Basso Peso Molecolare proteina di arricchimento sul film sottili di silice mesoporosi per la scoperta di biomarcatori

Riepilogo

Abbiamo sviluppato una tecnologia basata su pellicola sottile di silice mesoporosa per il recupero selettivo di proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi da siero umano. Le proprietà fisico-chimiche delle nostre chip mesoporosi stati finemente sintonizzato per fornire il controllo sostanziale arricchimento peptide e di conseguenza il profilo del proteoma siero per scopi diagnostici.

Abstract

L'identificazione di biomarcatori circolanti ha un grande potenziale per i non invasive nella diagnosi precoce e la prognosi, così come per il monitoraggio della efficacia terapeutica. ^1-3 La circolazione proteoma a basso peso molecolare (LMWP) composto di piccole proteine ​​versato dai tessuti e cellule o frammenti peptidici derivati ​​dalla degradazione proteolitica di proteine ​​più grandi, è stata associata con la condizione patologica in pazienti e probabilmente riflette lo stato di malattia. ^4,5 Nonostante questi potenziali applicazioni cliniche, l'uso di spettrometria di massa (MS) per analizzare la LMWP dal fluidi biologici ha dimostrato di essere molto difficile a causa della vasta gamma dinamica di concentrazioni di proteine ​​e peptidi nel siero. ⁶ senza pretrattamento dei campioni, alcune delle più proteine ​​altamente abbondanti oscurare la rivelazione di bassa abbondanza specie nel siero / plasma. Attuali approcci basati sulla proteomica, come ad esempio bidimensionale su gel di poliacrilammide-elmetodi ectrophoresis (2D-PAGE) e proteomica shotgun sono alta intensità di manodopera, bassa produttività e l'idoneità dell'offerta limitata per le applicazioni cliniche. ^7-9 Pertanto, una strategia più efficace è necessaria per isolare LMWP dal sangue e consentire lo screening ad alta produttività di campioni clinici .

Qui vi presentiamo un veloce, efficiente ed affidabile multi-frazionamento sistema basato su chip di silice mesoporosi di indirizzare in modo specifico e arricchire LMWP. ^10,11 mesoporosi silice (MPS), film sottili con caratteristiche sintonizzabili su scala nanometrica sono stati realizzati utilizzando il copolimero a tre blocchi via template . Uso di modelli diversi e concentrazioni di polimero nella soluzione di polimero precursore, diverse distribuzioni di grandezza dei pori, strutture dei pori, connettività e proprietà superficiali sono state determinate ed applicati per il recupero selettivo di proteine ​​bassa massa. L'analisi selettiva dei peptidi arricchito in sottoclassi differenti a seconda delle loro proprietà fisico-chimiche saranno enHance l'efficienza di recupero e l'identificazione di specie poco abbondanti. In combinazione con spettrometria di massa e analisi statistica, abbiamo dimostrato la correlazione tra le caratteristiche nanofasici dei film sottili di silice mesoporosi e la specificità e l'efficacia di raccolta bassa massa proteoma. I risultati qui presentati rivelano il potenziale della nanotecnologia basata su tecnologia per fornire una valida alternativa ai metodi convenzionali per la raccolta LMWP da fluidi biologici complessi. A causa della possibilità di regolare le proprietà del materiale, la capacità di produzione a basso costo, la semplicità e rapidità di raccolta dei campioni, ed i requisiti del campione notevolmente ridotti per l'analisi, questo romanzo la nanotecnologia sarà sostanzialmente un impatto nel campo della ricerca biomarker proteomica e proteomica clinica valutazione.

Protocollo

1. Chip Fabrication

1. Creare la soluzione di rivestimento per il chip iniziando con la soluzione idrolizzata precursore di silicato. Mescolare 14 mL di tetraetilortosilicato (TEOS) con 17 mL di etanolo, 6,5 ml di acqua deionizzata e 0,5 mL di HCl 6M sotto forte agitazione (1200 giri al minuto) utilizzando uno agitare piastra calda. Riscaldare questa soluzione a 80 ° C per 2 ore, mantenendo la costante agitazione.
2. Preparare soluzioni di polimeri aggiungendo il desiderato triblocco coploymer (Pluronic F127, L121 e P123) in 10 mL di etanolo a temperatura ambiente sotto energica agitazione. Completa la miscela aggiungendo 7,5 ml della soluzione di silicato (dal punto 1.1) nel tri-blocco di soluzione di copolimero seguito da 2 ore di agitazione a temperatura ambiente. Questa rappresenta la soluzione di rivestimento finale.
3. Applicare 1 mL di soluzione di rivestimento ad un wafer di silicio da 4 pollici spin-coating ad una velocità di 1500 rpm per 20 secondi. Poi calore a 80 ° C per 12 ore.
4. Scaldare i film da rimuovere su organicirfactant aumentando temperatura di 1 ° C al minuto fino a 425 ° C, e poi cuocere per 5 ore.
5. Pretrattare il mesoporosa silice (MPS) superficie del chip con l'ossigeno incenerimento plasma (Plasma Asher - marzo Plasma System). (O ₂ Portata: 80 SCCM, potenza: 300 W, tempo: 10 minuti).
6. Opzionale modificazione chimica della superficie: i chip a 3% silanizzata organosilano in un Metanolo: acqua deionizzata (19:01) la soluzione per 72 ore a temperatura ambiente in una scatola di guanti ₂ N. Sciacquare sequenziale con metanolo e acqua deionizzata. Cure chip a 110 ° C per 15 minuti in un ventilatore azionato forno.

2. Pretrattamento dei campioni

1. Aggiungere TFA e ACN per ciascun campione di siero tale che le concentrazioni finali sono 0,01% TFA e il 5% ACN. Vortex per mescolare.
2. Agitare questi campioni su un tavolo vortice agitatore a temperatura ambiente per 30 minuti.

3. Frazionamento Siero

1. Pre-bake chip per tutta la notte in un forno a 160 ° C. In alternativa, store i chip in un essiccatore fino al momento dell'uso per impedire l'idratazione della superficie con acqua ambiente in aria.
2. Utilizzare aria compressa per rispolverare eventuali particelle che possono essere sulla superficie del chip.
3. Tagliare prefabbricati, acquistati CultureWell chambered coverglass per includere il numero desiderato di pozzi. Coprioggetti pulito con etanolo al 100% e poi metterlo su una superficie chip di MPS. Premere coverglass verso il basso con una pinza per garantire una tenuta completa di chip.
4. Pipettare 10 microlitri di campione di siero in ogni mm 3 bene. Incubare per 30 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente.
5. Pipettare il siero di pozzi e scartare. Pipettare 10 L di acqua deionizzata a ciascun pozzetto per lavare via proteine ​​più grandi. Ripetere 4 volte.
6. Pipettare 5 tampone di eluizione microlitri (0,1% TFA + 50% ACN) in ciascun pozzetto. Pipettare su e giù per 30 volte mentre si muove la punta della pipetta in giro per il bene mescolare il tampone di eluizione. (Applicare solo tampone di eluizione per 1-2 i campioni in un momento per evitare tampone di eluizionel'evaporazione così in fretta).
7. Dopo la miscelazione, pipettare tutti i buffer di eluizione e posto in una provetta da microcentrifuga fino al momento di effettuare l'analisi MALDI-TOF.
8. Al fine di emulare la complessità di un campione biologico e di valutare l'effetto di arricchimento per la raccolta di specie a basso peso molecolare con il nostro sistema on-chip frazionamento, abbiamo selezionato e assemblato una miscela standard di proteine ​​e peptidi conteggio specie diverse ventisei con un ampio gamma di pesi molecolari (900-66 500 Da) e inibitori della proteasi (4,0-10,2) e concentrazioni (0,5-8 pmol / pl) (vedi lista delle proteine ​​nella Tabella 1).

4. MALDI-TOF analisi dei peptidi

1. Spot 0,5 microlitri di campione di destinazione piastra MALDI e lasciare asciugare.
2. Spot matrice 0,5 pl (α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA), 5 g / L) o soluzione satura di acido trans-3 ,5-dimetossi-4-idrossicinnamico (SA) in 50% acetonitrile contenente 0,1% TFA e consentono di co-cristallizzazione.
3. Spot 0,5 ml di soluzione di calibrazione per ogni punto di taratura e lasciare asciugare.
4. Inserire la piastra di destinazione in MALDI-TOF spettrometro di massa. La macchina deve essere impostato sulla modalità riflettore positivo, con un intensità del laser di 4200 e 3000 colpi al campione. La gamma di massa dovrebbe essere selezionato 800-5000 Da una massa di 2000 Da bersaglio.
5. Eseguire la stessa analisi MALDI-TOF in modalità lineare, ma modificare l'intervallo di massa a 900 a 10.000 Da o 3000 a 70.000 Da e una massa di 5000 Da bersaglio.

5. Analisi dei dati

1. Gli spettri raw sono stati elaborati con il software ConvertPeakList ed i dati sono stati esportati in SpecAlign software per la pre-elaborazione. Tutti gli spettri sono stati allineati con il metodo PAFFT correlazione e intensità sono stati normalizzati in corrente ionica totale (TIC) in ogni spettro corrispondente. Tutti gli spettri sono state levigate e de-divulgata con fattore di 4 e 0,5 rispettivamente. Picchi sono stati rilevati con una base di 0,5, finestra di massa 21 e altezzarapporto 1,5, valori negativi sono stati rimossi prima dell'analisi.
2. Clustering gerarchico è stata effettuata utilizzando Cluster 3.0 e visualizzati con il software MapleTree. MALDI MS dati (m / z potenze di picco) è stato il log-trasformato, normalizzato, e centrato mediana. Pearson correlazione è stato utilizzato per calcolare la distanza tra i campioni, e raggruppamento linkage completa è stata eseguita.
3. Un Student indipendente t-test è stato utilizzato per il confronto tra i gruppi (n = 2 gruppi) per ciascun picco rilevato MS prima unsupervised analisi clustering gerarchico. Un P-value di 0.02 o inferiore è stata considerata significativa per selezionare peptidi e proteine ​​differenzialmente raccolte tra i diversi chip mesoporosi proteomica (pori dilatati vs piccoli pori).

6. Risultati rappresentativi

Come mostrato in figura 1, in questo studio abbiamo fabbricato una serie di film sottili di silice mesoporosi con una varietà di nanotextures ed esaurientemente esplorato l'uso ir in Figura 2a selettiva cattura e arricchimento LMW peptidi e proteine ​​da siero umano. e B mostrano gli spettri MS del campione non trasformate siero per peptidi nell'intervallo di 900 a 10.000 Da e per le proteine ​​nell'intervallo 3.000 ~ 70.000 Da rispettivamente . Questi spettri illustrano la soppressione segnale nella regione LMW dovuta alla presenza di ben ionizzato, molto abbondanti, ad alto peso molecolare (HMW), proteine ​​come albumina. Figura 2c e d rappresentano gli spettri MS del campione di siero dopo frazionamento dal L121 MPS (dimensione dei pori, 6 nm). La maggior parte delle molecole grandi sono stati esauriti, con conseguente arricchimento significativa dei componenti LMW. Come controllo, lo stesso campione di siero è stato applicato su una superficie porosa silice pura per valutare la specificità di film sottili per il recupero MPS LMWP. Come si può vedere in figura 2e e f, non vi era alcuna significativa raccolta di pepmaree o proteine ​​dalla silice non poroso. Così si può concludere che fosse l'architettura mesoporosa e non l'affinità superficie della silice che costituisce il fattore predominante per l'arricchimento di LMWP.

Proprio controllati variazioni nelle dimensioni dei pori può essere realizzato attraverso l'uso di copolimeri con differenti lunghezze blocco idrofobo. Utilizzando le proteine ​​progettati e miscela peptidi, l'effetto della dimensione dei pori sulla peptide LMW e recupero efficacia proteina è stata studiata utilizzando MPS sottili pellicole preparate da quattro tensioattivi (Pluronic F127, P123, L121, L121 e più agente rigonfiante) con rapporti volumetrici differenti dei componenti idrofili e idrofobi per formare dimensioni dei pori 3.7 nm, 5.2 nm, 7,4 nm e 9,0 nm, rispettivamente. Questa gamma di dimensioni dei pori ha portato al recupero di un diverso repertorio di peptidi e proteine ​​dallo stesso campione di siero attraverso dimensioni e la forma di esclusione (Figura 3). Gli spettri proteina ad alto peso molecolare demonstrate molecolare cut-off di ciascun tipo di chip. Oltre alla dimensione-dipendente deplezione di proteine ​​HMW, l'on-chip frazionamento della soluzione standard mostra un differenziale e arricchimento selettivo di specie LMW associati con le dimensioni dei pori. Il raggruppamento bidirezionale gerarchico presentato nella figura 3b mostra l'arricchimento LMW standard modello ottenuto con il MSC differenti. Anche se tutti i peptidi sono al di sotto del cut-off molecolare dei chip, vi è una correlazione positiva tra le dimensioni dei pori e il peso molecolare della specie intrappolati. Il MSC e con pori dilatati, fino a 9 nm, preferenzialmente raccogliere grandi peptidi, mentre quelli più piccoli peptidi vengono recuperati in modo più efficiente i chip con i più piccoli pori. La trasformazione strutturale del dispositivo mesoporoso è stata effettuata regolando la concentrazione del polimero modello. Aumentando la concentrazione del polimero modello determinato una curvatura ridotto interfacciale tra le fasidell'acqua, il copolimero, il silicato e, conseguentemente avviare la progressione interconnessi da un sferico ad una struttura cilindrica. Pluronic F127, con il suo alto peso molecolare, possiede questo alto grado di periodicità strutturale. Aumentando la concentrazione di F127 in soluzione di partenza, diverse nanostrutture a film sottile MPS periodiche possono essere ottenuti da nanostruttura 3D nanostruttura 2D. Le nanostrutture 3D cubi a testa esagonale a nido d'ape, in possesso di interconnettività nanoporo più desiderabile e la morfologia nanoporo più accessibile, mostrano prestazioni superiori in modo selettivo arricchire peptidi LMW che la struttura 2D esagonale, anche se condividono simili distribuzioni di dimensione dei pori e la molecolari stesso cut-off per il siero frazionamento (Figura 4). Abbiamo anche semplificato la coniugazione di composti organo-silano su chip MPS con l'introduzione di plasma di ossigeno incenerimento per pretrattare la superficie del chip. Per studiare qualitativamente l'effetto elettrostatico sulla selezioneive on-chip di arricchimento, usiamo le proteine ​​e peptidi miscela. L'analisi MS di soluzione standard di proteomica frazionati su chip MPS preparati con L121 e coniugate con i gruppi chimici funzionali è presentato in Figura 5. La carica positiva e caricati negativamente i peptidi e proteine ​​LMW vengono catturati sulla anionici e cationici, rispettivamente, i chip. Il confronto quantitativo di molteplici chip MPS nel recupero dei peptidi con carica positiva netta viene visualizzato in figura 5a. I chip con carica negativa e le chips senza alcuna modifica (con una minore carica negativa in origine) mostrano un arricchimento notevolmente più elevato per quei peptidi che i chip modificati con APTES (-NH _2). Al contrario, i chip di carica positiva MPS possiede eccezionali capacità di recuperare tali peptidi con carica netta negativa, come mostrato nella figura 5b. Mentre α-Endorphin non mostra significativi cambiamenti due la sua PI circa 6.

Figura 1. Principio di frazionamento MPS chip e arricchimento LMW. Dopo campione macchie sulla superficie, LMW proteine ​​e peptidi sono intrappolati nei pori, mentre le specie più grandi rimasti fuori dei pori e vengono rimossi durante le fasi di lavaggio. Le frazioni arricchite vengono poi eluita ed analizzata tramite MALDI.

Figura 2. Arricchimento peptide utilizzando i mesoporosi chip film sottile di silice. MALDI MS profili sia nella gamma bassa massa (900 a 10 000 Da) e l'intervallo di massa elevato (3000 a 70 000 Da) prima (a, b) e dopo (c, d) lavorazione del siero sui film sottili di silice mesoporosi ( L121, 6 nm). Il recupero molecolare è ridotto significativamente quando si utilizza silice bianco superfici porose (e, f).

Figura 3. Molecolare arricchimento cut-off e la dimensione-dipendente dei chip MPS. (A) Visualizzazione ingrandita della spettri MALDI dimostrando molecolare caratteristica di cut-off di ciascun chip MPS correlazione alla dimensione dei pori. (B) di clustering bidirezionale gerarchica delle caratteristiche mix peptidici tra i diversi chip. L'intensità del colore rosso o giallo indica la concentrazione relativa peptide. Grandi pori migliorato la raccolta di peptidi più grandi (3600-8500 Da), mentre i piccoli peptidi (900-3500 Da) sono stati recuperati preferenzialmente dai chip con pori più piccoli.

Figura 4. Caratterizzazioni fisiche di MPS film sottili e di recupero selettivo con diverse nanostrutture. Modelli di XRD (a, b, c), TEM (inserto a, b, c), Pluronic F127 a concentrazioni diverse in soluzione di precursore: 4,0 ×10 ^-3 M (a), 6,0 × 10 ^-3 M (b), e 8,0 × 10 ^-2 M (c). (D) Istogramma dell'intensità di rilevazione illustrare il recupero selettivo peptidi su cubi 3D e 3D esagonali F127 chip proteomica (Cub e Hex, rispettivamente). Le modifiche strutturali differenti presentano un arricchimento selettivo.

Figura 5. Charge-specifica di recupero per i chip con funzioni di superficie. Istogramma dell'intensità MS di rilevamento di peptidi selettivamente catturati sui chip funzionalizzati. Secondo il loro punto isoelettrico, i peptidi sono positivamente o caricato negativamente a pH 7,0. (A) peptidi positivi ((1)-des-Arg1 bradichinina, (2) bradichinina, (3) sostanza P-ammide, (4) neurotensina, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) sono specificamente arricchito sul carico negativamente surfacce. (B) peptidi (negativi (7) Glu1-fibrinopeptide B, (8) α-endorfina, (9) insulina ACTH (18-39), (10), (11) EGF, (12) insulino-simile GFII) sono in particolare arricchito sulle superfici con carica positiva.

Figura 6. On-Chip stabilizzazione di siero frazionato. (A) rappresentativi di profili MALDI LMW peptidi e proteine ​​eluite immediatamente dopo frazionamento siero (superiore) o dopo 3 settimane di on-chip stoccaggio a temperatura ambiente (inferiore). (B) Dall'alto in basso: analisi di regressione lineare di intensità media di rilevati picchi MS in ogni replica rispetto a 1 per replicare appena frazionato nel siero e frazionato siero dopo 3WK stoccaggio MPS chip a temperatura ambiente. Equazione, CV e il coefficiente di determinazione (R ²⁾ sono indicati.

Discussione

La prova sta montando che il basso peso molecolare regione del proteoma circolatorio è una ricca fonte di biomarker diagnostici per la diagnosi precoce della malattia. In questa tecnologia, abbiamo presentato una serie di chip di silice mesoporosi con dimensioni dei pori, strutture pori e modifiche per arricchire selettivamente peptidi e proteine ​​a basso peso molecolare. Per valutare la stabilità della proteina, i chip MPS sono state incubate con siero umano, essiccato dopo il lavaggio, e conservate per 3WK a temperatura ambiente. Le proteine ​​/ peptidi modelli ottenuti sono paragonabili a quelle di siero fresco frazionato (figura 6a), come confermato dai risultati dell'analisi statistica mostrato nella Figura 6b. La variabilità dei segnali di picco misurate dal CV medio è stato stimato a 12,7% di siero grezzo e al 14,2% per i campioni frazionati. Le variazioni marginali potrebbe essere dovuto alla variabilità interna dello strumento MALDI e suggerito che la on-chip pretrattamento e conservazione non ha indotto alcuna alterazione significativa dei profili proteici di MS. Lo stesso esperimento è stato eseguito su non silicio poroso. Il siero essiccato recuperato dopo stoccaggio su superficie di silicio è stato frazionato sui chip MPS prima analisi MALDI. Il profilo povero MS ottenuti hanno evidenziato il vantaggio stabilizzazione della superficie mesoporoso. In analogia con i meccanismi postulati precedentemente, si ipotizza che le specie LMW intrappolati all'interno dei nanopori sono stati conservati dal degrado attraverso l'esclusione dimensioni delle proteasi, o attraverso l'inibizione sterica della loro attività proteolitica nello spazio angusto dei nanopori. Il metodo basato su chip di MPS potrebbe essere un potente strumento per il peptide e la profilazione di proteine ​​LMW del complesso studio biologico fluidi. I chip MPS sono poco costosi da produrre e permettere la produzione di scalata fino a raggiungere la lavorazione simultanea di un gran numero di campioni, fornendo caratteristiche vantaggiose per esplorativo screening e biomarcatore scoperta.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Tetraetossisilano	Sigma-Aldrich	131903	98%
Spin coater	Brewer Science	Cee 200X
Plasma Asher	Nordson marzo	AP-600
Ellissometro spettroscopica	JA Woollam Co.	M-2000DI
MALDI-TOF	Applied Biosystems	Voyager-DE-STR
α-ciano-4-idrossicinnamico acido	Sigma-Aldrich Co.	C8982	Matrice per MALDI-TOF
trans-3 ,5-dimetossi-4-idrossiacido cinnamico	Sigma-Aldrich Co.	85429	Matrice per MALDI-TOF
Mescolare piastra calda	Thermo Scientific	11-475-30Q
CultureWell chambered coverglass	Sigma-Aldrich	GBL103350	3 millimetri diam. × 1 mm di profondità, 3-10 pl, sterile
Pluronic F 127	BASF		106 PEO-PPO-PEO 70 106
Pluronic L121	BASF		PEO 5-70-PPO PEO 5
Pluronic P123	BASF		20 PEO-PPO-PEO 70 20