Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Résumé

Visualisation des cellules individuelles dans les tissus densément emballés, comme les cellules de Schwann terminales (SC) à jonctions neuromusculaires (JNM), est un défi. "Sequential photo-blanchiment" permet la délimitation SC seul terminal, par exemple dans le muscle explant sterni triangularis, une pratique nerf-muscle préparation, où séquentiel de blanchiment peut être combiné avec le temps écoulé et d'imagerie Post-hoc Immunomarquages.

Résumé

Séquentielle photo-blanchiment constitue un moyen non invasif d'étiqueter SC individuels à la jonction neuromusculaire. Le MNJ est le plus grand des synapses du système nerveux des mammifères et a servi comme directeur de modèle pour étudier la structure et la fonction synaptique. Dans souris terminaux JNM axone moteur former des sites de contact bretzel comme avec des fibres musculaires. L'axone moteur et sa borne sont gainés par SC. Au cours des dernières décennies, plusieurs souris transgéniques ont été générés pour visualiser les neurones moteurs et de SC, par exemple Thy1-XFP ¹ et PLP-GFP souris ^2, respectivement.

Le long des axones moteurs, myélinisantes SC axonales sont disposées en se chevauchant pas noeuds, séparés par des nœuds de Ranvier, afin de permettre la propagation saltatoire potentiel d'action. En revanche, SC terminaux à la synapse sont spécialisés cellules gliales, qui surveiller et de promouvoir la neurotransmission, digérer les débris et les guides axones. JNM sont hermétique jusqu'à une demi-douzaine non myelnaires SC terminaux - ceux-ci, cependant, ne peuvent pas être résolus individuellement par microscopie optique, car ils sont en contact direct de la membrane ^3.

Plusieurs approches existent pour visualiser individuellement SC terminaux. Aucun d'entre eux sont impeccables, bien. Par exemple, le remplissage de colorant, où les cellules isolées sont empalé avec une micro-électrode de colorant remplie, nécessite détruire une cellule marqué avant de le remplir une seconde. Ce n'est pas compatible avec la suite enregistrements time-lapse ^3. Multi-spectrale "Brainbow" étiquetage des castes a été réalisé en utilisant l'expression combinatoire des protéines fluorescentes ^4. Cependant, cette technique nécessite la combinaison de plusieurs transgènes et est limitée par le profil d'expression des promoteurs utilisés. À l'avenir, l'expression de "photo-commutables" protéines dans SC pourrait être encore un autre ⁵ alternative. Ici, nous présentons photo-blanchiment séquentiel, où les cellules individuelles sont blanchis, et leur image obtenue par soustraction. Nous croyonsque cette approche - en raison de sa facilité et la polyvalence - représente un ajout à la palette de technologies durables de la neuroscientifique, en particulier car il peut être utilisé in vivo et transférés à d'autres types cellulaires, sites anatomiques ou des espèces ^6.

Dans le protocole suivant, nous détaillons l'application de la séquence de blanchiment et après confocale time-lapse de microscopie à SC terminaux dans des explants musculaires triangularis manubrium. Cette fine, superficielle et facilement disséquée préparation nerf-muscle ^7,8 s'est avéré utile pour les études de NMJ développement, la physiologie et la pathologie ^9. Enfin, nous expliquons comment le muscle triangularis manubrium est préparé après la fixation d'effectuer une corrélation à haute résolution imagerie confocale, immunohistochimie ou examens ultrastructuraux.

Protocole

1. Triangularis Sterni explantation (Figure 1)

Timing: 15 min.

1. Préparer les instruments chirurgicaux: 2 paires de pinces, 1 paire de ciseaux, 1 paire de ciseaux à ressort, 1 boîte de culture tissulaire (10 cm). Pré-bulles (minimum 15 min) refroidie (4 ° C) une solution de Ringer avec 5% de CO _2/95% O _2. Remplir 15 cm boîte de culture tissulaire avec de la glace et le couvrir avec une plaque métallique. Préparer microscope à dissection et placez le plat de 15 cm avec de la glace sous le coup de dissection afin de refroidir l'explant lors de la dissection.
2. Lethally anesthésier la souris par une surdose d'isoflurane (ou toute autre méthode approuvée du sacrifice). Vaporiser la souris avec de l'éthanol à 70% pour prévenir la contamination de la fourrure de l'explant. Pour le SC de blanchiment, nous avons utilisé des souris Plp-GFP, qui peuvent être croisées pour Thy1-OFP3 ou Thy1-Membow13 pour la visualisation simultanée de l'axone.
3. En utilisant la paire de grands ciseaux, faire une incision médiane dela peau de la poitrine et deux incisions parallèles à l'arête inférieure de la cage thoracique.
4. En utilisant la paire de grands ciseaux, enlever la peau, ouvrir la paroi abdominale, et faire des incisions parallèles à la cage thoracique tout le chemin du retour à la colonne vertébrale. Puis hors disséquer les muscles pectoraux en faisant des incisions à proximité de l'insertion du muscle au niveau du sternum.
5. Couper le diaphragme ouvert juste en dessous du cartilage xiphoïde et disséquer au large de la membrane le long de ses insertions costales.
6. De maintien de la cage thoracique par la pointe du sternum avec un ensemble de pinces, de commencer à couper les nervures de la colonne vertébrale, le plus près possible de leurs insertions. Les réductions de gauche et de droite devraient converger au-dessus du cœur vers le manubrium sternal. Essayez d'éviter de couper les vaisseaux sanguins majeurs (en particulier les veines sous-clavières). Meilleure visibilité est obtenue en soulevant doucement la préparation tout en maintenant sur le processus xiphoïde avec une pince.
7. Faites une coupe transversale juste au-dessous du manubrium sternalet transférer l'explant dans le plat de 10 cm avec 5% de CO refroidi _2/95% O _2-bulles solution de Ringer. Placer la capsule 10-cm sur la plaque métallique qui recouvre la cuvette 15-cm de culture de tissu rempli de glace. Toutes les autres étapes devraient se faire sous le microscope de dissection.
8. Avec des ciseaux petit ressort enlever les restes du thymus, de la plèvre, membrane (à l'intérieur) et les muscles pectoraux (en dehors; figure 1B-D).
9. Pour monter l'explant dans le plat de 3,5 cm, disséquer off toutes les nervures qui ne sont pas insérer au sternum. Le mieux est d'utiliser des ciseaux à ressort petites et couper le tissu entre les nervures (figure 1E).
10. Epingler la triangularis sterni nerf-muscle explant dans le Sylgard enduit de 3,5 cm boîte de culture tissulaire en utilisant des épingles minuties (raccourci à <4 mm; figure 1G). Deux broches doivent passer par cartilagineux (blanc) parties du sternum. Insérer au moins deux repères à travers les nervures à la fois sur le côté gauche et droit de la ièmee explant viser les parties molles cartilagineux et en évitant les nervures sous ou à proximité du muscle triangularis. Les broches sont plus utilisés, le mieux (nous utilisons habituellement 8-10). Comme vous coincer la préparation, assurez-vous que les nervures sont peu répandue, la fixation du muscle dans une position légèrement tendus.
11. En option: Visualisez les sites synaptiques contenant récepteurs de l'acétylcholine en ajoutant bungarotoxine couplé à des colorants Alexa (concentration de 0,8 pg / ml dans 5% de CO _2/95% O _2-bulles solution de Ringer). Incuber explant coincé dans Sylgard plat couché pendant 15-20 min à température ambiante puis laver plusieurs fois avec 5% de CO _2/95% O _2-bulles solution de Ringer.

2. SC blanchir et option Time-lapse de microscopie (figure 2)

Timing: 30 - 45 min + option 1 à 5 h pour le laps de temps.

1. Transfert de 3,5 cm Sylgard enduit plat pour un esprit microscope confocal équipéh un laser argon (488 nm de longueur d'onde) et les objectifs à immersion à eau (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA et 100x, 1,0 NA ou 60x, 0,9 NA).
2. En option pour la microscopie time-lapse: Insérer 3,5 cm Sylgard enduit plat dans l'anneau de chauffage, installer un système de surfusion et la sonde de température (figure 2A). Assurez-vous qu'aucun d'entre eux touchent l'explant, le bord de l'assiette ou le revêtement Sylgard. Chauffer l'échantillon à 33-35 ° C. Pour le SC blanchiment sans time-lapse, la température ambiante est meilleure, car les cellules afficher moins dynamique entre les étapes de blanchiment.
3. Avec un objectif 4x observer air modèle innervation du muscle sterni triangularis et trouver triangularis bande flasque manubrium. Mettez à tremper 20x-cône objectif et commencer à regarder pour les régions superficielles dans la bande de flasque (côtes zones sus-jacentes sont de bons candidats). Modifier l'objectif 100x ou 60x trempage cône objectif de vérifier JNM individuels. Idéal est un NMJ qui est couvert par plusieurs SC et est situé très superficially (figure 2B). Si vous effectuez imagerie time-lapse après le blanchiment, sélectionnez jusqu'à 3 JNM qui sont relativement proches les unes pour augmenter le rendement.
4. Acquérir une image confocale de la jonction neuromusculaire avant photo-blanchiment SC individuelles (figure 2B). (Pour l'imagerie haute résolution, par exemple sur un microscope Olympus FV1000, utiliser un 100x, 1,0 NA objectif zoom et 2,5, ce qui conduit à de Nyquist-échantillonnage limité de ~ 0,1 um par pixel.)
5. "Park" le faisceau laser de 488 nm au centre sur le noyau d'un SC en utilisant la puissance maximale pendant 5 secondes (encore un modèle de balayage efficace dans une petite région d'intérêt peut être utilisé, tel que la "tornade scan" sur un microscope Olympus; car nous utilisons un microscope confocal, le laser est focalisé dans les plans image-conjugués et, par conséquent, à 488 nm avec un objectif de 1,0 NA, <0,5 um de diamètre). Recentrer sur la cellule et le juge de blanchiment résultat. Si nécessaire, répétez étape de blanchiment à nouveau jusqu'à ce que les niveaux de GFP sont de réduired à la quasi-fond les niveaux. Acquérir une image après le blanchiment (figure 2C). Il est essentiel de veiller à ce que la région blanchie est en dehors de tout chevauchement entre les deux cellules - s'il ya chevauchement, de blanchiment dans une deuxième cellule sera évidente.
6. Répétez l'étape ci-dessus jusqu'à ce que tous sauf un sont blanchis SC (figure 2D-E). Le dernier «écrus» SC est adapté pour confocale microscopie time-lapse. Reconstruire des cellules individuelles par soustraction d'images, par exemple en utilisant le logiciel Photoshop, pour délimiter seule morphologie SC et territoire (figure 2F). Soyez conscient du fait que la soustraction de deux mages ajoute du bruit (par exemple, en les important dans consécutifs "couches" dans Photoshop, puis définir le canal supérieur à la «différence» dans le menu déroulant en haut de l'onglet canaux). Cela peut être contournée en utilisant le mode "Dépoussiérer" sur les canaux avant soustraction et de culture loin n'importe quel fond qui ne veut évidemment pas provenir de lacellule blanchie. Pour optimiser le contraste, il peut être nécessaire d'ajuster la luminosité des deux canaux dans le "niveau" fenêtre. L'image résultante de la cellule blanchie est superposée à l'image de l'original d'une synapse, pseudo-couleur dans une teinte unique et rendu transparent à la couleur sur le territoire de la cellule blanchie dans l'image d'origine (à partir de cela pendant toute la dernière blanchie et , les cellules écrus l'image affichée dans les résultats 2F Figure).
7. En option: Démarrer confocale microscopie time-lapse après le blanchiment tous sauf un SC. Prendre une photo à des intervalles fixes (par exemple toutes les 5 min à 10). Utiliser en tant que puissance laser faible que possible. Jusqu'à 3 JNM peuvent être visualisés à la même session.
8. Faire une carte des JNM temps expiré en prenant une image à 100x sans zoom, puis des images de la région en utilisant 20x et objectifs 4x (figure 2G-I). Cette «carte» est nécessaire pour trouver JNM après immunohistochimie d'un muscle fixe.
9. Pour l'imagede traitement, de convertir des images individuelles dans les projections d'intensité maximale et enregistrer au format TIFF. Mélanger tous les z-projetées points temporels dans une pile et aligner en xy, par exemple en utilisant le "stackreg" plugin ¹⁰ en Fidji (un package basé sur le logiciel libre ImageJ, National Institutes of Health).

3. Fixation et immunohistochimie (Figure 3)

Timing: Nuit.

1. Transférer l'explant dans un tube de réaction de 50 ml contenant au moins 15 ml PFA à 4% en prenant soin de retirer les broches. Post-fixer la paroi thoracique antérieure contenant le muscle triangularis sterni pendant 1 heure sur la glace. Rincer le tissu fixe avec 0,1 M de glycine dans du PBS (pour étancher fixateur résiduel et donc de réduire de fond) pendant au moins 10 min. Les échantillons peuvent être conservés à ce point et exécutée plus tard.
2. Transfert explant fixe à un 10-cm Sylgard tissu enduit boîte de culture rempli de PBS 0,01 M. Découpez une forme trapézoïdale avec une siparallèlement au sternum de l'autre à travers les transitions os-cartilage - contient le muscle triangularis sur sa surface. Enlever la partie inférieure côtes avec une horizontale (trans-sternale) découpé de telle sorte que l'extrémité caudale du muscle triangularis peut être librement accessibles (figure 3A-D).
3. Insérer une aiguille hypodermique comme une broche dans la partie supérieure du trapèze (figure 3E). Utilisez une aiguille hypodermique attachée à une seringue de 1 ml et une pince pour retirer le muscle triangularis sur la surface doucement en maintenant un coin caudale du muscle et en utilisant l'aiguille comme un micro-scalpel. Assurez-vous que les coupes sont faites parallèlement au plan de la paroi thoracique. Une fois la partie caudale du muscle est relâché, insérez une autre aiguille hypodermique comme une épingle en dessous du muscle à travers la paroi thoracique - ce immobilise la préparation et permet d'exercer une légère traction sur le muscle en utilisant une pince (figure 3F). Comme vous coupez tiss conjonctifinsertions ue, "peler" loin le muscle du thorax. Couper dernière pièce jointe caudale avec des ciseaux à ressort. Retirer les restes de graisse et le sang des vaisseaux à l'aide de pinces. Veillez à ne pas déchirer loin les nerfs. Remarque: Utilisez des ensembles d'outils distincts et des plats pour travailler avec des tissus vivants et fixe.
4. Début immunohistochimie (en utilisant un protocole standard) en transférant des échantillons de tissu dans une solution de blocage pendant 1 heure sur un agitateur à température ambiante. Plus petit volume possible pour la coloration est de 200 ul en utilisant une plaque de 96 puits.
5. Appliquer un anticorps primaire dilué dans une solution de blocage, 200 ul par puits, une nuit à 4 ° C sur un agitateur.
6. Laver dans du PBS 0,01 M à trois reprises pendant 10 min.
7. Appliquer une anticorps secondaire pendant 1-2 heures à la température ambiante dilué dans une solution de blocage.
8. Laver dans du PBS 0,01 M à trois reprises pendant 10 min.
9. Montez dans la lutte anti-fading support (par exemple Vectashield) et la lamelle.
10. Placer la lame sur une plaque de métal magnétique, aimant placer sur le dessusde l'échantillon pour aplatir pendant quelques heures ou toute la nuit à 4 ° C. Sceller avec du vernis à ongles.

Résultats

Un exemple d'un explant triangularis sterni prêt pour l'imagerie plat est illustré à la figure 1G. Cette explant est particulièrement adapté pour l'imagerie JNM ex vivo que le muscle triangularis composée uniquement de quelques couches de fibres musculaires. Ceci permet d'obtenir des images haute définition à partir d'explants issus de lignées de souris transgéniques qui supporte clou SC (PLP-GFP ²⁾ et / ou des axones (Thy1-XFP ^1)....

Discussion

La méthode de blanchiment SC présenté ici est simple, rapide et polyvalent: (i) Il permet de révéler la morphologie unique SC et la dynamique par microscopie confocale basée sur un seul transgène - ce qui est un avantage non négligeable lorsque l'on combine l'approche avec par exemple des modèles de maladies qui nécessitent des allèles supplémentaires . (Ii) Le procédé est rapide, à partir de dissection de fixation peut être effectuée en une demi-journée. (Iii) Le nombre de demandes es...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société (exemple)	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Une solution d'éthanol à 70% (vol / vol)	Roth	T913.1	en vaporisateur
isoflurane	Forene, Abbott		tout autre anesthésique approuvé peut être utilisé pour l'anesthésie mortelle
des souris transgéniques (PLP-GFP)			être obtenue à partir de sources citées
microscope à dissection avec lumière froide éclairage	Olympus SZ51		équipé d'Schott KL LCD 1500
pince #2	Outils Fine Science	11233-20
forceps n ° 5	Outils Fine Science	11295-00
ciseaux, grand médicaux	Outils Fine Science	14108-09
ciseaux, petite coudée à ressort	Outils Fine Science	15033-09
en ligne réchauffeur	Warner Instruments	SF-28
chauffage anneau de 3,5 cm de plats	Warner Instruments	64-0110 DH-35
système à deux canaux de contrôle de température	Warner Instruments	TC-344B
Système de pompe superfusion			custom-built
15 cm boîte de culture tissulaire	Sarstedt	83.1803.003	rempli de glace et recouvert par une plaque métallique
10 cm boîte de culture tissulaire	Sarstedt	83.1802.003	avec une solution de Ringer oxygénée de
3,5 cm boîte de culture tissulaire	Sarstedt	83.1800.003	rempli avec du Sylgard polymère
Sylgard polymère	Dow Corning	Sylgard 184 Kit élastomère silicone
Microscope confocal	Olympe	FV1000	avec de l'argon laser
Tube de réaction de 50 ml	Sarstedt	62.547.254 PP
4% dans du PBS PFA	Sigma	P6148
Canule 0,5 x mm 25 mm	Neolab	E-1510
seringue de 1 ml	Neolab	E-1496
anticorps synaptophysine	Invitrogen	18-0130	lapin
anticorps secondaire	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
Plaque de 24 puits	Sarstedt	83.1836
PBS 0,01 M	Sigma	P4417
0,1 M glycine dans du PBS	Roth	3790.1
lamelles	Neolab	E-4132
diapositives	Neolab	E-4121
Vectashield	Laboratoires Vecteur	H-1000
épingles minuties × 10	Outils Fine Science	26002-20	abrégée <4 mm
α-bungarotoxine couplé à Alexa 594	Invitrogen (Molecular Probes)	B-13423
			Blocking Solution
0.01 M PBS
0,2% de Triton-X100	Roth	3051.3
10% de sérum de chèvre normal	Abcam	ab7481
1% de sérum albumine bovine	Sigma	A7030
			Sonneur barboter avec 95% O 2/5% de CO 2
125 mM NaCl	Sigma	S7653
2,5 mM KCl	Sigma	P9333
1,25 mM de NaH 2 PO 4	Sigma	S8282
26 mM NaHCO 3	Sigma	S6297
2 mM de CaCl2	Sigma	21114
MgCl 2 1 mM	Sigma	63020
20 mM de glucose	Sigma	G7528
			Tableau 1. Réactifs spécifiques et des équipements.