L'endothéline-1 induite Moyen Modèle occlusion de l'artère cérébrale pour AVC ischémique avec guidage laser Doppler chez le rat

Résumé

Plusieurs modèles animaux d'ischémie cérébrale ont été développés pour simuler la condition humaine d'accident vasculaire cérébral. Ce protocole décrit l'endothéline-1 (ET-1) induit par une occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) modèle d'AVC ischémique chez le rat. En outre, des considérations importantes, les avantages et les inconvénients de ce modèle sont discutées.

Résumé

L'AVC est la première cause de handicap et la troisième cause de décès dans le monde, ce qui coûte une somme estimée à 70 milliards de dollars aux États-Unis en 2009 ^{1, 2.} Plusieurs modèles d'ischémie cérébrale ont été développés pour simuler la condition humaine d'accident vasculaire cérébral. Il a été suggéré que jusqu'à 80% de tous les accidents vasculaires cérébraux résultat de lésions ischémiques dans l'artère cérébrale moyenne (ACM) la zone ^3. Dans les années 1990, l'endothéline-1 (ET-1) ⁴ a été utilisé pour induire une ischémie en l'appliquant directement adjacente à la surface de la MCA après la craniotomie. Plus tard, ce modèle a été modifié ⁵ en utilisant une injection stéréotaxique de l'ET-1 à côté du MCA pour produire une ischémie cérébrale focale. Les principaux avantages de ce modèle incluent la possibilité d'effectuer la procédure rapidement, la capacité de contrôler la constriction artérielle en modifiant la dose d'ET-1 livré, pas besoin de manipuler les vaisseaux extra-crâniennes fournissant le sang au cerveau ainsi que progressive reperfusile taux aussi proche que possible de la reperfusion chez l'homme ^5-7. D'autre part, le modèle de l'ET-1 présente des inconvénients qui comprennent la nécessité d'une craniotomie, ainsi que plus grande variabilité du volume d'éjection ^8. Cette variabilité peut être réduite par l'utilisation du laser Doppler (LDF) afin de vérifier l'ischémie cérébrale au cours de l'ET-1 perfusion. Facteurs qui influent sur ​​la variabilité AVC comprennent la précision de la perfusion et le lot de l'ET-1 utilisé ^6. Une autre considération importante est que, bien que la reperfusion est un phénomène fréquent dans la course humaine, la durée de l'occlusion de l'ET-1 induite par MCAO peut pas imiter au mieux que d'accident vasculaire cérébral humain où de nombreux patients ont reperfusion partiel sur une période de quelques heures à quelques jours après l'occlusion ^{9, 10.} Ce protocole décrit en détail l'ET-1 induite par MCAO modèle d'AVC ischémique chez le rat. Il sera également attirer l'attention sur les considérations spéciales et les inconvénients potentiels tout au long de la procédure.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) à l'Université de Floride et est en conformité avec le «Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire" (huitième édition, National Academy of Sciences, 2011).

Matériels

1. Animaux: Huit semaines d'âge, de sexe masculin, Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) pesant 250-300 g au moment de la chirurgie.
2. Anesthésie
   1. Système d'anesthésie par inhalation (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
   2. L'isoflurane anesthésie (Pharmacie Baxter, Deerfield, IL, USA)
3. Stéréotaxique système (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Petit système stéréotaxique animaux
   2. Non-rupture des barres d'oreilles pour les rats
   3. Support de la tête anesthésie gazeuse pour les rats
4. Régulation de la température
   1. BAT-12 Thermomètre microsonde (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis)
   2. T / PUMP, TP600 couverture thermique (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, État de New York, Etats-Unis)
5. Les instruments chirurgicaux
   1. Manche de bistouri n ° 11 et la lame, pince à iris, Graefe pince, pince bulldog écarteurs, tournevis, une seringue de 10 ul avec 26 aiguille de la jauge biseautée (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis)
   2. Micromoteur foret et porte stéréotaxique, Quintessential stéréotaxique injecteur (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 1,0 mm fraise foret rond, 1,0 mm inversé foret conique fraise (Roboz chirurgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD, USA)
6. Fournitures chirurgicales
   1. Les vis de fixation 0-80 X 3/32 avec 2,4 mm longueur de l'arbre, de calibre 21 guide de canule [4mm de long sous le pylône] et factice canule (Plastics One, Roanoke, VA, USA)
   2. Acrylique prothèse Jet et liquides (Lang Dental Manufacturing Co., Inc, Chicago, IL, USA)
   3. 3,0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   4. Des cotons-tiges, pommade ophtalmique Puralube (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
   5. Tondeuses à cheveux électriques (Oster, Providence, RI, USA)
7. Produits chimiques
   1. L'endothéline-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Chlorhexidine à 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
   3. La buprénorphine HCl (Hospira Inc, Lake Forest, IL, USA)
8. Équipements de visualisation
   1. Microscope chirurgical (Seiler Instrument et fabrication; St. Louis, MO, USA)
   2. Fibre optique d'éclairage (Techniquip Corp, Livermore, CA, USA)
9. Laser Doppler système (ADInstruments, Inc, Colorado Springs, CO, USA)
   1. StSonde Crayon Andard
   2. Porte-sonde
   3. Débitmètre sanguin
   4. Powerlab 4/30 avec LabChart 7
10. Mesure du volume de l'infarctus
    1. Cerveau de rat matrice (Zivic-Miller Lab., Inc, Allison Park, Pennsylvanie, Etats-Unis)
    2. 2,3,5-triphényltétrazolium (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) dilué à 0,05% dans du PBS
    3. Scanner à plat (Epson Perfection V30, Epson America, Inc, Long Beach, CA, USA)
    4. Image J logiciels (ImageJ 1.42q logiciel, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Pré-chirurgicaux étapes

1. Avant la chirurgie, les rats sont logés sous un 12:12 lumière / obscurité cycle avec libre accès à l'eau et rongeur.
2. L'anesthésie est induite avec 4% d'isoflurane dans 100% d'O ₂ en mélange de gaz d'une chambre d'induction jusqu'à ce que le rat ne retraits pincée patte arrière.
3. Atechnique septique doit être maintenue au cours de cette procédure, y compris l'utilisation de gants stériles, stériles instruments chirurgicaux, et un drapé chirurgical stérile ^11.
4. La couronne de la tête est rasée avec une tondeuse à cheveux électriques.
5. Le rat est placé dans la position couchée sur un coussin absorbant allongé sur une surface de commande à régulation de température (couverture thermique).
6. La tête est placée dans l'appareil de stéréotaxie en commençant par le placement de la face d'un masque à gaz anesthésique.
7. Ensuite, les barres d'oreilles sont insérés et serrés.
8. Au cours de la procédure d'anesthésie est maintenue avec 2% d'isoflurane dans 100% d'O mélange de gaz _2.
9. Pommade ophtalmique lubrifiant est appliqué sur les deux yeux, et les paupières sont fermées pour empêcher la dessiccation oeil pendant la procédure chirurgicale.
10. Une sonde de température rectale est insérée pour maintenir une température constante pour animaux noyau de 37 ± 0,5 ° C.
11. Avec la tête fermement maintenue dans le stéréotaxiquedispositif, la zone chirurgicale est nettoyée avec une alternance de chlorhexidine à 2% et salines trois fois.

2. Étapes chirurgicales

1. Avec un scalpel, une incision médiane est faite sur la peau recouvrant la voûte du crâne des aspects les plus caudales des yeux (nasion) à entre les oreilles (ligne nuchale supérieure).
2. La peau est ensuite rétracté latéralement avec des pinces bulldog 3.
3. Le tissu conjonctif est retirée du crâne à l'aide des cotons-tiges sèches de sorte que de multiples structures peut être vu clairement. Il s'agit notamment de bregma, la suture coronale, et l'arête latérale droite du crâne. Des cotons-tiges sont utilisées pour éliminer le sang du champ opératoire.
4. En utilisant le microscope d'opération, se trouve bregma, et les manipulateurs stéréotaxiques sont ajustées jusqu'à ce que la fraise de forage rond 1,0 mm est mis à zéro au bregma.
5. La fraise de forage est ensuite déménagé à 1,6 mm et 5,2 mm antérieure latérale au bregma.
6. Un trou de fraise qui pénètre le crâne est percé pour cannula placement (Figure 1). Excès de débris et de sang sont toujours effacées en utilisant des cotons-tiges.

À ce stade, une canule de guidage peut être inséré (étape 7) ou une liaison directe ET-1 injection dans le trou fraise peut être effectuée (passez directement à l'étape 16).

7. Ensuite, les trous de fraises pour 3 vis de fixation sont percés à travers une épaisseur partielle du crâne à l'aide d'un foret de 1,0 mm inversé cône fraise (Figure 1). Un trou est percé dans chaque os frontal environ 1-2 mm en avant de la suture coronale et 1-2 mm en dehors de la suture sagittale. Un trou est percé dans l'os pariétal environ 2-3 mm en arrière de la suture coronale et 2-3 mm en dehors de la suture sagittale ipsilatéral à l'orifice de guidage de canule fraise. Trois 0-80 x 3/32 vis de fixation sont placés dans ces trous fraises et fournira un soutien pour le ciment de la canule. Les vis doivent être avancé 2 ou 3 tours afin de ne pas endommager la dure-mère.
8. La canule de guidage est placé dans le porte-canule et bregma stéréotaxique est situé.
9. Les manipulateurs stéréotaxiques sont ajustés jusqu'à ce que la canule guide est remis à zéro à bregma. La canule est déplacée vers le trou situé fraise 1,6 mm et 5,2 mm antérieur à bregma latéral.
10. Enfin, la canule de guidage est descendu dans le trou de la fraise avec la position de la pointe finale de 4,5 mm à bregma ventrale.
11. Laser Doppler placement de la sonde de débit (en option)
    1. Afin de contrôler le débit sanguin cérébral utilisant FDL, un porte-sonde peut être placée en position avant de fixer la canule de guidage avec un ciment dentaire.
    2. La base porte-sonde est coupée au ras du piédestal à l'exception de l'onglet petite cale en forme.
    3. Le support de sonde est alors placée en arrière de la canule de guidage et vient en dedans de l'arête latérale du crâne avec la languette orientée en dedans (Figure 1).
    4. Le support de sonde et guide canule sont fixés ensemble par un ciment.
12. Ciment dentaire est ensuite utilisé pour fixer la canule en place. Le ciment est en contact avec les trois vis et entoure l'ensemble de la base de la canule.
13. Le ciment doit être complètement sec avant le retrait du porte-canule. Cela prend environ 5 min.

Après ces étapes, l'incision chirurgicale peut être fermé et le mannequin canule peut être vissée dans la canule de guidage. Alternativement, l'ET-1 induite par MCAO peuvent être effectuées sur le rat après une période de récupération de la chirurgie d'implantation canule. Pour cette méthode, l'étape 19 doit être effectuée suivant les étapes 14-18 et peut être effectuée à une date ultérieure. Pour effectuer une canule guide de l'implantation et de l'ET-1 injection au cours de la même intervention chirurgicale, l'étape 14 doit être effectuée suivant.

14. La seringue de perfusion est chargé avec ET-1 (diluée à 80 uM dans du PBS) et ensuite monté dans l'injecteur stéréotaxique.
15. Lamanipulateurs stéréotaxiques sont ajustées jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille est mise à zéro au niveau du bord de la canule de guidage.
16. La pointe de l'aiguille est abaissée à travers la canule de guidage jusqu'à une position de 17,2 mm du bord ventral de la canule de guidage. Si une canule guide n'est pas utilisée, la pointe de l'aiguille est remis à zéro à bregma et abaissée par le trou de la fraise pour une position ventrale à 8,7 mm du bregma.
17. 3 ul de 80 uM ET1 est perfusée à un débit de 1 l par min.
18. La seringue est laissée en place pendant 3 min après la perfusion est terminée et ensuite lentement retirée.
19. L'incision est fermée par suture de nylon 3,0 et le mannequin canule est vissée dans la canule.
20. Une dose d'analgésique approprié (c.-buprénorphine à 0,05-0,1 mg / kg) doit être utilisé après la chirurgie pour réduire la douleur et l'inconfort pendant la période de récupération.
21. Le rat est retiré de la salle d'opération et placé dans un endroit chaud et sec de récupération pour éviter l'hypothermie, avec un accès gratuit et facile à la nourriture et à l'eau douce.

Résultats

1. Post-Op évaluation neurologique

Après que l'animal ne reprenne conscience, une grande variété de tests peuvent être utilisés pour évaluer les déficits neurologiques, y compris l'équilibre, la force de préhension, mise patte, asymétrie posturale et l'escalier d'escalade. La tâche de graines de tournesol est une évaluation brute des fonctions motrices et sensorielles qui présente une corrélation significative avec volume de l'infarctus ^{7, 12.} Au co...

Discussion

L'ET-1 induite par MCAO est un modèle établi d'accident ischémique cérébral expérimental qui est régulièrement utilisé dans plusieurs souches de rats. De nombreuses variables, comme souche de rats, de l'âge des animaux, la température du corps, la méthode de l'anesthésie et de l'expertise opérateur peut conduire à une plus grande variabilité des volumes d'infarctus en utilisant ce modèle ^{5, 14.} Toutefois, plusieurs chercheurs ont montré que les avantages de ce modèl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Animaux: Huit semaines d'âge, de sexe masculin, Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) pesant 250-300 g au moment de la chirurgie. Anesthésie Système d'anesthésie par inhalation (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA) L'isoflurane anesthésie (Pharmacie Baxter, Deerfield, IL, USA) Stéréotaxique système (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) Petit système stéréotaxique animaux Non-rupture des barres d'oreilles pour les rats Support de la tête anesthésie gazeuse pour les rats Régulation de la température BAT-12 Thermomètre microsonde (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis) T / PUMP, TP600 couverture thermique (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, État de New York, Etats-Unis) Les instruments chirurgicaux Manche de bistouri n ° 11 et la lame, pince à iris, Graefe pince, pince bulldog écarteurs, tournevis, une seringue de 10 ul avec 26 aiguille de la jauge biseautée (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis) Micromoteur foret et porte stéréotaxique, Quintessential stéréotaxique injecteur (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) 1,0 mm fraise foret rond, 1,0 mm inversé foret conique fraise (Roboz chirurgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD, USA) Fournitures chirurgicales Les vis de fixation 0-80 X 3/32 avec 2,4 mm longueur de l'arbre, de calibre 21 guide de canule [4mm de long sous le pylône] et factice canule (Plastics One, Roanoke, Virginie, États-Unis) Acrylique prothèse Jet et liquides (Lang Dental Manufacturing Co., Inc, Chicago, IL, USA) 3,0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA) Des cotons-tiges, pommade ophtalmique Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA) Tondeuses à cheveux électriques (Oster, Providence, RI, USA) Produits chimiques L'endothéline-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA) Chlorhexidine à 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA) La buprénorphine HCl (Hospira Inc, Lake Forest, IL, USA) Équipements de visualisation Microscope chirurgical (Seiler Instrument et fabrication; St. Louis, MO, USA) Fibre optique d'éclairage (Techniquip Corp, Livermore, CA, USA) Laser Doppler système (ADInstruments, Inc, Colorado Springs, CO, USA) Sonde standard Crayon Porte-sonde Débitmètre sanguin Powerlab 4/30 avec LabChart 7 Mesure du volume de l'infarctus Cerveau de ratmatrice (Zivic-Miller Lab., Inc, Allison Park, Pennsylvanie, Etats-Unis) 2,3,5-triphényltétrazolium (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) dilué à 0,05% dans du PBS Scanner à plat (Epson Perfection V30, Epson America, Inc, Long Beach, CA, USA) Image J logiciels (ImageJ 1.42q logiciel, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)