연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

요약

이러한 신경 근육 접합 (NMJs)에서 터미널 Schwann 세포 (SCS)과 같은 밀도가 높은 포장 조직에 개별 셀을 표시하는 것은 도전입니다. "선형 사진 표백"표백 순서는 시간 경과 영상과 결합 할 수있는 triangularis sterni의 근육 explant, 편리하게 신경 근육 준비에 예를 들어, 단일 터미널 SCS를 delineating 수 있으며 후 특별 immunostainings.

초록

사진 표백 순서는 NMJ에서 개인 SCS에 라벨을 할 수있는 비 침습적 방법을 제공합니다. NMJ는 포유류의 신경계의 가장 큰 시냅스이며, 시냅스 구조와 기능을 연구 모델을지도로 제공하고 있습니다. 마우스 NMJs 모터 축삭 터미널에서 근육 섬유와 꽈배기 같은 연락처 사이트 구성합니다. 모터 축삭과 터미널 SCS에 끼 우고 있습니다. 지난 수십 년 동안, 여러 가지 유전자 변형 생쥐는 각각 Thy1-XFP ¹ PLP-GFP 마우스 ² 예를 들어, 모터 뉴런과 SCS를 시각적으로 생성되었습니다.

모터 axons 함께 myelinating axonal SCS는 약진 액션 잠재적 인 전파를 사용하려면, Ranvier의 노드로 구분하여 겹치지 internodes에 배치된다. 대조적으로, 시냅스에서 터미널 SCS는 모니터링 및 neurotransmission를 홍보 파편과 가이드 재생의 axons을 소화 전문 glial 세포입니다. NMJs는 단단 대여섯 비 myel까지이 적용됩니다터미널 SCS를 inating - 그들이 직접 멤브레인 연락처 ^세에 이러한 그러나, 개별적으로, 가벼운 현미경에 의해 해결 될 수 없습니다.

여러 접근법은 개별적으로 터미널 SCS을 시각화하기 위해 존재합니다. 이 중 어느 것도하지만, 완벽한 없습니다. 예를 들어, 하나의 세포가 염색이 가득한 microelectrode에 찔려 죽은 아르 염료 충전은 두 번째 하나를 작성하기 전에 표시된 셀을 파괴해야합니다. 이 이후의 시간 경과 녹음 ³ 호환되지 않습니다. SCS의 멀티 스펙트럼 "Brainbow"라벨은 형광 단백질의 조합 표현 ^사를 사용하여 달성되었습니다. 그러나,이 기술은 여러 transgenes을 결합 필요하며 사용 발기인의 표현 패턴에 의해 제한됩니다. 앞으로 SCS에서 "사진 전환 가능한"단백질의 표정은 또 다른 대안이 ^다섯 수 있습니다. 여기 순차 사진 표백 한 셀이 표백 곳, 그리고 빼기 얻은 자신의 이미지를 제시한다. 우리는 믿고이 접근하는 -의 편리함과 다양성으로 인해이 -이 생체에 사용하고 다른 세포 유형, 해부학 사이트 또는 종 ⁶ 이전 할 수 있습니다 특히 neuroscientist의 기술 팔레트에 지속적인 추가를 나타냅니다.

triangularis sterni 근육의 explants에서 터미널 SCS에 대한 표백 순서와 후속 공 촛점 시간 경과 현미경의 다음 프로토콜에서, 우리는 세부 응용 프로그램을. 이, 얇은 표면 쉽게 해부하는 신경 근육 준비 ^7,8는 NMJ 개발, 생리와 병리 ⁹ 연구에 유용 입증되었습니다. 마지막으로, 우리는 고정 고해상도 공 촛점 이미징, immunohistochemistry 또는 ultrastructural 시험 상관 수행 한 후 triangularis sterni 근육이 준비 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. Triangularis Sterni Explant (그림 1)

시간 : 15 분.

1. 포셉 2 켤레, 가위 1 쌍, 스프링 가위 1 쌍, 1 조직 문화 요리 (10 cm) : 수술기구를 준비합니다. (15 분에 대한 최소) 미리 부풀어 오른 냉각 (4 ° C) 5 % CO ₂ / 95% O ₂ 벨소리의 솔루션입니다. 얼음 15 cm 조직 문화 접시를 작성하고 금속 플레이트로 다룹니다. 해부 현미경을 준비하고 해부하는 동안 explant을 냉각하기 위해 절개 범위에서 얼음을 15 cm 접시를 놓습니다.
2. Lethally isoflurane 과다 복용 (또는 희생의 다른 승인 된 방법)에 의해 마우스를 마취. explant 털의 오염을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이. SC는 표백을 위해, 우리는 축삭의 동시 시각화를 위해 Thy1 - OFP3 또는 Thy1 - Membow13에 발을 담그 할 수 있습니다 PLP-GFP 마우스를 사용했습니다.
3. 큰 가위의 쌍을 사용하여,의 중간 선 절개를가슴과 흉곽의 아래쪽 가장자리에 평행이 절개를 통해 피부.
4. 큰 가위의 쌍을 사용하여, 피부를 제거 복부 벽을 열고 척추 컬럼에 다시 먼길을 흉곽에 절개를 병렬합니다. 그런 다음 가슴의 근육 삽입에 가까운 절개를하여 가슴 근육을 해부.
5. 그냥 칼 모양의 연골 아래에 열려있는 가로막을 잘라과 늑골 삽입을 따라 횡경막을 해부.
6. 포셉의 집합으로 칼 돌기에 의해 갈비​​를 개최, 가까이의 삽입에 가능한 한, 척추 열에서 갈비뼈를 절단 시작합니다. 왼쪽 및 오른쪽 상처는 흉골 병 sterni에 대한 가슴 위에 수렴해야합니다. 주요 혈관을 (특히 빗장 밑 정맥) 절단 방지하기 위해보십시오. 더 나은 가시성을 집게로 칼 돌기에 누른 상태 부드럽게 준비를 리프팅에 의해 달성된다.
7. 단지 흉골 병 sterni 아래 가로 컷을및 냉각 5 % CO ₂ / 95% O ₂ - 부풀어 오른 벨소리의 솔루션을 10 cm 그릇에 explant를 전송합니다. 얼음 가득 15 cm 조직 배양 접시를 덮고있는 금속 판에 10 cm 접시를 놓습니다. 모든 자세한 단계는 해부 현미경 아래에서 수행해야합니다.
8. 작은 봄 가위를 사용하여 thymus, 늑막, 격막 (내부)과 가슴 근육의 나머지 제거 (외부, 그림 1B-D).
9. 3.5 cm 요리에 explant를 맞추려면 가슴에 삽입하지 않은 모든 갈비를 해부. 이것은 가장 작은 봄 가위를 사용하고 갈비 (그림 1E) 사이에있는 조직을 절단 이루어집니다.
10. minutien 핀을 (; 그림 1G <4 mm까지 단축)를 사용하여 Sylgard 코팅 3.5 cm 조직 배양 접시에 triangularis sterni 신경 근육 explant를 핀. 두 핀은 흉골의 연골 성의 (흰색) 부분을 통과해야합니다. 두 번째의 왼쪽과 오른쪽에있는 갈비를 두 개 이상 핀을 삽입전자 explant은 부드러운 연골 성의 부품을 목표로하고 아래에있는 갈비뼈을 피하거나 triangularis 근육을 닫습니다. 더 핀이 사용하는, 더 나은 (우리가 일반적으로 8-10을 사용). 당신이 준비를 핀으로 약간 늘어 위치로 근육을 고정, 갈비뼈가 다소 전파되어 있는지 확인합니다.
11. 선택 사항 : 알렉사 염료 (5 % CO ₂ / 95% O ₂ - 부풀어 오른 벨소리의 솔루션에서 0.8 μg / ML의 농도)에 커플 링 bungarotoxin을 추가하여 아세틸 콜린 수용체를 포함하는 신경 사이트를 표시합니다. 실내 온도 15-20 분에 대한 Sylgard 코팅 접시에 고정 explant를 배양 한 다음 5 % CO ₂ / 95% O ₂ - 부풀어 오른 벨소리의 솔루션으로 여러 번 씻는다.

2. 표백 SCS 및 선택 시간 경과 현미경 (그림 2)

타이밍 : 30 - 45 분 + 옵션 1 - 시간 경과 5 시간.

1. 공 촛점 현미경 시설 지혜로 전송 3.5 cm Sylgard - 코팅 접시를H 아르곤 레이저 (488 nm의 파장)와 물 침지 목표 (배속, 0.13 NA, 20x, 0.5 NA와 100x, 1.0 NA 또는 60x, 0.9 NA).
2. 시간 경과 현미경을위한 선택 사항 : 삽입 난방 링에 요리 3.5 cm Sylgard - 코팅, superfusion 시스템과 온도 프로브 (그림 2A)를 설치합니다. 그들 중 아무도 explant, 요리 나 Sylgard 코팅의 가장자리를 만지지 없는지 확인합니다. 33-35에 샘플을 가열 ° C. 세포가 표백 단계들 사이에서 덜 역학을 표시로 SC 시간이 경과하지 않고 표백를 들어, 방 온도는 더 나은 것입니다.
3. 4 배 공기 목적은 triangularis sterni 근육의 innervation 패턴을 관찰하고 triangularis sterni의 endplate 밴드를 찾아 함께. 20x 찍기 - 콘 목표로 전환하여 endplate 밴드 (지역에 놓인 갈비 좋은 후보입니다) 내 표면 지역을 찾고 시작합니다. 개인 NMJs에 확인 100x 또는 60x 찍기 - 콘 목표로 목표를 변경합니다. 이상적인는 여러 SCS이 적용되어 매우 superfic에 위치하고 있습니다 NMJ입니다ially (그림 2B). 당신은 표백 후 시간 경과 영상을 수행하는 경우, 상대적으로 수율을 높이기 위해 함께 가까운 거리에 있습니다 3 NMJs까지 선택합니다.
4. 사진 표백 개인 SCS (그림 2B) 전에 NMJ의 공 촛점 이미지를 취득. (올림푸스 FV1000 현미경에 예 전체 해상도 이미지의 경우 픽셀 당 ~ 0.1 μm의 나이 퀴 스트 (Nyquist) - 제한된 샘플링에 결과 100x, 1.0 NA 목표 및 2.5 줌을 사용합니다.)
5. "공원"중심에 오초 (또는 같은 올림푸스 현미경에서 "토네이도 검색"기능으로 사용할 수있는 관심의 작은 지역에서 효율적으로 스캔 패턴에 대한 최대 전력을 사용하여 SC의 핵심에있는 488 nm의 레이저 빔, 우리가 공 촛점 현미경을 사용으로, 레이저는 1.0 NA의 목적으로 488 나노 미터에서 따라서 이미지 켤레의 비행기에 초점을 맞춘되고, 직경 <0.5 μm). 결과를 표백 셀 판사에 다시 초점을 맞 춥니 다. GFP 수준까지 다시 단계를 표백 필요한 반복 줄일 수있는 경우가까운 배경 수준으로 D. (그림 2C) 표백 후 이미지를 취득. 그것은 표백 지역 두 셀 사이에 중복되는 외부되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다 - 중복이있을 경우, 두 번째 셀에 표백하는 것은 분명합니다.
6. 하나를 제외한 모든 SC는 (그림 2D-E) 표백 될 때까지 위의 단계를 반복합니다. 마지막으로 "표백하지 않은"SC는 공 촛점 시간 경과 현미경에 적합합니다. 이미지의 뺄셈에 의해 하나의 세포를 재구성, 예를 들어 하나의 SC의 형태 및 지역 (그림 2 층)을 윤곽을 그리다하기 위해 포토샵 소프트웨어를 사용합니다. 이 마법사를 빼는 것은 소음 (포토샵의 연속 "레이어"에 가져 오기 한 후 채널 탭의 상단에있는 드롭 다운 메뉴에서 "차이"로 상위 채널을 설정하여 예를 들어) 추가에 유의해야합니다. 이것은 빼기 전에 채널에있는 "despeckle"기능을 사용하고 분명히에서 보낸 않는 배경을 멀리 자르기에 의해 피할 수표백 세포. 대비를 최적화하려면,이 '수준'창에서 두 개 채널의 밝기를 조정해야 할 수 있습니다. 표백 세포의 결과 이​​미지는 독특​​한 색조의 의사 색 시냅스의 원래 이미지에 겹쳐과 (모든 표백을 위해이 일을에서 원본 이미지의 표백 셀의 영역을 색상으로 투명 만들어 마지막 , 표백하지 않은 세포 그림 2 층 결과에 표시되는 이미지).
7. 선택 사항 : 하나를 제외한 모든 SCS를 표백 한 후 시작 공 촛점 시간 경과 현미경. 고정 간격 (예를 들어 모든 5-10 분)에 이미지를보세요. 가능한 한 작은 레이저 전원으로 사용합니다. 최대 3 NMJs은 같은 세션에서 이미징 할 수 있습니다.
8. 다음, 확대하지 않고 100x에서 20x 및 4X 목표를 (그림 2G-I)를 사용하여 지역의 이미지를 이미지를 활용하여 시간 실효 NMJs의지도를합니다. 이 "지도"는 고정 근육의 immunohistochemistry에 따라 NMJs을 찾기 위해 필요합니다.
9. 이미지처리, 최대 강도 계획에 개별 이미지 변환 및 TIFF 형식으로 저장합니다. 스택에 모든 Z-예상 시간 포인트를 결합하고 XY로 정렬 예 : (오픈 소스 소프트웨어 ImageJ에 따라 패키지, 보건 국립 연구소) 피지에서 "stackreg"플러그인 ^(10)을 사용.

3. 고정과 Immunohistochemistry (그림 3)

타이밍 : 숙박.

1. 조심스럽게 핀을 제거하여 적어도 15 ML 4퍼센트 PFA를 포함하는 50 ML 반응 관에 explant를 전송합니다. 얼음에 1 시간 동안 triangularis sterni 근육을 포함하는 앞 가슴 벽을 게시 - 수정. 적어도 10 분 동안 PBS에 0.​​1 M 글리신 (잔류 정착액을 해소하고 따라서 배경을 줄이기 위해)로 고정 조직을 씻어. 샘플은이 시점에서 저장하고 나중에 처리 할 수​​ 있습니다.
2. 0.01 M PBS로 가득 찬 10 cm Sylgard 코팅 조직 배양 접시에 고정 explant를 전송합니다. 일시와 사다리꼴 모양을 잘라가슴과 뼈 - 투 - 연골 전환을 통해 다른 사람에게 드 병렬 -이는 표면에 triangularis 근육이 포함되어 있습니다. 수평 (예 횡단 흉골) triangularis 근육의 꼬리 끝이 자유롭게 액세스 할 수 있도록 기준으로 낮은 갈비를 제거합니다 (그림 3A-D).
3. 사다리꼴의 위쪽 부분 (그림 3E)에 핀으로 피하 주사기 바늘을 삽입합니다. 부드럽게 근육의 꼬리 코너에 집중하고 마이크로 메스로 바늘을 사용하여 표면에 triangularis 근육을 제거하는 1 ML의 주사기와 포셉에 부착 된 피하 주사기 바늘을 사용합니다. 상처는 가슴 벽의 평면에 평행 한되어 있는지 확인합니다. 근육의 꼬리 부분이 출시되면, 가슴 벽을 통해 근육 아래 핀으로 다른 피하 주사기 바늘을 삽입 -이 준비를 움직이게하고 포셉 (그림 3 층)를 사용하여 근육에 부드러운 풀을 발휘 할 수 있습니다. 당신은 결합 tiss를 절단하기 때문에UE의 삽입, "껍질"떨어져 가슴의 근육. 봄 가위로 마지막 꼬리 첨부 파일을 자른다. 집게를 사용하여 지방과 혈액 혈관 유적을 제거합니다. . 라이브 및 고정 조직 작업을위한 도구와 요리 별도의 세트를 사용하여 신경을 멀리 추출하지 않습니다주의하십시오.
4. 실온에서 흔드는에서 1 시간에 차단 솔루션으로 조직 샘플을 전송하여 immunohistochemistry를 (표준 프로토콜을 사용하여)를 시작합니다. 착색에 대한 가능한 가장 작은 볼륨 96 - 웰 플레이트를 사용하여 200 μl입니다.
5. 4에 밤새 차단 솔루션, 잘 당 200 μl, ° 흔드는에서 C에 희석 주요 항체을 적용합니다.
6. 10 분에 0.01 M PBS 세 번에 씻으십시오.
7. 솔루션을 차단에 희석 실온에서 1-2 시간에 적합 차 항체을 적용합니다.
8. 10 분에 0.01 M PBS 세 번에 씻으십시오.
9. 반 변색 매체 (예 Vectashield)와 coverslip에 탑재합니다.
10. 자기 금속 접시에 장소 슬라이드, 상단에 장소 자석4 ° C.에서 몇 시간이나 야간에 평평하게 할 수있는 샘플의 매니큐어와 함께 밀봉합니다.

결과

이미징 요리 준비 triangularis sterni의 explant의 예는 그림 1G에 표시됩니다. triangularis 근육이 근육 섬유의 몇 층으로 만 구성으로 explant는 영상 NMJs 예를 생체에 특히 적합합니다. 이 유전자 변형 마우스 라인에서 파생 explants에서 고해상도 이미지를 얻을 수 있도록하는 하이라이트 SCS (PLP-GFP ²⁾ 및 / 또는 axons (Thy1-XFP ¹⁾ 중. 고품질 영상을위한 중요한 요?...

토론

여기에 제시된 SC 표백 방법은 간단 신속하고 다양한입니다은 (i)는 하나의 transgene에 따라 공 촛점 현미경에 의해 단일 SC의 형태와 역학을 공개 가능 - 추가 대립 유전자를 필요로 질병 모델로 접근 예를 결합 할 때 상당한 장점 . 해부에서 고정으로 절반이 하루에 수행 할 수 있으므로 (ii) 본 방법은 빠른 것입니다. 이 같은 셀 ablations, 이미징 세포 소기관, 전기 생리학 또는 immunohistochemistry와...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사 (예)	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
70 % (권 / 권) 에탄올 솔루션	로스	T913.1	스프레이 병에
isoflurane	Forene, 애보트		다른 승인 된 마취가 치명적인 마취 사용할 수 있습니다
유전자 변형 마우스 (PLP-GFP)			인용 출처에서 획득 할
추위에 빛 조명과 해부 현미경	올림푸스 SZ51		SCHOTT KL 1500 LCD가 장착
포셉 #이	정밀 과학 도구	11233-20
포셉 # 5	정밀 과학 도구	11295-00
가위, 대형 의료	정밀 과학 도구	14108-09
가위, 작은 각진 봄	정밀 과학 도구	15033-09
인라인 (in-line) 히터	워너 악기	SF-28
3.5 cm 요리에 링을 가열	워너 악기	64-0110 DH-35
이 채널 온도 제어 시스템	워너 악기	TC-344B
superfusion 펌프 시스템			주문품의
15 cm 조직 문화 요리	Sarstedt	83.1803.003	얼음 가득과 금속 플레이트에 의해 적용
10 cm 조직 문화 요리	Sarstedt	83.1802.003	산소 벨소리의 솔루션
3.5 cm 조직 문화 요리	Sarstedt	83.1800.003	Sylgard 폴리머로 가득
Sylgard 폴리머	다우 코닝	Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트
공 촛점 현미경	하늘	FV1000	아르곤 레이저로
50 ML 반응 관	Sarstedt	62.547.254 PP
PBS의 4퍼센트 PFA	시그마	P6148
캐뉼라 0.5 mm X 25mm	Neolab	E-1510
주사기 1 ML	Neolab	E-1496
synaptophysin 항체	Invitrogen	18-0130	토끼
이차 항체	Invitrogen	A-11012	알렉사 594
24 잘 판	Sarstedt	83.1836
0.01 M PBS	시그마	P4417
PBS에 0.​​1 M 글리신	로스	3790.1
coverslips	Neolab	E-4132
슬라이드	Neolab	E-4121
Vectashield	벡터 실험실	H-1000
minutien 핀 × 10	정밀 과학 도구	26002-20	<4 mm까지 단축
α-Bungarotoxin 알렉사 594에 커플 링	Invitrogen (분자 프로브)	B-13423
			솔루션을 차단
0.01 M PBS
0.2 % 트리톤 - X100	로스	3051.3
10% 일반 염소 세럼	Abcam	ab7481
1퍼센트 소 혈청 알부민	시그마	A7030
			종을 울리는 사람 95% O 5분의 2 %의 CO 2 부풀어 오른
125 MM NaCl	시그마	S7653
2.5 MM KCl	시그마	P9333
1.25 MM 아뇨 2 PO 4	시그마	S8282
26 MM NaHCO 3	시그마	S6297
이 MM CaCl 2	시그마	21,114
1 ㎜ MgCl 2	시그마	63,020
20 MM 포도당	시그마	G7528
			표 1. 특정 시약 및 장비.