Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare

Riepilogo

Visualizzare le singole celle di densamente tessuti confezionati, come le cellule di Schwann terminali (SC) a giunzioni neuromuscolari (NMJs), è una sfida. "Sequenziale foto-bleaching" permette di delineare SC singolo terminale, per esempio nel triangularis espianto muscolo Sterni, un comodo nervo-muscolo preparazione, dove sequenziale sbiancamento può essere combinato con time-lapse imaging e Post-hoc Immunostainings.

Abstract

Sequenziale foto-sbiancamento fornisce un modo non invasivo per etichettare i singoli CS al NMJ. Il NMJ è il più grande sinapsi del sistema nervoso dei mammiferi ed è servito da guida modello per studiare la struttura e la funzione sinaptica. Nel topo NMJs terminali motore assoni formano pretzel-come siti di contatto con le fibre muscolari. L'assone motore e il terminale sono rivestiti da SCS. Negli ultimi decenni, diversi topi transgenici sono stati generati per visualizzare i motoneuroni e SCS, per esempio Thy1-XFP ¹ e Plp-GFP topi ^2, rispettivamente.

Lungo assoni motori, mielinizzanti SC assoni sono disposti in internodi non sovrapposte, separate da nodi di Ranvier, per consentire saltatoria propagazione del potenziale d'azione. Al contrario, CS terminali a sinapsi sono specializzate cellule gliali, che monitorano e promuovere la neurotrasmissione, digerire detriti e guida assoni rigeneranti. NMJs sono strettamente coperti fino a una mezza dozzina di non MYELinating SCs terminali - questi, però, non può essere risolto singolarmente al microscopio ottico, in quanto sono in contatto diretto membrana ^3.

Esistono diversi approcci per visualizzare singolarmente SC terminale. Nessuno di questi è impeccabile, però. Per esempio, il riempimento colorante, dove sono impalato singole cellule con un colorante pieno microelettrodo, richiede la distruzione di una cellula marcato prima di occupare un secondo. Questo non è compatibile con le successive registrazioni time-lapse ^3. Multispettrale etichettatura "Brainbow" di SCS è stato ottenuto utilizzando l'espressione di proteine ​​fluorescenti combinatorio ^4. Tuttavia, questa tecnica richiede che unisce transgeni diversi ed è limitato dal pattern di espressione dei promotori utilizzati. In futuro, espressione di "foto-commutabili" proteine ​​CS potrebbe essere ancora un'altra alternativa ^5. Qui vi presentiamo in sequenza foto-sbiancamento, in cui le cellule singole sono sbiancati, e la loro immagine ottenuta per sottrazione. Noi crediamoche questo approccio - per la facilità e versatilità - rappresenta un'aggiunta duratura palette tecnologia del neuroscienziato, soprattutto in quanto può essere utilizzato in vivo e trasferito altri tipi cellulari, siti anatomici o specie ^6.

Nel seguente protocollo, abbiamo dettaglio l'applicazione sequenziale di sbiancamento e successiva confocale time-lapse microscopia a CS terminali in triangularis espianti muscolari Sterni. Questo sottile, superficiale e facilmente sezionato nervo-muscolo preparazione ^7,8 si è dimostrato utile per lo studio di NMJ sviluppo, fisiologia e patologia ^9. Infine, viene spiegato come il muscolo triangularis sterni è disposta dopo la fissazione per eseguire correlata ad alta risoluzione imaging confocale, immunoistochimica o esami ultrastrutturali.

Protocollo

1. Triangularis Sterni Espianto (Figura 1)

Timing: 15 min.

1. Preparare gli strumenti chirurgici: 2 paia di pinze, 1 paio di forbici, 1 paio di forbici a molla, 1 piatto coltura tissutale (10 cm). Pre-bolle (minimo per 15 min) raffreddato (4 ° C), soluzione di Ringer con il 5% di CO _2/95% O _2. Fill 15 cm piatto di coltura di tessuti con ghiaccio e coprire con piastra metallica. Preparare microscopio dissezione e posizionare il piatto di 15-cm con ghiaccio sotto la portata dissezione per raffreddare l'espianto durante la dissezione.
2. Letalmente anestetizzare il mouse per overdose isoflurano (o qualsiasi altro metodo approvato di sacrificio). Spruzzare il mouse con etanolo al 70% per evitare la contaminazione del pelo espianto. Per SC candeggio, abbiamo usato Plp-GFP topi, che possono essere attraversati a Thy1-OFP3 o Thy1-Membow13 per la visualizzazione simultanea del assone.
3. Utilizzando la coppia di forbici grandi, fare una incisione mediana dila pelle sopra lo sterno e due incisioni parallele al bordo inferiore della gabbia toracica.
4. Utilizzando il paio di forbici grandi, togliere la pelle, aprire la parete addominale, e fare incisioni parallele alla gabbia toracica tutta la strada fino alla colonna vertebrale. Poi sezionare fuori i muscoli pettorali facendo incisioni vicino all'inserzione muscolo sterno.
5. Tagliare il diaframma aperto appena sotto la cartilagine xifoide e sezionare fuori la membrana lungo i suoi inserimenti costiere.
6. Con la gabbia toracica dal processo xifoideo con una serie di pinze, iniziare a tagliare le nervature largo della colonna vertebrale, il più vicino possibile alle loro inserimenti. I tagli sinistro e destro dovrebbero convergere sopra il cuore verso il manubrio sterni. Cercate di evitare di tagliare i vasi sanguigni principali (in particolare le vene succlavia). Migliore visibilità si ottiene sollevando delicatamente la preparazione mentre si tiene sul processo xifoideo con una pinza.
7. Eseguire un taglio trasversale appena sotto il manubrio sternie trasferire il espianto nel 10 cm piatto con raffreddato CO 5% _2/95% O _{2-gorgogliare} Ringer soluzione. Posizionare il 10-cm piatto sulla piastra metallica che copre il 15-cm piatto di coltura di tessuti pieno di ghiaccio. Tutte le ulteriori misure deve essere effettuato sotto il microscopio dissezione.
8. Usando le forbici a molla piccole rimuovere i resti di timo, pleura, membrana (interno) e dei muscoli pettorali (al di fuori, la figura 1B-D).
9. Per adattare l'espianto al 3,5 cm piatto, sezionare fuori tutte le costole che non inseriscono allo sterno. Questo è fatto meglio con le forbici a molla piccole e tagliare il tessuto tra le costole (Figura 1E).
10. Pin il triangularis sterni nervo-muscolo espianto nel Sylgard rivestito 3,5 cm piatto di coltura utilizzando perni minutien (ridotto a <4 mm; Figura 1G). Due perni dovrebbe passare attraverso cartilaginei (bianco) parti dello sterno. Inserire almeno due perni attraverso le nervature sia sul lato destro e sinistro di thespianto e puntando le parti più molli cartilaginei e evitando le costole sotto o vicino al muscolo triangularis. I perni vengono utilizzati più, tanto meglio (si utilizzano in genere 8-10). Come definire con precisione la preparazione, fare in modo che le costole sono alquanto diffuse, che fissa il muscolo in una posizione leggermente allungato.
11. Opzionale: Visualizza siti sinaptici contengono recettori con l'aggiunta di coloranti bungarotossina accoppiato ad Alexa (concentrazione di 0,8 mg / ml in 5% di CO _2/95% O _{2-gorgogliare} Ringer soluzione). Incubare espianto bloccato in Sylgard piatto rivestito per 15-20 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare più volte con il 5% di CO _2/95% O _{2-gorgogliare} Ringer soluzione.

2. SC sbianca e opzionale microscopia time-lapse (Figura 2)

Timing: 30 - 45 min + opzionale 1-5 ore per il lasso di tempo.

1. Transfer 3,5 cm Sylgard rivestito piatto per uno spirito microscopio confocale dotatoh un laser ad argon (488 nm) e gli obiettivi di immersione in acqua (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA e 100x, 1.0 NA o 60x, 0.9 NA).
2. Opzionale per time-lapse microscopia: Insert 3,5 cm Sylgard rivestito piatto in anello di riscaldamento, installare il sistema superfusione e sonda di temperatura (Figura 2A). Assicurarsi che nessuna di esse toccano l'espianto, il bordo del piatto o il rivestimento Sylgard. Riscaldare il campione a 33-35 ° C. Per SC sbiancamento senza time-lapse, temperatura ambiente è meglio, come le cellule mostrano una dinamica inferiore tra passi sbiancamento.
3. Con un obiettivo 4x aria osservare modello innervazione del muscolo triangularis sterni e trovare triangularis banda endplate sterni. Passa a 20x immersione-cone obiettivo e iniziare la ricerca per le regioni superficiali all'interno della banda di placca motrice (costole sovrastanti aree sono buoni candidati). Cambiare obiettivo di 100x o 60x immersione cono obiettivo di controllare NMJs individuali. Ideale è un NMJ che è coperto da SC diverse e si trova molto superficially (Figura 2B). Se si esegue time-lapse imaging dopo lo sbiancamento, selezionare fino a 3 NMJs che sono relativamente vicine tra di loro per aumentare il rendimento.
4. Acquisire una immagine confocale del NMJ prima fotometabolismo SCs individuali (Figura 2B). (Per l'imaging piena risoluzione, ad esempio su un microscopio Olympus FV1000, utilizzare un 100x, 1,0 e 2,5 NA obiettivo zoom, che si traduce in Nyquist-limitata campionamento di ~ 0,1 micron per pixel.)
5. "Park" del fascio laser 488 nm centralmente sul nucleo di una SC con potenza massima per 5 secondi (in alternativa un modello di scansione efficiente in una piccola regione di interesse può essere usato, come il "tornado Scan" su un microscopio Olympus; come si usa un microscopio confocale, il laser viene focalizzato in immagine-coniugati piani e quindi, a 488 nm, con un obiettivo di 1,0 NA, <0,5 mm di diametro). Nuovamente concentrarsi sulla cella e giudice sbiancamento risultato. Se necessario ripetere lo sbiancamento passo di nuovo fino a quando i livelli di GFP sono ridurred per quasi sfondo livelli. Acquisire un'immagine dopo sbianca (Figura 2C). È importante assicurarsi che la regione sbiancato è fuori di sovrapposizione tra due celle - se vi è sovrapposizione, sbiancamento in una seconda cella sarà evidente.
6. Ripetere il passaggio precedente finché tutti tranne uno SC sono sbiancati (Figura 2D-E). L'ultimo "greggi" SC è adatto per confocale microscopia time-lapse. Ricostruire singole cellule per sottrazione di immagini, ad esempio utilizzando il software Photoshop, a delineare la morfologia singolo SC e territorio (Figura 2F). Essere consapevoli del fatto che la sottrazione di due maghi ulteriore fattore di disturbo (ad esempio mediante l'importazione in consecutivi "strati" in Photoshop e quindi impostando il canale superiore per "differenza" nel menu a discesa nella parte superiore della scheda canali). Questo può essere aggirato utilizzando la funzione "Antipolvere" sui canali prima di sottrarre e il ritaglio via qualsiasi sfondo che, ovviamente, non ha origine dalcella sbiancato. Per ottimizzare il contrasto, può essere necessario regolare la luminosità dei due canali nella finestra "livelli". L'immagine risultante della cella sbiancato è sovrapposto l'immagine originale di una sinapsi, pseudo-colore in una tonalità unica e reso trasparente per colorare il territorio della cella sbiancato nell'immagine originale (dal fare questo per tutte sbiancato e l'ultimo , le cellule greggi l'immagine mostrata in figura risultati 2F).
7. Optional: Start confocale time-lapse microscopia dopo lo sbiancamento tutti tranne uno SC. Prendete un'immagine ad intervalli fissi (per esempio ogni 5 a 10 min). Uso come potenza laser meno possibile. Fino a 3 NMJs possono essere esposte alla stessa sessione.
8. Fare una mappa delle e ritardi NMJs prendendo una immagine a 100x senza zoom, quindi immagini della regione con 20x e obiettivi 4x (Figura 2G-I). Questa "mappa" è necessario per trovare NMJs seguito immunoistochimica di un muscolo fissa.
9. Per immaginielaborazione, convertire le immagini in singole proiezioni di massima intensità e salvare in formato tiff. Combinare tutti gli z-proiettate time-point in una pila e allineare in xy, per esempio usando il plugin "stackreg" ¹⁰ nelle isole Figi (un pacchetto basato sul software open source ImageJ, National Institutes of Health).

3. Fissazione e immunoistochimica (Figura 3)

Timing: Pernottamento.

1. Trasferire l'espianto in un 50-ml tubo di reazione contenente almeno 15 ml 4% PFA rimuovendo con cura i perni. Post-fissare la parete toracica anteriore contenente il muscolo triangularis sterni per 1 ora su ghiaccio. Risciacquare tessuto fissato con 0,1 M glicina in PBS (per estinguere fissativo residuo e quindi ridurre background) per almeno 10 min. I campioni possono essere conservati a questo punto ed elaborare successivamente.
2. Trasferimento espianto fissa a una parabola di 10 cm tessuto rivestito cultura Sylgard pieno di 0,01 M PBS. Tagliare una forma trapezoidale con un SIde parallelo allo sterno e l'altro attraverso i osso-cartilagine transizioni - questo contiene il muscolo triangularis sulla sua superficie. Rimuovere costole inferiori con una orizzontale (trans-sternale) tagliate in modo che l'estremità caudale del muscolo triangularis sono liberamente accessibili (Figura 3A-D).
3. Inserire un ago ipodermico come perno nella parte superiore del trapezio (Figura 3E). Utilizzare un ago ipodermico attaccato ad una siringa da 1 ml e pinze per rimuovere il muscolo triangularis sulla superficie delicatamente trattenendo un angolo caudale del muscolo e utilizzando l'ago come un micro-bisturi. Assicurarsi che i tagli sono fatti parallelo al piano della parete toracica. Una volta che la parte caudale del muscolo viene rilasciato, inserire un altro ago ipodermico come un perno sotto il muscolo attraverso la parete toracica - questo immobilizza la preparazione e consente di esercitare una leggera trazione sul muscolo con pinze (Figura 3F). Come si sta tagliando pap connettiviinserzioni ue, "pelare" via il muscolo dal torace. Tagliare ultimo attacco caudale con le forbici a molla. Rimuovere residui di grasso e di sangue dei vasi con una pinzetta. Fare attenzione a non strappare i nervi. Nota: Utilizzare gruppi separati di strumenti e piatti per lavorare con il tessuto vivo e fissa.
4. Avviare immunoistochimica (utilizzando un protocollo standard) trasferendo campioni di tessuto in una soluzione bloccante per 1 ora su un agitatore a temperatura ambiente. Più piccolo volume possibile per la colorazione è di 200 microlitri utilizzando una piastra a 96 pozzetti.
5. Applicare l'anticorpo primario diluito in una soluzione bloccante, 200 pl per pozzetto, overnight a 4 ° C su un agitatore.
6. Lavare in 0,01 M PBS tre volte per 10 min.
7. Applicare adatto anticorpo secondario per 1-2 ore a temperatura ambiente, diluito in soluzione di blocco.
8. Lavare in 0,01 M PBS tre volte per 10 min.
9. Montare in anti-fading medio (ad es Vectashield) e applicare il coprioggetto.
10. Disporre il vetrino sul piatto di metallo magnetico, magnete posto in cimadel campione per appiattire per alcune ore o durante la notte a 4 ° C. Sigillare con lo smalto.

Risultati

Un esempio di un espianto triangularis sterni piatto pronto per l'imaging è mostrato in Figura 1G. Questo espianto è particolarmente adatto per l'imaging NMJs ex vivo come il muscolo triangularis consiste solo di pochi strati di fibre muscolari. Ciò permette di ottenere immagini ad alta risoluzione da espianti derivati ​​da linee di topi transgenici che evidenziano sia SCS (Plp-GFP ²⁾ e / o (assoni Thy1 ^XFP-1). Fattori critici per l'ima...

Discussione

Il metodo SC sbiancamento qui presentato è semplice, veloce e versatile: (i) Permette rivelando singola SC morfologia e dinamiche mediante microscopia confocale basato su un singolo transgene - che è un vantaggio significativo quando si associa l'es approccio con modelli di malattia che richiedono alleli aggiuntivi . (Ii) Il metodo è veloce, come da dissezione del fissaggio può essere eseguito in mezza giornata. (Iii) Il numero di applicazioni è ampio, in quanto può essere combinato con altri metodi, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda (esempio)	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Soluzione di etanolo al 70% (vol / vol)	Roth	T913.1	in flacone spray
isoflurano	Forene, Abbott		qualsiasi altro approvato anestetico può essere utilizzato per l'anestesia letale
topi transgenici (PLP-GFP)			essere ottenute da fonti citate
microscopio dissezione a freddo, luce di illuminazione	Olympus SZ51		dotato Schott KL 1500 LCD
pinza #2	Strumenti Scienza Belle	11233-20
pinze # 5	Strumenti Scienza Belle	11295-00
forbici, grandi medici	Strumenti Scienza Belle	14108-09
forbici, piccolo primavera angolato	Strumenti Scienza Belle	15033-09
in linea riscaldatore	Warner Instruments	SF-28
riscaldamento ad anello per 3.5 cm di piatti	Warner Instruments	64-0110 DH-35
due canali temperatura del sistema di controllo	Warner Instruments	TC-344B
superfusione pompa sistema			custom-built
15 cm tessuto piatto di coltura	Sarstedt	83.1803.003	riempito con ghiaccio e coperto da lamiera
10 cm tessuto piatto di coltura	Sarstedt	83.1802.003	con soluzione Ringer ossigenato di
3,5 cm tessuto piatto di coltura	Sarstedt	83.1800.003	riempito con Sylgard polimero
Sylgard polimero	Dow Corning	Sylgard 184 Kit di silicone elastomero
microscopio confocale	Olimpo	FV1000	con argon laser
50 ml provettone	Sarstedt	62.547.254 PP
4% in PBS PFA	Sigma	P6148
cannula 0,5 millimetri x 25 mm	Neolab	E-1510
siringa da 1 ml	Neolab	E-1496
sinaptofisina anticorpo	Invitrogen	18-0130	coniglio
anticorpo secondario	Invitrogen	A-11.012	Alexa 594
24-pozzetti	Sarstedt	83,1836
0,01 M PBS	Sigma	P4417
0,1 M glicina in PBS	Roth	3.790,1
coprioggetti	Neolab	E-4132
diapositive	Neolab	E-4121
Vectashield	Vector laboratori	H-1000
perni minutien × 10	Strumenti Scienza Belle	26002-20	abbreviato <4 mm
α-bungarotossina accoppiato ad Alexa 594	Invitrogen (Molecular Probes)	B-13423
			Blocking Solution
0.01 M PBS
0,2% Triton-X100	Roth	3.051,3
10% di siero di capra	Abcam	ab7481
1% di albumina di siero bovino	Sigma	A7030
			Ringer gorgogliare con il 95% O 2/5% di CO 2
125 mM NaCl	Sigma	S7653
2,5 mM KCl	Sigma	P9333
1,25 mm NaH 2 PO 4	Sigma	S8282
26 mm NaHCO 3	Sigma	S6297
2 mM CaCl 2	Sigma	21114
1 mM MgCl 2	Sigma	63020
20 mM di glucosio	Sigma	G7528
			Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche.