쥐의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 엔도 테린-1 유도 중간 뇌 동맥 폐색 모델

요약

대뇌 국소 빈혈의 여러 동물 모델은 스트로크의 인간의 조건을 시뮬레이션하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜은 쥐의 허혈성 뇌졸중에 대한 엔도 테린-1 (동부 표준시-1) 유발 중간 뇌동맥 폐색 (MCAO) 모델에 대해 설명합니다. 또한 중요한 고려 사항, 장점,이 모델의 단점은 설명되어 있습니다.

초록

뇌졸중은 2009 년 ^{1, 2에} 미국에서 추정 70,000,000,000달러 비용이, 장애 세계에서 사망의 세 번째 주요 원인의 최고의 원인입니다. 대뇌 국소 빈혈의 여러 모델은 뇌졸중의 인간의 조건을 모방하기 위해 개발되었습니다. 그것은 중간 대뇌 동맥 (MCA) 영역 ³ 허혈성 손상에서 모든 스트로크 결과의 80 %에있는을 제안하고 있습니다. 1990 년대 초, 엔도 테린-1 (동부 표준시 - 1) ⁽⁴⁾ craniotomy 후 MCA의 표면에 직접 인접를 적용하여 국소 빈혈을 유발하는 데 사용되었다. 나중에,이 모델은 초점 뇌성 국소 빈혈을 생산하기 위해 MCA에 동부 표준시-1 인접의 stereotaxic 주사를 사용하여 ⁵ 바뀌 었습니다. 이 모델의 주요 장점은 신속하게 절차를 수행 할 수있는 능력, 동부 표준시 - 1의 복용량을 변경하여 동맥 수축을 제어 할 수있는 기능 제공, 뇌에 혈액을 공급뿐만 아니라 점차적으로 reperfusi extracranial 혈관을 조작 할 필요없이 포함가격에있는 더 밀접하게 ^5-7 인간 reperfusion을 모방 한 것이 었지요. 한편, 동부 표준시-1 모델은 craniotomy의 필요성뿐만 아니라, 뇌졸중 볼륨 ⁸ 높은 가변성을 포함 단점이 있습니다. 이 변화는 동부 표준시-1 주입하는 동안 대뇌 국소 빈혈을 확인하기 위해 레이저 도플러 flowmetry (LDF)의 사용을 줄일 수 있습니다. 스트로크 변화에 영향을 미칠 요소는 주입과 동부 표준시-1의 배치의 정밀도가 ^6을 사용하여 포함되어 있습니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 비록 reperfusion 인간 뇌졸중의 일반적인 발생 점입니다, 동부 표준시-1 유도 MCAO에 대한 가림의 기간은 밀접하게 ^인간 뇌졸중으로 많은 환자가 폐색 ^9에 따라 일 시간 동안 부분 reperfusion을 가지고있는 것을 모방해서는 안됩니다 ^10. 이 프로토콜은 상세 쥐의 허혈성 뇌졸중에 대한 동부 표준시-1 유도 MCAO 모델에 대해 설명합니다. 또한 절차를 통해 특별 고려 사항과 잠재적 인 단점에 관심을 끌기합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 플로리다 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 준수는 "케어에 대한 가이드 및 실험실 동물의 사용"(여덟째 판, 과학 국립 아카데미, 2011)되었다.

자료

1. 동물 : 수술시 250~300그램 무게 여덟 주 된, 남성, Sprague Dawley 쥐 (찰스 강 (Charles River)의 농장, 윌 밍턴, 미국 MA,).
2. 마취
   1. 흡입 마취 시스템 (VetEquip 주식회사, Pleasanton, CA, USA)
   2. Isoflurane 마취 (박스터의 조제, 디어 필드, IL, USA)
3. Stereotaxic 시스템 (데이비드 Kopf 기기, Tujunga, CA, USA)
   1. 작은 동물 stereotaxic 시스템
   2. 쥐에 대한 비 파열 귀 바
   3. 쥐에 대한 가스 마취 헤드 홀더
4. 온도 조절
   1. BAT-12 microprobe 온도계 (세계 정밀 계측기, 주식회사, 사라 소타, FL, USA)
   2. T / PUMP, TP600 열 담요 (Gaymar 산업 주식회사, 오차드 파크, NY, USA)
5. 수술기구
   1. 메스 핸들과 # 11 블레이드 아이리스 포셉, Graefe 포셉, 드라이버 겸자의 견인기,, 26 게이지 바늘 beveled (세계 정밀 계측기, 주식회사, 사라 소타, FL, USA)을 갖춘 10 μl 주사기
   2. Micromotor 훈련과 stereotaxic 홀더, 전형적인 Stereotaxic 주입기 (Stoelting, 우드 데일, IL, USA)
   3. 1.0 mm 원형 드릴 버, 1.0 mm 역 콘 드릴 버 (Roboz 외과 인스트루먼트 (주), 주식회사, 게이스 버그, MD, USA)
6. 외과 용품
   1. 2.4 mm 축 길이, 21 게이지 가이드 캐뉼라 [긴 받침대 아래에 4mm]와 캐뉼라 더미 (플라스틱 하나 로어 노크와 함께 나사에게 0-80 X 32분의 3 마운트, VA, USA)
   2. 제트 의치 아크릴, 액체 (랭 치과 제조 유한 주식회사, 휠링, IL, USA)
   3. 3.0 나일론 봉합 (오아시스 (Oasis), Mettawa, IL, USA)
   4. 면봉, Puralube 눈 연고 (피셔 과학, 피츠버그, PA, USA)
   5. 전기 헤어 가위 (Oster, 섭리, RI, USA)
7. 화학 제품
   1. 엔도 테린-1 (미국 펩타이드, 서니 베일, CA, USA)
   2. Chlorhexidine 2% (Agrilabs, 세인트 조셉, MO, USA)
   3. Buprenorphine HCL (Hospira 주식회사, 레이크 포레스트, IL, USA)
8. 시각화 장비
   1. 수술 현미경 (Seiler 악기 및 제조, 세인트 루이스, MO, USA)
   2. 광섬유 조명기 (TechniQuip 공사, 리버모어, CA, USA)
9. 레이저 도플러 flowmetry 시스템 (ADInstruments 주식회사, 콜로라도 스프링스, CO, USA)
   1. 세인트andard 연필 프로브
   2. 프로브 홀더
   3. 혈액 유량계
   4. LabChart 7 Powerlab 30분의 4
10. 경색 볼륨 측정
    1. 쥐 뇌 매트릭스 (Zivic - 밀러 연구실., 주식회사, 앨리슨 공원, PA, USA)
    2. 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화은 (시그마 - 알드리치 (주) 세인트 루이스, MO, USA) PBS에 0.​​05 %로 희석
    3. 평판 스캐너 (엡손 정보를 완벽 V30, 엡손 아메리카, 주식회사, 롱 비치, CA, USA)
    4. 이미지 J 소프트웨어 (ImageJ 1.42q 소프트웨어, 건강의 미국 국립 연구소, 베데스다, MA, USA)

1. 사전 수술 단계

1. 수술에 앞서, 쥐가 물과 쥐 수유에 무료로 액세스 할 수있는 12시 12분 어두운 / 밝은주기에 따라 자리 잡고 있습니다.
2. 마취는 뒤쪽 동물의 발자국이 핀치에 인출 더 이상 쥐까지 유도 챔버 100 % O ₂ 기체 혼합물의 4% isoflurane으로 유도하고 있습니다.
3. 발효 기술은 멸균 장갑, 멸균 수술 악기 및 살균 수술 드레이프 ^(11)의 사용을 포함하여이 절차를 수행하는 동안 유지되어야합니다.
4. 머리의 왕관은 전기 헤어 가위로 면도 있습니다.
5. 쥐가 온도 조절 운영면 (열 담요)에 누워 흡수 패드에서 발생하기 쉬운 위치에 배치됩니다.
6. 머리는 가스 마취 얼굴 마스크의 위치로 시작 stereotactic 장치에 저장됩니다.
7. 다음으로 귀 바는 삽입 강화하고 있습니다.
8. 절차 마취 동안 백퍼센트 O ₂ 기체 혼합물에서 isoflurane 2퍼센트로 유지됩니다.
9. 윤활유 안과 연고는 양쪽 눈에 적용되며, 눈꺼풀이 수술하는 동안 눈 건조를 방지하기 위해 폐쇄됩니다.
10. 직장 온도 프로브는 ± 0.5은 ° C. 37 일정한 동물 코어 온도를 유지하기 위해 삽입
11. stereotaxic에 단단히 개최 된 머리장치 외과 영역은 2 % chlorhexidine과 염분을 세 번 교대로 세안합니다.

2. 외과 단계

1. 메스를 사용 중간 선 절개는 귀 (우수한 nuchal 라인) 사이에 눈의 가장 꼬리 부분 (nasion)에서 개관 놓인 피부에 이루어집니다.
2. 피부는 3 다음 불독 겸자 측면 후퇴하고 있습니다.
3. 결합 조직은 여러 구조는 명확하게 볼 수 있도록 건조 면봉을 사용하여 두개골에서 제거됩니다. 이러한 bregma, 코로나 봉합, 오른쪽 측면 두개골 능선 등이 있습니다. 면봉은 수술 현장에서 피를 제거하는 데 사용됩니다.
4. 수술 현미경을 사용하여 bregma이 위치하고 있으며, 1.0 mm의 원형 드릴 버가 bregma에서 청산하고 나면 아무것도 남지 될 때까지 stereotaxic manipulators가 조정됩니다.
5. 드릴 버 그 다음 1.6 mm 앞쪽과 bregma에 측면 5.2 mm로 이동합니다.
6. 두개골을 관통 버 구멍이 cann에 교련입니다울라 배치 (그림 1). 초과 파편과 피가 지속적으로 면봉을 사용하여 지워집니다.

이 시점에서, 가이드 캐뉼라를 삽입 할 수 있습니다 (7 단계) 또는 버 구멍을 통해 직접 동부 표준시-1 주입은 (16 단계로 바로 진행합니다)을 수행 할 수 있습니다.

7. 3 장착 나사에 대한 다음 버 구멍 1.0 mm 역 콘 드릴 버 (그림 1)를 사용하여 두개골의 부분적인 두께를 뚫고있다. 한 홀은 코로나 봉합과 시상 봉합에 측면 1-2mm에 앞 1-2밀리미터에 대해 각 정면 뼈에 구멍을 뚫었 있습니​​다. 한 홀은 코로나 봉합 및 가이드 캐뉼라 버 홀에 ipsilateral 시상 봉합에 측면 2-3mm에 뒤 2~3mm에 대해 정수리 뼈에 구멍을 뚫었 있습니​​다. 세 0-80 X 32분의 3 장착 나사는 이러한 버 구멍에 배치되어 캐뉼라에 쥐고 시멘트에 대한 지원을 제공합니다. 나사는 경질의 문제를 손상하지로 2 ~ 3 회전하므로 고급이어야합니다.
8. 가이드 캐뉼라는 stereotaxic 캐뉼라 홀더에 배치되어 있으며 bregma이 자리 잡고 있습니다.
9. 가이드 캐뉼라는 bregma에서 청산하고 나면 아무것도 남지 될 때까지 stereotaxic manipulators가 조정됩니다. 캐뉼라는 1.6 mm 앞쪽과 bregma에 측면 5.2 mm에 위치한 버 구멍으로 이동됩니다.
10. 마지막으로, 가이드 캐뉼라는 bregma에 복부 4.5 mm의 마지막 끝의 위치와 버 구멍으로 낮아합니다.
11. 레이저 도플러 흐름 프로브 배치 (선택 사항)
    1. LDF를 사용하여 뇌성 혈액의 흐름을 모니터링하기 위해, 프로브 홀더는 치과 시멘트와 가이드 캐뉼라 affixing하기 전에 위치로 배치 할 수 있습니다.
    2. 프로브 홀더베이스는 작은 쐐기 모양 탭을 제외하고 받침대와 플러시 손질하고 있습니다.
    3. 프로브 홀더는 다음 가이드 캐뉼라를 뒤쪽과 medially 지향 탭 (그림 1)과 측면 두개골 능선 바로 안쪽에 위치해 있습니다.
    4. 프로브 홀더 및 guide 캐뉼라는 치과 시멘트를 사용하여 함께 부착되어 있습니다.
12. 치과 시멘트 그런 다음 장소에서 캐뉼라를 확보하는 데 사용됩니다. 시멘트는 세 개의 나사와 접촉하고 캐뉼라의 전체 기반을 둘러싸고 있습니다.
13. 시멘트 전에 캐뉼라 소유자의 제거에 완전히 건조해야합니다. 이 약 5 분 정도 소요됩니다.

다음 단계 후, 수술 절개를 폐쇄 할 수 있으며 캐뉼라 더미는 가이드 캐뉼라로 실수 할 수 있습니다. 또한, 동부 표준시-1 유도 MCAO는 캐뉼라 주입 수술에서 회복 기간 후 쥐에서 수행 할 수 있습니다. 이 방법의 경우, 단계 19 다음을 수행 할 수 있어야하며 단계 14-18은 나중에 수행 할 수 있습니다. 같은 수술하는 동안 가이드 캐뉼라 주입 및 ET-1 주사를 수행하려면 단계 14 다음 수행해야합니다.

14. 주입 주사기는 동부 표준시 - 1로드 (PBS 80 μM로 희석) 한 후 stereotaxic 분사기에 장착되어 있습니다.
15. 바늘 끝이 가이드 캐뉼라의 가장자리에 청산하고 나면 아무것도 남지 될 때까지 stereotaxic manipulators가 조정됩니다.
16. 바늘 끝이 가이드 캐뉼라의 가장자리에 복부 17.2 mm의 위치에 가이드 캐뉼라를 통해 인하된다. 가이드 캐뉼라를 사용하지 않는 경우, 바늘 끝이 bregma에서 청산하고 나면 아무것도 남지과 bregma에 복부 위치 8.7 mm로 버 구멍을 통해 인하된다.
17. 80 μM ET1 3 μl은 분 당 1 μl의 속도로 주입된다.
18. 주입 천천히 제거 후 완전하고 후 주사기은 3 분 동안 자리에 남아 있습니다.
19. 절개는 3.0 나일론 봉합사와 캐뉼라 더미가 캐뉼라로 엉망입니다과 함께 문을 닫습니다.
20. 적절한 진통제의 복용 (0.05-0.1 밀리그램 / kg에서 즉, buprenorphine)은 복구 기간 동안 통증과 불편 함을 최소화하기 위해 수술 후에 사용되어야합니다.
21. 쥐가 수술 방에서 제거하고 부드러운 음식과 물을 무료로, 쉽게 접근 저체온증을 방지하기 위해 따뜻한, 드라이 복구 영역에 배치됩니다.

결과

1. 포스트 사설 신경 평가

동물이 의식을 회복 한 후 테스트 다양한 종류의 균형, 그립 강도, 동물의 발자국 배치, 자세가 비대칭과 등산 계단 등의 신경 결손을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 해바라기 씨 작업은 모터와 경색 볼륨 ^{7, 12} 중요한 상관 관계가 감각 기능의 총 평가입니다. 열기와 5 해바라기 씨 소모하는 동안이 작업에는 쥐가 시간이 초과되어 있습니다. ?...

토론

동부 표준시-1 유도 MCAO는 정기적으로 여러 쥐 종자에 사용되는 실험 허혈성 뇌졸중의 오래된 모델입니다. 이 모델 ^{5, 14을} 사용하면 이러한 쥐 변형, 동물 연령, 체온, 마취 방법, 그리고 연산자 전문 등 많은 변수가 경색 권 증가 다양성 될 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 조사는이 모델의 장점은 상대적으로 비 침습적 방식, 동부 표준시 - 1 뇌성 혈액 흐름의 선량 반응, 그리고 의식 쥐 ^14...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			동물 : 수술시 250~300그램 무게 여덟 주 된, 남성, Sprague Dawley 쥐 (찰스 강 (Charles River)의 농장, 윌 밍턴, 미국 MA,). 마취 흡입 마취 시스템 (VetEquip 주식회사, Pleasanton, CA, USA) Isoflurane 마취 (박스터의 조제, 디어 필드, IL, USA) Stereotaxic 시스템 (데이비드 Kopf 기기, Tujunga, CA, USA) 작은 동물 stereotaxic 시스템 쥐에 대한 비 파열 귀 바 쥐에 대한 가스 마취 헤드 홀더 온도 조절 BAT-12 microprobe 온도계 (세계 정밀 계측기, 주식회사, 사라 소타, FL, USA) T / PUMP, TP600 열 담요 (Gaymar 산업 주식회사, 오차드 파크, NY, USA) 수술기구 메스 핸들과 # 11 블레이드 아이리스 포셉, Graefe 포셉, 드라이버 겸자의 견인기,, 26 게이지 바늘 beveled (세계 정밀 계측기, 주식회사, 사라 소타, FL, USA)을 갖춘 10 μl 주사기 Micromotor 훈련과 stereotaxic 홀더, 전형적인 Stereotaxic 주입기 (Stoelting, 우드 데일, IL, USA) 1.0 mm 원형 드릴 버, 1.0 mm 역 콘 드릴 버 (Roboz 외과 인스트루먼트 (주), 주식회사, 게이스 버그, MD, USA) 외과 용품 2.4 mm 축 길이, 21 게이지 가이드 캐뉼라 [긴 받침대 아래에 4mm]와 캐뉼라 더미 (플라스틱 하나 로어 노크, VA, USA)와 나사에게 0-80 X 32분의 3 마운트 제트 의치 아크릴, 액체 (랭 치과 제조 유한 주식회사, 휠링, IL, USA) 3.0 나일론 봉합 (오아시스 (Oasis), Mettawa, IL, USA) 면봉, Puralube 눈 연고 (피셔 ScientifiC, 피츠버그, PA, USA) 전기 헤어 가위 (Oster, 섭리, RI, USA) 화학 제품 엔도 테린-1 (미국 펩타이드, 서니 베일, CA, USA) Chlorhexidine 2% (Agrilabs, 세인트 조셉, MO, USA) Buprenorphine HCL (Hospira 주식회사, 레이크 포레스트, IL, USA) 시각화 장비 수술 현미경 (Seiler 악기 및 제조, 세인트 루이스, MO, USA) 광섬유 조명기 (TechniQuip 공사, 리버모어, CA, USA) 레이저 도플러 flowmetry 시스템 (ADInstruments 주식회사, 콜로라도 스프링스, CO, USA) 표준 연필 프로브 프로브 홀더 혈액 유량계 LabChart 7 Powerlab 30분의 4 경색 볼륨 측정 쥐의 뇌매트릭스 (Zivic - 밀러 연구실., 주식회사, 앨리슨 공원, PA, USA) 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화은 (시그마 - 알드리치 (주) 세인트 루이스, MO, USA) PBS에 0.​​05 %로 희석 평판 스캐너 (엡손 정보를 완벽 V30, 엡손 아메리카, 주식회사, 롱 비치, CA, USA) 이미지 J 소프트웨어 (ImageJ 1.42q 소프트웨어, 건강의 미국 국립 연구소, 베데스다, MA, USA)