Последовательное фото-отбеливание разграничить отдельные клетки шванновских в нервно-мышечном соединении

Резюме

Визуализация отдельных клеток в плотно упакованных тканей, таких как терминал шванновских клеток (СК) в нервно-мышечных соединениях (NMJs), является сложной задачей. "Последовательное фото-отбеливание» позволяет разграничения одного КА терминала, например, в трицепс мышцы грудины эксплантов, удобный нервно-мышечного препарата, где последовательного отбеливания могут быть объединены с покадровой обработки изображений и Апостериорных Immunostainings.

Аннотация

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP¹ and Plp-GFP mice², respectively.

Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact³.

Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings³. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins⁴. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative⁵. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species⁶.

In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation^7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology⁹. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

протокол

1. Triangularis Стэрни эксплантов (рис. 1)

Хронометраж: 15 мин.

1. Подготовка хирургического инструмента: 2 пары щипцов, 1 ножницы, 1 пара ножниц весны, 1 ткань культуры блюдо (10-см). Предварительно пропускают (минимум 15 минут) охлажденного (4 ° C) раствор Рингера с 5% CO _2/95% O _2. Заполнить 15-см ткань культуры блюдо со льдом и покрыть ее металлической пластиной. Подготовка рассечение микроскопом и поместите 15-см блюдо со льдом при вскрытии рамки для того, чтобы охладить эксплантов во время вскрытия.
2. Смертельно анестезию мыши, изофлурана передозировки (или любые другие проверенные методы жертвоприношения). Спрей мышь с 70% этанола для предотвращения загрязнения меха эксплантов. Для SC отбеливания, мы использовали Plp-GFP мышей, которые могут быть пересечены в Thy1-OFP3 или Thy1-Membow13 для одновременной визуализации аксонов.
3. Используя пару больших ножниц, сделать срединный разрезкожу над грудиной и два разреза параллельно нижнему краю грудной клетки.
4. Используя пару больших ножниц, снять кожу, откройте брюшной стенки, и делать разрезы параллельно грудной клетке все пути назад к позвоночнику. Затем рассекают от грудных мышц, сделав надрезы близкий к мышце вставки на грудину.
5. Разрежьте диафрагму открытой чуть ниже мечевидного хряща и рассекают от диафрагмы вдоль реберной вставками.
6. Проведение грудную клетку от мечевидного отростка с набором щипцов, начинают бросать ребра от позвоночника, как можно ближе к их вставки. Левая и правая сокращения должны сходиться над сердцем к рукояткой грудины. Старайтесь избегать резки крупных кровеносных сосудов (особенно подключичной вены). Лучшая видимость достигается за счет осторожно приподнимая подготовки, держась мечевидного отростка щипцами.
7. Сделайте поперечный разрез чуть ниже рукоятки грудиныи передать эксплантов в 10-см блюдо с охлаждением 5% CO _2/95% O _{2-пропускали} раствор Рингера. Поместите 10-см антенну на металлическую пластину, закрывающую 15-см ткань культуры блюдо со льдом. Все дальнейшие шаги следует сделать при вскрытии микроскопом.
8. Используя маленькие ножницы весной удалить остатки вилочковой железы, плевры, диафрагмы (внутренней) и грудных мышц (за пределами; рис. 1б-D).
9. Для установки эксплантов к 3,5-см тарелку, рассекают с себя все ребра, которые не вставляют к грудине. Это лучше всего сделать с помощью небольших ножниц весной и резки тканей между ребрами (рис. 1E).
10. Pin трицепс грудины нервно-мышечного эксплантов в Sylgard покрытием 3,5-см ткань культуры блюдо minutien использованием штифтов (сокращено до <4 мм; Рисунок 1G). Два вывода должны пройти через хрящевую (белые) части грудины. Вставьте по крайней мере, два вывода через ребра как на левой и правой стороне йэлектронной эксплантов стремится к более мягкой хрящевой части и избегать ребра под или рядом с трицепс мышцы. Чем больше контактов используется, тем лучше (мы обычно используем 8-10). Как вы придавить подготовки, убедитесь, что ребра несколько распространился, фиксируя мышцы в чуть вытянутом положении.
11. Дополнительно: визуализировать синаптическую сайтов, содержащих рецепторы ацетилхолина, добавив bungarotoxin связан с Alexa красителей (концентрации 0,8 мкг / мл в 5% CO _2/95% O _{2-пропускали} раствор Рингера). Инкубируйте возлагали эксплантов в Sylgard покрытием блюдо в течение 15-20 мин при комнатной температуре, затем промыть несколько раз с 5% CO _2/95% O _{2-пропускали} раствор Рингера.

2. Отбеливание ПК и дополнительно замедленной микроскопии (рис. 2)

Сроки: 30 - 45 мин + дополнительно 1 - 5 ч в течение промежутка времени.

1. Передача 3,5-см Sylgard покрытием блюдо конфокальной микроскопии оборудованы остроумиеч аргонового лазера (488 нм) и погружение в воду цели (4x, 0,13 NA; 20x, 0,5 НС и 100x, 1,0 НС или 60x, 0,9 NA).
2. Дополнительно для покадровой микроскопии: Insert 3,5-см Sylgard покрытием блюдо в кольце отопления, установка системы superfusion и датчик температуры (рис. 2A). Убедитесь, что ни один из них касаются эксплантов, край тарелки или покрытия Sylgard. Нагрева образца до 33-35 ° C. Для SC отбеливания без покадровой, комнатной температуры лучше, как клетки показать меньше динамики между отбеливания шаги.
3. С целью 4x воздуха наблюдается иннервации картина трицепс мышцы грудины и найти трицепс концевой пластинки грудины группы. Переключить на 20x погружения конуса цель и начать искать поверхностные регионов в концевой пластинки группы (ребра областей вышележащих являются хорошими кандидатами). Изменение целью 100x 60x или погружением конуса целью проверки на отдельных NMJs. Идеально является NMJ, которая покрыта несколькими ПК и расположен очень superficially (рис. 2В). Если вы выполняете покадровой визуализации после отбеливания, выбрать до 3 NMJs, которые относительно близко друг к другу для повышения урожайности.
4. Приобретать конфокальной изображения NMJ перед фото-отбеливание отдельных СЭ (рис. 2В). (Для полного изображения разрешение, например, на Olympus FV1000 микроскопом, использовать 100x, 1,0 NA цель и 2,5 масштаба, в результате чего Найквиста ограниченной выборки ~ 0,1 мкм на пиксель).
5. «Парк» 488 нм лазерный луч по центру ядра SC использованием максимальной мощности в течение 5 секунд (по выбору эффективной структуры сканирования в небольшой области интереса могут быть использованы, например, "Торнадо сканирования" функции на микроскопе Olympus; как мы используем в конфокальный микроскоп, лазер фокусируется в образ-сопряженных плоскостей и, следовательно, при 488 нм с целью 1,0 Н.А., <0,5 мкм в диаметре). Повторно сосредоточиться на клетку и судья отбеливания результат. При необходимости повторите шаг отбеливания снова, пока GFP уровни сниженияг почти до фонового уровня. Получить изображение после отбеливания (рис. 2С). Очень важно, чтобы убедиться, что беленой регион находится за пределами какого-либо дублирования между двумя ячейками - если есть перекрытие, отбеливание во второй ячейке будет очевидным.
6. Повторите шаг выше, пока все, кроме одного SC отбеливаются (рис. 2D-E). Последний "небеленой" SC подходит для конфокальной покадровой микроскопии. Реконструкция одной клетки путем вычитания изображений, например, с помощью Photoshop программного обеспечения, чтобы очертить одним морфологии SC и территории (рис. 2F). Помните, что вычитания двух магов добавляет шум (например, путем их импорта в последовательных "слои" в Photoshop, а затем установив верхний канал "разница" в выпадающем меню в верхней части вкладки каналов). Это можно обойти, используя "Удаление пятен" функции на каналах перед вычитанием и обрезки от любой фон, который, очевидно, не происходят избеленой клетки. Для оптимизации Напротив, это может быть необходимо отрегулировать яркость двух каналов в "уровнях" окна. В результате изображение беленой ячейки накладывается на исходное изображение синапса, псевдо-окрашен в уникальный цвет и сделать более прозрачными, чтобы покрасить на территории беленой ячейки в исходное изображение (от делаю это для всех беленой и последний , небеленой клеток изображение, показанное на рис результаты 2F).
7. Дополнительно: Начало конфокальной покадровой микроскопии после отбеливания все, кроме одного КА. Возьмите изображений через определенные промежутки времени (например, каждые 5 до 10 минут). Использование в качестве мало энергии лазерного насколько это возможно. До 3 NMJs может быть отображена на той же сессии.
8. Сделать карту временем истек NMJs, взяв изображение в 100 раз без зума, то образы регионе с помощью 20x и 4x целей (рис. 2G-I). Эта «карта» необходимо найти NMJs после иммуногистохимии фиксированной мышцы.
9. Для изображенияобработки, преобразования отдельных изображений в максимальной интенсивностью прогнозы и сохранить в формате TIFF. Смешайте все Z-прогнозируемых временных точках в стек и привести в ху, например, с помощью "stackreg" плагин ¹⁰ в Фиджи (пакет на основе открытого программного обеспечения ImageJ; Национальные Институты Здоровья).

3. Фиксация и иммуногистохимии (рис. 3)

Сроки: Ночь в отеле.

1. Передача эксплантов в 50-мл реакционную трубку содержащий по меньшей мере 15 мл 4% PFA тщательно удаляя булавки. Сообщение, исправить передней грудной стенки содержащие трицепс мышцы грудины в течение 1 часа на льду. Промыть фиксированной ткани с 0,1 М глицина в PBS (чтобы утолить остаточной фиксатор и, следовательно, уменьшить фоновый), по крайней мере, 10 мин. Образцы могут храниться в этой точке и последующей обработки.
2. Передача фиксированной эксплантов на 10-см Sylgard покрытием блюдо культуры ткани заполнены 0,01 М PBS. Вырежьте форму трапеции с одной сиде параллельно грудины и другой через кости с хрящом переходов - содержит трицепс мышцы на его поверхности. Удалите нижние ребра с горизонтальной (т.е. транс-грудины), разрезанный так, что хвостовой конец трицепс мышцы могут быть свободно доступны (рис. 3А-D).
3. Вставьте иглу для подкожных инъекций, как штифт в верхнюю часть трапеции (Рис. 3E). С помощью иглы для подкожных инъекций прикреплены к 1 мл шприц и щипцы для удаления трицепс мышцы на поверхность, аккуратно держа на хвостовом углу мышц и с помощью иглы микро-скальпель. Убедитесь в том, что сокращения производятся параллельно плоскости грудной стенки. После хвостовой части мышцы освобожден, вставить другую иглу для подкожных инъекций, как контактный под мышцу через грудной стенки - это удерживает подготовки и позволяет оказывать нежно тянуть на мышцы с помощью пинцета (рис. 3F). Как вы резки соединительной Tissие вставки, "корка" от мышцы грудной клетки. Вырезать последних хвостовых вложения с весны ножницы. Удалите жир и остатки кровеносных сосудов с помощью пинцета. Будьте осторожны, чтобы не сорвать от нервов. Примечание: Используйте отдельные наборы инструментов и посуды для работы с живыми и фиксированной ткани.
4. Начало иммуногистохимии (с использованием стандартного протокола) путем перечисления образцов тканей в блокирующем растворе в течение 1 ч на качалке при комнатной температуре. Наименьший возможный объем для окрашивания 200 мкл использованием 96-луночный планшет.
5. Применить первичных антител разводят в блокирующем растворе, 200 мкл на лунку, в течение ночи при 4 ° С на качалке.
6. Стирать в 0,01 М PBS три раза в течение 10 мин.
7. Нанесите подходящий вторичными антителами в течение 1-2 часов при комнатной температуре разводят в блокировании решения.
8. Стирать в 0,01 М PBS три раза в течение 10 мин.
9. Установите в борьбе с замирание среды (например Vectashield) и покровное.
10. Место слайдов на магнитной металлической пластины, место магнит на вершинеобразца для выравнивания в течение нескольких часов или в течение ночи при 4 ° C. Печать с лаком для ногтей.

Результаты

Пример трицепс эксплантов грудины готовы для работы с изображениями блюдо показано на рисунке 1G. Это эксплантов особенно подходит для визуализации естественных NMJs бывших, как трицепс мышцы состоит только из нескольких слоев мышечных волокон. Это позволяет получать...

Обсуждение

SC метод отбеливания, представленные здесь, простой, быстрый и универсальный: (I) Оно позволяет выявить одну SC морфологии и динамики с помощью конфокальной микроскопии на основе одного трансгенного - что является существенным преимуществом при объединении подход, например, с болезн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания (пример)	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
70% (объем / объем) раствор этанола	Рот	T913.1	В распылитель
изофлуран	Forene, Abbott		любых других утвержденных анестетика может быть использован для смертельного анестезии
трансгенных мышей (PLP-GFP)			которые будут получены от источников цитируется
рассечение микроскопом с холодным светом освещения	Olympus SZ51		оснащен Schott KL 1500 LCD
Щипцы #2	Средства изобразительных наук	11233-20
Щипцы № 5	Средства изобразительных наук	11295-00
ножницы, крупные медицинские	Средства изобразительных наук	14108-09
ножницы, небольшие угловые весны	Средства изобразительных наук	15033-09
в линию нагреватель	Warner Instruments	SF-28
нагревания кольца для 3,5-см блюд	Warner Instruments	64-0110 DH-35
двухканальная система контроля температуры	Warner Instruments	TC-344B
Система superfusion насоса			изготовленный на заказ
15-см ткань культуры блюдо	Sarstedt	83.1803.003	со льдом и покрыта металлической пластиной
10-см ткань культуры блюдо	Sarstedt	83.1802.003	Решение с кислородом Рингер
3,5-см ткань культуры блюдо	Sarstedt	83.1800.003	заполнена Sylgard полимеров
Sylgard полимеров	Dow Corning	Sylgard 184 Силиконовый эластомер Kit
конфокальной микроскопии	Олимп	FV1000	с аргоновым лазером
50-мл реакционную трубку	Sarstedt	62.547.254 PP
4% PFA в PBS	Сигма	P6148
канюли 0,5 мм х 25 мм	НЕОЛАБ	E-1510
Шприц 1 мл	НЕОЛАБ	E-1496
синаптофизин антител	Invitrogen	18-0130	кролик
вторичными антителами	Invitrogen	A-11012	Alexa 594
24-луночный планшет	Sarstedt	83,1836
0,01 М PBS	Сигма	P4417
0,1 М глицина в PBS	Рот	3790,1
покровные	НЕОЛАБ	E-4132
слайдах	НЕОЛАБ	E-4121
Vectashield	Vector Labs	H-1000
minutien контактов × 10	Средства изобразительных наук	26002-20	сокращено до <4 мм
α-Bungarotoxin связан с Alexa 594	Invitrogen (Molecular Probes)	B-13423
			Блокирование решений
0.01 M PBS
0,2% Triton-X100	Рот	3051,3
10% нормальной козьей сывороткой	Abcam	ab7481
1% бычьего сывороточного альбумина	Сигма	A7030
			Звонарь барботируют с 95% O 2/5% CO 2
125 мМ NaCl	Сигма	S7653
2,5 мМ KCl	Сигма	P9333
1,25 мМ NaH 2 PO 4	Сигма	S8282
26 мм NaHCO 3	Сигма	S6297
2 мМ CaCl 2	Сигма	21114
1 мМ MgCl 2	Сигма	63020
20 мМ глюкозы	Сигма	G7528
			Таблица 1. Специфических реагентов и оборудования.