadas com soro humano, secou-se, após lavagem, e armazenado para 3wk à temperatura ambiente. Os padrões de proteína / péptido obtidos foram comparáveis ​​com as de soro fresco fraccionado (Figura 6a), tal como confirmado pelos resultados da análise estatística mostrou na Figura 6b. A variabilidade dos sinais de pico medido pelo CV médio foi estimado em 12,7% para o soro bruto e em 14,2% para as amostras fraccionados. As variações marginais pode ser devido à variabilidade interna do instrumento MALDI e sugeriu que a Sn-chip pré-tratamento e armazenamento não induziu qualquer alteração significativa dos perfis de proteínas de esclerose múltipla. A mesma experiência foi realizada em silício poroso não. O soro secas recuperado após o armazenamento na superfície de silício foi fraccionado sobre os chips MPS antes da análise MALDI. O pobre perfil MS obtidos demonstraram a vantagem de estabilização da superfície mesoporoso. Em analogia com mecanismos anteriormente postuladas, se a hipótese que as espécies LMW presos no interior das nanoporos foram conservadas da degradação através da exclusão de tamanho de proteases, ou por inibição estérico da sua actividade proteolítica no espaço confinado dos nanoporos. O método baseado em chip de MPS pode ser uma poderosa ferramenta para o peptídeo e proteína LMW perfil do complexo estudo fluidos biológicos. Os chips MPS são barato de fabricar e permitir a produção ampliados para atingir o processamento simultâneo de um grande número de amostras, proporcionando características vantajosas para exploratório de rastreio e biomarcador descoberta.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Tetraetoxisilano	Sigma-Aldrich	131903	98%
Giro coater	Brewer Ciência	Cee 200X
Plasma Asher	Nordson março	AP-600
Elipsometria espectroscópica	JA Woollam Co.	M-2000DI
MALDI-TOF	Applied Biosystems	Voyager-DE-STR
α-ciano-4-hidroxicinâmico ácido	Sigma-Aldrich Co.	C8982	Matriz de MALDI-TOF
trans-3 ,5-dimetoxi-4-hidroxiácido cinâmico	Sigma-Aldrich Co.	85429	Matriz de MALDI-TOF
Mexa chapa quente	Thermo Scientific	11-475-30Q
CultureWell câmaras lamela	Sigma-Aldrich	GBL103350	3 mm de diam. × profundidade de 1 mm, 3-10 uL, estéril
Pluronic F 127	BASF		PEO 106-PPO 70-PEO 106
Pluronic L121	BASF		PEO 5-PPO 70-PEO 5
Pluronic P123	BASF		PEO 20-PPO 70-PEO 20