АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Несколько животных моделях ишемии головного мозга были разработаны для имитации человеческого состояния инсульта. Этот протокол описывает эндотелина-1 (ЕТ-1) индуцированных окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) модель развития ишемического инсульта у крыс. Кроме того, важными соображениями, преимущества и недостатки этой модели обсуждаются.

Аннотация

Инсульт является основной причиной инвалидности и третьей ведущей причиной смерти в мире, стоимостью около $ 70 млрд в Соединенных Штатах в 2009 1, 2. Некоторые модели ишемии головного мозга были разработаны, чтобы имитировать человеческое состояние инсульта. Было высказано предположение, что до 80% всех результатов ударов от ишемического повреждения в средней мозговой артерии (СМА) области 3. В начале 1990-х годов, эндотелина-1 (ЕТ-1) 4 был использован, чтобы вызвать ишемию, применяя его в непосредственной близости от поверхности MCA после трепанации черепа. Позднее эта модель была изменена 5 с помощью стереотаксической инъекции ET-1, прилегающих к MCA для производства церебральной ишемии. Основные преимущества этой модели включают в себя возможность выполнить процедуру быстро, способность контролировать сужение артерий, изменяя дозу ET-1 поставляется, не нужно манипулировать экстракраниальных сосудов, снабжающих кровью мозг, а также постепенное reperfusiпо ставкам, которые более точно имитирует реперфузии у человека 5-7. С другой стороны, ET-1 модель имеет недостатки, которые включают в себя необходимость для трепанации черепа, а также высших изменчивости ударного объема 8. Эта изменчивость может быть уменьшен с помощью лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ), чтобы проверить ишемии головного мозга во время ET-1 вливания. Факторы, влияющие на ход изменчивости включают точность инфузии и партия ET-1 используется 6. Еще одним важным фактором является то, что хотя реперфузии является обычным явлением в человеческой инсульта, длительность окклюзии для ET-1 индуцированной MCAO не может точно имитировать у человека инсульт, где многие пациенты имеют частичную реперфузии в течение часов или дней после окклюзии 9, 10. Этот протокол будет подробно описать ET-1 индуцированной MCAO модель развития ишемического инсульта у крыс. Он также обратить внимание на особые соображения и возможные недостатки в течение всей процедуры.

протокол

Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) из Университета Флориды и в соответствии с "Руководство по уходу и использованию лабораторных животных» (восьмое издание, Национальной академии наук, 2011).

Материалы

  1. Животные: восемь-недельных, мужчина, Sprague Dawley крыс (Charles River Farms, Уилмингтон, Массачусетс, США) массой 250-300 г во время операции.
  2. Анестезия
    1. Вдыхание анестезии системе (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane анестетика (Бакстер Фармацевтика, Deerfield, IL, USA)
  3. Стереотаксическая система (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Малые системы стереотаксической животных
    2. Номера для разрыва ухо баров для крыс
    3. Газ анестезии голове держатель для крыс
  4. Регулирование температуры
    1. BAT-12 микрозонда термометр (World Precision Instruments, Inc, Сарасота, штат Флорида, США)
    2. Т / НАСОС, TP600 тепловой одеяло (Гаймар Industries, Inc Orchard Park, Нью-Йорк, США)
  5. Хирургические инструменты
    1. Скальпель ручкой и лезвием № 11, ирис щипцы, Грефе пинцет, зажим бульдог преднатяжителями, отвертка, 10 мкл шприц с 26 калибровочных скошенной иглой (инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США)
    2. Сверло микромоторы и стереотаксической держатель, Quintessential Стереотаксическая инжектор (Stoelting, Вуд-Дейл, Иллинойс, США)
    3. 1,0 мм круглого бора дрель, 1,0 мм перевернутого конуса сверла бора (Roboz хирургических инструментов Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
  6. Хирургические принадлежности
    1. Крепежные винты 0-80 х 3/32 с 2,4 мм длины вала, 21-калибровочного канюли [длиной 4мм ниже пьедестала] и канюли манекен (пластмассы один, Роанок, Вирджиния, США)
    2. Jet акриловых протезов и жидкие (Lang Стоматологическая Производство Co, Inc Brooklyn, NY, США)
    3. 3,0 нейлона шва (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Ватные тампоны, Puralube глазная мазь (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США)
    5. Электрические машинки для стрижки волос (Oster, Провиденс, Род-Айленд, США)
  7. Химикалии
    1. Эндотелина-1 (Американский пептид, Саннивейл, Калифорния, США)
    2. Хлоргексидин 2% (Agrilabs, Сент-Джозеф, штат Миссури, США)
    3. Бупренорфин HCl (Hospira Inc, Лейк-Форест, Иллинойс, США)
  8. Визуализация оборудование
    1. Хирургический микроскоп (Seiler инструмента и производства; Сент-Луис, Миссури, США)
    2. Волоконно-оптический осветитель (TechniQuip Corp, Ливермор, Калифорния, США)
  9. Лазерной доплеровской флоуметрии системы (ADInstruments, Inc, Колорадо-Спрингс, Колорадо, США)
    1. УлицаAndard Probe карандаш
    2. Держатель зонда
    3. Кровь расходомер
    4. PowerLab 4/30 с LabChart 7
  10. Измерение объема инфаркта
    1. Крысы мозга матрицу (Zivic-Miller Lab., Inc Allison Park, штат Пенсильвания, США)
    2. 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (Sigma-Aldrich Co, Сент-Луис, Миссури, США) разбавляют до 0,05% в PBS
    3. Планшетный сканер (Epson Perfection V30, Epson America, Inc, Лонг-Бич, Калифорния, США)
    4. Изображение J программного обеспечения (ImageJ 1.42q программного обеспечения, американского Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Массачусетс, США)

1. Предоперационная шаги

  1. До операции у крыс размещены под 12:12 цикле свет / темнота со свободным доступом к воде и грызунов.
  2. Анестезия индуцируется с 4% изофлурана в 100% O 2 газовой смеси в индукционной камере, пока крысы не снятие с задней щепотку лапу.
  3. септических техника должна быть сохранена во время этой процедуры в том числе использование стерильных перчаток, стерильных хирургических инструментов и стерильных хирургических драп 11.
  4. Макушки головы бритая, с электрической машинки для стрижки волос.
  5. Крыса находится в положении лежа на впитывающей прокладки лежал на контролируемой температурой рабочей поверхности (тепловое одеяло).
  6. Голова помещается в стереотаксической аппарата, начиная с размещением лицо противогаз анестезии.
  7. Далее, ухо баров вставлены и затянуты.
  8. Во время процедуры анестезии сохраняется с 2% изофлурана в 100% O 2 газовой смеси.
  9. Мазь смазки офтальмологической наносится на оба глаза, а веки закрыты, чтобы предотвратить высыхание глаза во время хирургической процедуры.
  10. Ректального датчика температуры вводится для поддержания постоянной температуры ядра животного 37 ± 0,5 ° C.
  11. С гордо поднятой головой твердо в стереотаксическойУстройство, хирургической области очищается с чередующимися 2% раствором хлоргексидина и соленых три раза.

2. Хирургические шаги

  1. Использование скальпеля, срединный разрез на коже, покрывающей черепа из самых хвостового аспекты глаз (назион), чтобы между ушами (верхняя затылочная линия).
  2. Кожа тогда отказался от боков с 3 зажимами бульдога.
  3. Соединительная ткань удаляется из черепа с использованием сухих ватных тампонов, так что несколько структур можно ясно видеть. Они включают в себя брегмы, венечный шов, а правой боковой хребет черепа. Ватные тампоны используются для удаления крови с операционного поля.
  4. С помощью операционного микроскопа, брегмы находится, и стереотаксических манипуляторов корректируется до 1,0 мм круглого сверла бор обнуляется в темя.
  5. Сверло бор затем переехал в 1,6 мм передний и 5,2 мм бокового брегмы.
  6. Бором отверстие, которое проникает в череп отверстия для Каннула размещения (рис. 1). Превышение мусора и крови постоянно погасить при помощи ватного тампона.

На данный момент, руководство канюля может быть вставлен (шаг 7) или прямой ET-1 инъекция через отверстие бора может быть выполнена (перейти непосредственно к этапу 16).

  1. Далее, бором отверстия для крепежных винтов 3 бурятся за счет частичного толщина черепа помощью 1,0 мм перевернутого конуса сверла бора (рис. 1). Одно отверстие сверлят в каждой лобной кости 1-2 мм кпереди от венечного шва и 1-2 мм латеральнее сагиттального шва. Один отверстия, пробуренные в теменной кости примерно на 2-3 мм кзади от венечного шва и 2-3 мм латеральнее сагиттального шва ипсилатерального в отверстие направляющей канюли бора. Три 0-80 х 3/32 крепежные винты, расположенные в этих бором отверстия и будет оказывать поддержку цементного холдинга в канюлю. Винты должны быть только передовые 2 или 3 оборота, чтобы не повредить оболочку вопрос.
  2. Канюли находится в стереотаксической держателя канюли и брегмы находится.
  3. Стереотаксических манипуляторов корректируется до канюли обнуляется в темя. Канюля перемещается в бор отверстие, расположенное 1,6 мм, передняя и боковая 5,2 мм брегмы.
  4. Наконец, руководство канюли опускают в отверстие бора с окончательной позиции кончика 4,5 мм, вентральный брегмы.
  5. Лазерная доплеровская поток зонда размещения (дополнительно)
    1. В целях мониторинга мозгового кровотока использования LDF, держатель зонда может быть помещена в позицию до проставления канюли с зубным цементом.
    2. Базовый держатель зонда обрезается заподлицо с пьедестала, за исключением небольших клиновидных вкладки.
    3. Держатель зонда помещается позади канюли и просто медиальнее бокового гребня черепа с вкладки ориентированная медиально (рис. 1).
    4. Держатель зонда и гuide канюли крепятся между собой с помощью стоматологического цемента.
  6. Стоматологический цемент используется для обеспечения канюли на месте. Цемента находится в контакте со всеми тремя винтами и окружает всю базу канюли.
  7. Цемента должна быть полностью сухой перед удалением держатель канюли. Это занимает около 5 мин.

После этих шагов, хирургический разрез может быть закрыт, а манекен канюля может быть пьяным в канюлю гида. Кроме того, ET-1 индуцированной MCAO может быть выполнена на крысах после периода восстановления после операции имплантации канюли. Для этого метода, шаг 19 должна быть выполнена следующая и шаги 14-18 может быть выполнена в более позднее время. Для выполнения канюли имплантации и ET-1 инъекцию в течение того же операции, шаг 14 должна быть выполнена следующей.

  1. Настой шприц загружается с ET-1 (разбавленный до 80 мкМ в PBS), а затем установлены в стереотаксической инжектор.
  2. стереотаксических манипуляторов корректируется до кончика иглы обнуляется на краю направляющей канюли.
  3. Иглы опускается через канюли на позиции 17,2 мм вентрально к краю канюли. Если руководство канюля не используется, кончик иглы обнуляется при брегмы и опускают через отверстие бора в положение 8,7 мм вентрально брегмы.
  4. 3 мкл 80 мкМ ET1 вливается в размере 1 мкл в минуту.
  5. Шприц остается на месте в течение 3 мин после вливания, является полной и затем медленно удаляется.
  6. Разрез закрыт с 3,0 шва нейлона и манекен канюли ввинчивается в канюлю.
  7. Доза соответствующие анальгетик (т.е. бупренорфина на 0,05-0,1 мг / кг) следует использовать после операции, чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт во время восстановительного периода.
  8. Крыса будет удален из хирургического набора и помещают в теплое, сухое области восстановления, чтобы предотвратить гипотермию, со свободным, легким доступом к мягкой пищи и воды.

Результаты

1. Post-Op неврологическое обследование

После того, как животное приходит в сознание, разнообразные тесты могут быть использованы для оценки неврологического дефицита, включая баланс, сила хвата, лапы размещение, постуральная асимметрии и лестница восхождения. Задача семян ...

Обсуждение

ET-1 индуцированной MCAO является признанной модели экспериментального ишемического инсульта, который регулярно используется в нескольких штаммов крыс. Многие переменные, такие как крысы деформации, возраста животного, температура тела, метод анестезии, и оператор экспертизы может при?...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Американской Ассоциации Сердца Большой Юго-Восточной Партнерская (09GRNT2060421), Американская медицинская ассоциация, и из университета Флориды клинических и трансляционных Science Institute. Адам Мекке NIH / NINDS, АЯРБ predoctoral человек (F30 NS-060335). Роберт Regenhardt получил predoctoral поддержки стипендий из Университета Флориды многопрофильная программа обучения в гипертония (T32 HL-083810).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
  1. Животные: восемь-недельных, мужчина, Sprague Dawley крыс (Charles River Farms, Уилмингтон, Массачусетс, США) массой 250-300 г во время операции.
  2. Анестезия
    1. Вдыхание анестезии системе (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane анестетика (Бакстер Фармацевтика, Deerfield, IL, USA)
  3. Стереотаксическая система (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Малые системы стереотаксической животных
    2. Номера для разрыва ухо баров для крыс
    3. Газ анестезии голове держатель для крыс
  4. Регулирование температуры
    1. BAT-12 микрозонда термометр (World Precision Instruments, Inc, Сарасота, штат Флорида, США)
    2. Т / НАСОС, TP600 тепловой одеяло (Гаймар Industries, Inc Orchard Park, Нью-Йорк, США)
  5. Хирургические инструменты
    1. Скальпель ручкой и лезвием № 11, ирис щипцы, Грефе пинцет, зажим бульдог преднатяжителями, отвертка, 10 мкл шприц с 26 калибровочных скошенной иглой (инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США)
    2. Сверло микромоторы и стереотаксической держатель, Quintessential Стереотаксическая инжектор (Stoelting, Вуд-Дейл, Иллинойс, США)
    3. 1,0 мм круглого бора дрель, 1,0 мм перевернутого конуса сверла бора (Roboz хирургических инструментов Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
  6. Хирургические принадлежности
    1. Крепежные винты 0-80 х 3/32 с 2,4 мм длины вала, 21-калибровочного канюли [длиной 4мм ниже пьедестала] и канюли манекен (пластмассы один, Роанок, Вирджиния, США)
    2. Jet акриловых протезов и жидкие (Lang Стоматологическая Производство Co, Inc Brooklyn, NY, США)
    3. 3,0 нейлона шва (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Ватные тампоны, Puralube глазная мазь (Fisher Scientifiс, Питтсбург, Пенсильвания, США)
    5. Электрические машинки для стрижки волос (Oster, Провиденс, Род-Айленд, США)
  7. Химикалии
    1. Эндотелина-1 (Американский пептид, Саннивейл, Калифорния, США)
    2. Хлоргексидин 2% (Agrilabs, Сент-Джозеф, штат Миссури, США)
    3. Бупренорфин HCl (Hospira Inc, Лейк-Форест, Иллинойс, США)
  8. Визуализация оборудование
    1. Хирургический микроскоп (Seiler инструмента и производства; Сент-Луис, Миссури, США)
    2. Волоконно-оптический осветитель (TechniQuip Corp, Ливермор, Калифорния, США)
  9. Лазерной доплеровской флоуметрии системы (ADInstruments, Inc, Колорадо-Спрингс, Колорадо, США)
    1. Стандартный зонд карандаш
    2. Держатель зонда
    3. Кровь расходомер
    4. PowerLab 4/30 с LabChart 7
  10. Измерение объема инфаркта
    1. Головного мозга крысМатрица (Zivic-Miller Lab., Inc Allison Park, штат Пенсильвания, США)
    2. 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (Sigma-Aldrich Co, Сент-Луис, Миссури, США) разбавляют до 0,05% в PBS
    3. Планшетный сканер (Epson Perfection V30, Epson America, Inc, Лонг-Бич, Калифорния, США)
    4. Изображение J программного обеспечения (ImageJ 1.42q программного обеспечения, американского Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Массачусетс, США)

Ссылки

  1. Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  3. Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W., Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. . Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management. , 377-450 (1986).
  4. Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat. Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).
  5. Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).
  6. O'Neill, M. J., Clemens, J. A. Rodent models of focal cerebral ischemia. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).
  7. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp. Transl. Stroke Med. 1, 8 (2009).
  9. Tomsick, T. A. Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke. J. Vasc. Interv. Radiol. 15, 67-76 (2004).
  10. Olsen, T. S., Lassen, N. A. A dynamic concept of middle cerebral artery occlusion and cerebral infarction in the acute state based on interpreting severe hyperemia as a sign of embolic migration. Stroke. 15, 458-468 (1984).
  11. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
  12. Gonzalez, C. L., Kolb, B. A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology. Eur. J. Neurosci. 18, 1950-1962 (2003).
  13. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. J. Vis. Exp. (51), e2879 (2011).
  14. Sharkey, J., Butcher, S. P. Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery. J. Neurosci. Methods. 60, 125-131 (1995).
  15. Macrae, I. M., Robinson, M. J., Graham, D. I., Reid, J. L., McCulloch, J. Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 276-284 (1993).
  16. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).
  17. Fisher, M., et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations. Stroke. 40, 2244-2250 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

721doppley

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены