Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Resumo

Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. "Sequential foto-branqueamento" permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem e Post-hoc Imunomarcações.

Resumo

Sequencial de foto-branqueamento fornece uma maneira não-invasiva para rotular SCs individuais no NMJ. O NMJ é a maior sinapse do sistema nervoso de mamíferos e serviu como guia modelo para estudar a estrutura e função sináptica. No rato NMJs terminais do motor axônio formar locais pretzel, como contato com as fibras musculares. O axônio motor e seu terminal são revestidos por SCs. Ao longo das últimas décadas, vários ratinhos transgénicos que foram gerados para visualizar os neurónios motores e SCS, por exemplo Thy1-XFP ¹ e Plp-GFP ratos ^2, respectivamente.

Junto axônios motores, myelinating SCs axonais são dispostos em não sobrepostos entrenós, separados por nós de Ranvier, para permitir a propagação saltatória potencial de ação. Em contraste, a SCS terminais na sinapse são especializados células gliais, que monitoram e promover a neurotransmissão, digerir os detritos e os axônios guia de regeneração. NMJs estão bem cobertos em até meia dúzia de não-mielinating SCs terminais - estes, no entanto, não podem ser resolvidas individualmente por microscopia de luz, uma vez que estão em contacto directo membrana ^3.

Diversas abordagens existem para visualizar individualmente SCs terminais. Nenhum destes são impecáveis, embora. Por exemplo, o corante de enchimento, em que as células individuais são empalado com um microeléctrodo de corante-cheia, requer a destruição de uma célula marcada antes do enchimento de um segundo. Esta não é compatível com subseqüentes lapso de tempo gravações ^3. Multi-espectral "Brainbow" rotulagem de SCs foi conseguido usando a expressão combinatória de proteínas fluorescentes ^4. No entanto, esta técnica requer que combina diversos transgenes e está limitado por o padrão de expressão dos promotores utilizados. No futuro, a expressão de "photo-comutável" proteínas em SC pode ser ainda mais ⁵ alternativa. Aqui apresenta-se foto-branqueamento sequencial, em que as células individuais são branqueados, e sua imagem obtida por subtracção. Acreditamosque esta abordagem - devido à sua facilidade e versatilidade - representa uma adição duradoura para a paleta neurocientista da tecnologia, especialmente no que pode ser utilizado in vivo e transferido para outros tipos de células, os locais anatómicos e espécies ^6.

No protocolo a seguir, detalhes que a aplicação de branqueamento e seqüencial subseqüente microscopia confocal lapso de tempo para SCs terminais em explantes musculares triangularis Sterni. Esta fina, superficial e facilmente dissecados preparação nervo-músculo ^7,8 tem se mostrado útil para estudos de NMJ desenvolvimento, fisiologia e patologia ^9. Finalmente, vamos explicar como o músculo Sterni triangularis está preparado para executar após a fixação correlacionada de alta resolução de imagem confocal, imunohistoquímica ou exames ultra-estruturais.

Protocolo

1. Triangularis Sterni explante (Figura 1)

Cronograma: 15 min.

1. Prepare instrumentos cirúrgicos: 2 pares de fórceps, um par de tesouras, 1 par de tesouras de primavera, um prato de cultura de tecido (10 cm). Previamente borbulhado (mínimo de 15 min) arrefecida (4 ° C) solução de Ringer com 5% CO _2/95% O _2. Preencha 15 cm prato de cultura de tecidos com gelo e cubra-o com placa de metal. Prepare microscópio de dissecção e colocar o prato de 15 cm com gelo sob o escopo de dissecação, de modo a arrefecer o explante durante o esvaziamento.
2. Letalmente anestesiar o rato por overdose de isoflurano (ou qualquer outro método aprovado de sacrifício). Pulverizar o rato com etanol a 70% para evitar a contaminação da pele do explante. SC para branqueamento, é usado Plp-GFP ratos, que podem ser atravessados ​​para Thy1-OFP3 ou Thy1-Membow13 para a visualização simultânea do axon.
3. Utilizando o par de tesouras grandes, fazer uma incisão na linha média doda pele sobre o esterno e duas incisões paralelas à aresta inferior da caixa torácica.
4. Utilizando o par de tesouras grandes, remover a pele, abre a parede abdominal e fazer incisões paralela à caixa torácica todo o caminho de volta para a coluna vertebral. Então dissecar fora os músculos peitorais, fazendo incisões próximas à inserção do músculo no esterno.
5. Corte o diafragma aberto logo abaixo da cartilagem xifóide e dissecar fora do diafragma ao longo de suas inserções costais.
6. Segurando a caixa torácica pelo processo xifóide com um conjunto de pinças, iniciar o corte das nervuras da coluna vertebral, tão próximo quanto possível das suas inserções. Os cortes de esquerda e direita devem convergir acima do coração em direção ao manúbrio. Tente evitar o corte de grandes vasos sanguíneos (especialmente as veias subclávia). Melhor visibilidade é conseguida levantando com cuidado a preparação ao sustentar o processo xifóide com uma pinça.
7. Fazer um corte transversal imediatamente abaixo da manúbrioe transferir o explante no prato de 10 cm com 5% de CO refrigerado _2/95% O _2-borbulhado solução de Ringer. Coloque o recipiente de 10 cm sobre a placa de metal cobrindo a 15 cm de placa de cultura de tecido cheio de gelo. Todas as outras etapas deve ser feita sob o microscópio de dissecação.
8. Com uma tesoura pequena mola remover os restos do timo, pleura, diafragma (dentro) e músculos peitorais (fora; Figura 1B-D).
9. Para ajustar o explante para o prato de 3,5 cm, dissecar fora todas as costelas que não inserir o esterno. Isto é feito melhor com uma tesoura pequena mola e cortando o tecido entre as costelas (Figura 1E).
10. Pin o triangularis Sterni explante nervo-músculo no Sylgard revestido prato de cultura de 3,5 cm tecido utilizando pinos minutien (abreviado para <4 mm; Figura 1G). Dois pinos deve passar por cartilaginosos (branco) partes do esterno. Inserir, pelo menos, dois pinos através das nervuras, tanto do lado esquerdo e direito do thexplante e apontando para as partes mais suaves e cartilaginosos, evitando as costelas sob ou perto do músculo triangularis. Os mais pinos são utilizados, o melhor (que usam tipicamente 8-10). Como você fechar a preparação, certifique-se de que as costelas são um tanto espalhado, a fixação do músculo em uma posição um pouco esticado.
11. Opcional: Visualize sítios sinápticos que contêm receptores de acetilcolina através da adição bungarotoxina acoplados a corantes Alexa (concentração de 0,8 ug / ml em 5% CO _2/95% O _2-borbulhado solução de Ringer). Incubar explante fixado em Sylgard prato revestido por 15-20 minutos à temperatura ambiente, em seguida, lavar várias vezes com 5% CO _2/95% O _2-borbulhado solução de Ringer.

2. SCs branquear e Microscopia Time-lapse Opcional (Figura 2)

Cronometragem: 30 - 45 min + opcional 1-5 horas, para a lapso de tempo.

1. Transferência de 3,5 cm prato Sylgard revestido de uma sagacidade microscópio confocal equipadoh um laser de argônio (488 nm) e objectivos de água de imersão (4x, 0,13 NA; 20x, e 100x NA 0,5, 1,0 NA ou 60x, 0,9 NA).
2. Opcional para lapso de tempo de microscopia: Inserção de 3,5 cm Sylgard revestido prato em anel de aquecimento, instalar o sistema superfusão e sonda de temperatura (Figura 2A). Certifique-se de que nenhum deles tocar o explante, a borda do prato ou do revestimento Sylgard. A amostra é aquecida a 33-35 ° C. Para SC branqueamento sem lapso de tempo, a temperatura ambiente é melhor, como células mostram uma dinâmica menos entre as etapas de branqueamento.
3. Com um ar de 4x objetivo observar o padrão de inervação do músculo Sterni triangularis e encontrar banda placa motora triangularis Sterni. Mudar para 20x objetivo mergulhando de cone e começar a olhar para regiões superficiais dentro da banda de placa motora (costelas áreas sobrepostas são bons candidatos). Alterar objetivo de 100x ou 60x objetivo mergulhando-cone para verificar NMJs individuais. Ideal é um JNM que é coberto por vários SCs e está localizado muito superficially (Figura 2B). Se você executar lapso de tempo de imagem após o clareamento, selecionar até três NMJs que estão relativamente próximos entre si para aumentar o rendimento.
4. Adquirir uma imagem confocal do NMJ antes de foto-branqueamento SCs individuais (Figura 2B). (Para imagem de resolução completa, por exemplo, em um microscópio Olympus FV1000, usar um 100x, 1,0 e 2,5 NA objectiva zoom, o que resulta em Nyquist de amostragem limitada de ~ 0,1 mM por pixel.)
5. "Park" a 488 nm do laser de feixe centralmente sobre o núcleo de um SC usando potência máxima durante 5 segundos (em alternativa, um padrão de pesquisa eficiente de uma pequena região de interesse pode ser utilizado, tal como o "tornado scan" função em um microscópio Olympus; quando usamos um microscópio confocal, o laser é focado para os planos de imagem conjugadas-e, portanto, a 488 nm, com um objectivo de 1,0 NA, <0,5 um de diâmetro). Mude o foco na célula e juiz de branqueamento resultado. Se necessário, repita branqueamento etapa novamente até que os níveis GFP são reduzird para fundo níveis próximos. Adquira uma imagem após o clareamento (Figura 2C). É crítico para certificar-se que a região é branqueada fora de qualquer sobreposição entre as duas células - se há uma sobreposição, branqueamento em uma segunda célula serão óbvias.
6. Repetir o passo anterior até que todas menos uma SC são branqueadas (Figura 2D-E). A última "crus" SC é adequado para microscopia confocal lapso de tempo. Reconstruir células individuais, por subtracção de imagens, por exemplo, utilizando software Photoshop, para delinear a morfologia única e SC território (Figura 2F). Esteja ciente de que subtraindo dois magos acrescenta ruído (por exemplo, importando-os no consecutivos "camadas" no Photoshop e, em seguida, definir o canal de cima para "diferença" no menu drop-down no topo da guia canais). Isso pode ser contornado usando o "despeckle" função nos canais antes de subtração e corte fora qualquer fundo que, obviamente, não se origina a partir dacélula branqueada. Para optimizar o contraste, pode ser necessário ajustar o brilho dos dois canais na "níveis" janela. A imagem resultante da célula branqueada é sobreposta na imagem original de uma sinapse, pseudo-colorida num tom único e tornada transparente para colorir o território da célula branqueada na imagem original (de fazer isto para todos branqueada e a última , células não branqueado a imagem mostrada na Figura 2F resultados).
7. Opcional: Iniciar microscopia confocal lapso de tempo após o clareamento todos, mas uma SCs. Pegue uma imagem em intervalos fixos (por exemplo, a cada 5 minutos a 10). Uso como potência de laser pequeno quanto possível. Até 3 NMJs podem ser visualizados na mesma sessão.
8. Faça um mapa dos NMJs tempo decorrido, tendo uma imagem em 100 vezes sem zoom, em seguida, imagens da região usando 20x e objetivos 4x (Figura 2G-I). Este "mapa" é necessário para encontrar NMJs seguintes imunohistoquímica de um músculo fixa.
9. Para a imagemprocessamento, converter imagens individuais em projeções de intensidade máxima e salvar em formato TIFF. Misture todos os z-projetadas tempo de pontos em uma pilha e alinhar em xy, por exemplo, usando o plugin "stackreg" ¹⁰ em Fiji (um pacote com base no software livre ImageJ; Institutos Nacionais de Saúde).

3. Fixação e imuno-histoquímica (Figura 3)

Timing: Overnight.

1. Transferir o explante num tubo de reacção de 50 ml contendo, pelo menos, 15 ml de 4% PFA removendo cuidadosamente os pinos. Pós-fixar a parede torácica anterior, contendo o músculo Sterni triangularis durante 1 hora em gelo. Enxaguar tecido fixado com glicina 0,1 M em PBS (para extinguir fixador residual e, consequentemente, reduzir o fundo) durante pelo menos 10 min. As amostras podem ser armazenadas a este ponto e processada mais tarde.
2. Transferir para um explante fixo de 10 cm de placa de cultura de tecido revestido Sylgard cheio com 0,01 M de PBS. Cortar uma forma trapezoidal com uma side paralelo para o esterno e o outro através das transições osso-cartilagem - este contém o músculo triangularis na sua superfície. Remover costelas inferiores com uma horizontal (ou seja, trans-esternal) cortado, de modo que a extremidade caudal do músculo triangularis pode ser acessado livremente (Figura 3A-D).
3. Inserir uma agulha hipodérmica como um pino para a parte superior do trapézio (Figura 3E). Use uma agulha hipodérmica ligada a uma seringa de 1 ml e uma pinça para remover o músculo triangularis na superfície suavemente agarrar um canto caudal do músculo e usando a agulha como um micro-escalpelo. Certifique-se de que os cortes são feitos paralelos ao plano da parede torácica. Uma vez que a parte caudal do músculo é libertado, se inserir uma nova agulha hipodérmica como um pino inferior ao músculo através da parede torácica - isto imobiliza a preparação e permite exercer um puxão suave sobre o músculo usando fórceps (Figura 3F). Como você está cortando tiss conjuntivoinserções ue, "casca" de distância do músculo do tórax. Corte anexo caudal última com uma tesoura de mola. Remover restos de navios de gordura e sangue, usando uma pinça. Tenha cuidado para não rasgar os nervos Nota:. Use diferentes conjuntos de ferramentas e pratos para trabalhar com tecido vivo e fixo.
4. Iniciar imunohistoquímica (utilizando um protocolo normalizado), transferindo as amostras de tecido em solução de bloqueio durante 1 hora num agitador à temperatura ambiente. Menor volume possível de coloração é de 200 ul usando uma placa de 96 poços.
5. Aplicar o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio, 200 ul por poço, durante a noite a 4 ° C num agitador.
6. Lavar com PBS 0,01 M, três vezes, durante 10 min.
7. Aplicar o anticorpo secundário adequado durante 1-2 horas à temperatura ambiente, diluiu-se em solução de bloqueio.
8. Lavar com PBS 0,01 M, três vezes, durante 10 min.
9. Montar em anti-desbotamento meio (por exemplo Vectashield) e lamela.
10. Colocar a lâmina na placa de metal magnético, ímã lugar no topoda amostra para achatar por algumas horas ou durante a noite a 4 ° C. Selo com unha polonês.

Resultados

Um exemplo de um explante Sterni triangularis pronto para o prato de imagem é mostrado na Figura 1G. Este explante é particularmente adequada para a imagiologia ex vivo NMJs como o músculo triangularis consiste apenas de algumas camadas de fibras musculares. Isto permite a obtenção de imagens de alta resolução a partir de explantes derivados de linhas de ratinhos transgénicos que realce ou SCs (PLP-GFP ²⁾ e / ou (axónios Thy1-XFP ^1). Factores cr?...

Discussão

O método aqui apresentado SC branqueamento é simples, rápido e versátil: (i) permite revelar a morfologia única e SC dinâmica por meio de microscopia confocal baseado num único transgene - o que é uma vantagem significativa quando se combina a abordagem por exemplo, com modelos de doenças que necessitam de alelos adicionais . (Ii) O método é rápido, a partir de dissecação para a fixação pode ser realizada em meio dia. (Iii) O número de aplicações é vasto, uma vez que pode ser combinado com o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Empresa (exemplo)	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Solução de etanol a 70% (vol / vol)	Roth	T913.1	em frasco de spray
isoflurano	Forene, Abbott		qualquer outro anestésico aprovado pode ser utilizada para a anestesia letal
ratinhos transgénicos (PLP-GFP)			de ser obtida a partir de fontes citadas
microscópio de dissecção com iluminação de luz fria	Olympus SZ51		equipado com Schott KL 1500 LCD
fórceps #2	Belas Science Tools	11233-20
fórceps # 5	Belas Science Tools	11295-00
tesoura, médicos grande	Belas Science Tools	14108-09
tesoura, mola angular pequena	Belas Science Tools	15033-09
na linha de aquecedor	Warner Instruments	SF-28
aquecimento anel para 3,5 centímetros pratos	Warner Instruments	64-0110 DH-35
de dois canais do sistema de controlo de temperatura	Warner Instruments	TC-344B
sistema de bomba de superfusão			custom-built
15 cm de diâmetro prato de cultura de tecidos	Sarstedt	83.1803.003	cheio de gelo e coberta por uma placa de metal
10 centímetros, prato de cultura de tecidos	Sarstedt	83.1802.003	com solução de Ringer oxigenado do
3,5 centímetros, prato de cultura de tecidos	Sarstedt	83.1800.003	preenchido com polímero Sylgard
Sylgard polímero	Dow Corning	Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone
microscópio confocal	Olimpo	FV1000	com laser de árgon
De 50 ml, tubo de reacção	Sarstedt	62.547.254 PP
4% PFA em PBS	Sigma	P6148
cânula 0,5 mm x 25 milímetros	Neolab	E-1510
seringa de 1 ml	Neolab	E-1496
anticorpo sinaptofisina	Invitrogen	18-0130	coelho
anticorpo secundário	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
Placa de 24 poços	Sarstedt	83,1836
0,01 M PBS	Sigma	P4417
Glicina 0,1 M em PBS	Roth	3790,1
lamínulas	Neolab	E-4132
lâminas	Neolab	E-4121
Vectashield	Vector laboratórios	H-1000
pinos minutien × 10	Belas Science Tools	26002-20	reduzido para <4 mm
α bungarotoxina acoplado a Alexa 594	Invitrogen (Molecular Probes)	B-13423
			Solução de Bloqueio
0.01 M PBS
0,2% de Triton-X100	Roth	3051,3
O soro de cabra normal a 10%	Abcam	ab7481
1% de albumina sérica bovina	Sigma	A7030
			Sineiro borbulhada com 95% de O2 / 5% de CO 2
125 mM de NaCl	Sigma	S7653
2,5 mM de KCl	Sigma	P9333
1,25 mM NaH 2 PO 4	Sigma	S8282
26 mM NaHCO3	Sigma	S6297
2 mM de CaCl 2	Sigma	21114
1 mM de MgCl2	Sigma	63020
20 mM de glicose	Sigma	G7528
			Tabela 1. Reagentes específicos e equipamentos.