Biochip multi-analyte (MAB) Basé sur des électrodes sélectives d'ions All-état solide (ASSISE) pour la recherche physiologique

Résumé

Électrodes sélectives d'ions tout état solide (assises) construites à partir d'un polymère (CP) transducteur conducteur fournissent plusieurs mois de vie fonctionnel dans les milieux liquides. Ici, nous décrivons le processus de fabrication et l'étalonnage des Assises dans un format lab-on-a-chip. L'ASSISE est démontré à avoir maintenu un profil de pente quasi-nernstienne après un stockage prolongé dans les milieux biologiques complexes.

Résumé

Applications Lab-on-a-Chip (LOC) en recherche environnementale, le biomédical, l'agriculture, biologique, et des vols spatiaux nécessitent une électrode sélective (ISE) qui peut résister à un stockage prolongé dans les milieux biologiques complexes ^1-4. Un ion-selective-électrode all-solid-state (ASSISE) est particulièrement intéressante pour les applications mentionnées ci-dessus. L'électrode doit avoir les caractéristiques suivantes favorables: la construction facile, peu d'entretien, et (potentiel) miniaturisation, qui permet le traitement par lots. Un ASSISE microfabriqué destiné à quantifier H ^+, Ca ^{2 +,} et CO ₃ ^{2 -} ions a été construit. Il se compose d'une couche de métal noble électrode (par exemple de Pt), une couche de transduction, et d'une membrane sélective d'ions (ISM) couche. Les fonctions de la couche de transduction pour la transduction de la concentration dépendant du potentiel chimique de la membrane sélective d'ions en un signal électrique mesurable.

Til durée de vie d'un ASSISE se trouve à dépendre de maintenir le potentiel à la couche / la membrane conductrice d'interface ^7.5. Pour prolonger la durée de vie de travail ASSISE et ainsi maintenir les potentiels stables au niveau des couches d'interface, nous avons utilisé le polymère conducteur (CP) poly (3,4-éthylènedioxythiophène) (PEDOT) ^7-9 à la place de l'argent / chlorure d'argent (Ag / AgCl) que la couche de transducteur. Nous avons construit le ASSISE dans un format lab-on-a-chip, que nous avons appelé la biopuce multi-analyte (MAB) (Figure 1).

Étalonnages dans les solutions de test ont montré que le MAB peut contrôler le pH (gamme pH opérationnel 4-9), CO ₃ ^{2 -} (mesurée comprise entre 0,01 mm - 1 mm) et Ca ^{2 +} (plage log-linéaire de 0,01 mm à 1 mm). Le MAB pour pH fournit une réponse en pente quasi-nernstienne après presque un mois de stockage dans le milieu des algues. Les biopuces de carbonate présentent un profil potentiométrique similaire à celle d'une électrode sélective d'ions classique. Physiolgiques mesures ont été utilisées pour surveiller l'activité biologique du système modèle, la micro-algue Chlorella vulgaris.

Le MAB transmet un avantage de taille, la polyvalence et multiplexé capacité de détection de l'analyte, le rendant applicable à de nombreuses situations de surveillance confinés, sur terre ou dans l'espace.

Biopuce conception et les méthodes expérimentales

La biopuce est de 10 x 11 mm de dimension et dispose de 9 Assises désignés comme électrodes de travail (WES) et 5 électrodes de référence Ag / AgCl (RES). Chaque électrode de travail (WE) est de 240 m de diamètre et est également espacés de 1,4 mm de la résolution, qui sont de 480 m de diamètre. Ces électrodes sont reliées à des plots de contact électrique ayant une dimension de 0,5 mm x 0,5 mm. Le schéma est représenté dans la figure 2.

Voltampérométrie cyclique (CV) et des procédés de dépôt sont utilisés pour galvanostatiques electropolymerize les films PEDOT utilisant un Bioanalytical Systems Inc. (BASI) de support de la cellule C3 (figure 3). Le contre-ion pour le film PEDOT est adaptée en fonction de l'ion analyte d'intérêt. Un PEDOT avec du poly (styrène sulfonate) contre-ion (PEDOT / PSS) est utilisé pour H ⁺ et CO ₃ ^{2 -,} tandis que l'un au sulfate (à ajouter à la solution comme CaSO ₄₎ est utilisé pour le Ca ^{2 +.} Les propriétés électrochimiques du PEDOT revêtu WE sont analysées en utilisant les CV dans une solution redox-actif (soit 2 mM de ferricyanure de potassium (K ₃ Fe (CN) _6)). Sur la base du profil CV, analyse Randles-Sevcik a été utilisé pour déterminer la surface effective ^10. Spin-coating à 1500 rpm est utilisé pour couler ~ 2 um d'épaisseur membranes sélectives d'ions (ISMS) sur les électrodes de travail du MAB (WES).

Le MAB est contenu dans une chambre à la cellule d'écoulement microfluidique rempli d'un volume de 150 ul de milieu des algues, les plots de contact sont reliés électriquement au système BASI (figureure 4). L'activité photosynthétique de Chlorella vulgaris est contrôlée à la lumière ambiante et des conditions sombres.

Protocole

1. Préparation de poly (3,4-éthylènedioxythiophène): Poly (styrène sulfonate de sodium 4) (PEDOT: PSS) Solution d'électropolymérisation pour H ⁺ et CO ₃ ^{2 -} Ions

1. Ajouter 70 mg de poly (4-styrènesulfonate de sodium), (Na ⁺ PSS ^-) et 10 ml d'eau désionisée (DI) de l'eau et le vortex jusqu'à dispersion complète (environ 10 s).
2. Ajouter 10,7 pi 3,4-ethlyenedioxythiophene (EDOT) à la solution à 1,1 et vortex jusqu'à dissolution est complètement mélangé.

2. Préparation de poly (3,4-éthylènedioxythiophène): sulfate de calcium (PEDOT: CaSO ₄₎ Solution d'électropolymérisation de Ca ^{2 +} des ions

1. Ajouter 136 mg de sulfate de calcium (CaSO ₄₎ à 10 ml d'eau DI et vortex, la solution ne se dispersera pas complètement et semble laiteux.
2. Ajouter 10,7 EDOT ul de la solution à 2,1 et vortex jusqu'à ce que complètement mélangé.

3. Électropolymérisation du PEDOT baséePolymère conducteur

1. A bioanalytiques Systems Inc. (BASI) de support de la cellule C3 (figure 3), et une EC epsilon potentiostat / galvanostat sont utilisés pour former la cellule électrochimique pour électropolymérisation. Placez le EDOT: solution d'électropolymérisation PSS dans la cellule électrochimique et une bulle d'azote pendant 20 min pour éliminer l'oxygène dissous.
2. Maintenant couper une gaze de platine à la position de contre-électrode de la cellule électrochimique. Puis extraire la MAB à la position de l'électrode de travail de la cellule électrochimique avec les électrodes de travail face à la platine de la gaze. Ajuster la profondeur du MAB de sorte que seules les électrodes circulaires sont immergés dans le PEDOT: PSS solution d'électropolymérisation. Eviter le contact de la solution avec les plots de contact électrique carrés.
3. Placer une argent / chlorure d'argent saturé BASI (Ag / AgCl) électrode dans la position de l'électrode de référence de la cellule électrochimique. Assurez-vous que l'électrode de référence n'est pas entre le travail et contrefaçélectrodes r.
4. Pour PEDOT: PSS dépôt: Bubble la cellule électrochimique pendant 20 min, et utiliser le CE epsilon potentiostat / galvanostat pour exécuter une seule voltammogramme cyclique de 0 V - 1,1 V avec une vitesse de balayage de 20 mV / s sur une échelle de ± 100 pA.
5. Pour PEDOT: _CaSO4 dépôt: Bulle de la cellule électrochimique pendant 20 min, et utiliser le CE epsilon potentiostat / galvanostat pour exécuter chronopotentiométrie à 814 nA pendant 30 min.

4. Voltamétrie cyclique de conjugués polymère PEDOT basés dans K ₃ Fe (CN) ₆

1. Effectuer les étapes 3.1 à 3.3 ci-dessus.
2. Utilisez le CE epsilon potentiostat / galvanostat pour exécuter voltamogrammes cycliques simples de -653 mV à 853 mV avec divers taux de balayage de (25, 50, 75, 100, l25, 150, 175, 200) mV / sec sur une échelle de ± 10 pA .

5. Protocole de fonctionnalisation de surface

1. Conducteur dépôt de polymère conjugué spécifique pour les ions d'intérêt comme dans l'étape 3.
2. Appliquer membrane sélective d'ions comme à l'étape 6.

6. Application de la membrane sélective d'ions

1. Centre du MAB sur le vide spinner mandrin.
2. Caution 100 pi membrane sur le centre de la MAB et la course.
3. Spin-couche membrane sélective d'ions avec une tournette à 1500 tours par minute pendant 30 s avec une rampe 5 secondes de haut en bas.
4. Passez l'aspirateur sur le MAB revêtu par centrifugation pendant 30 min et faites cuire la puce dans un four à 70 ° C pendant 20 min.

7. Calibration de PEDOT-PSS Conductive Polymer conjugué avec le pH et le carbonate (CO ₃ ^{2 -)} Membrane sélective d'ions

1. Condition du MAB nuit à 10 uM bicarbonate de sodium (NaHCO ₃₎ et 5 mM de chlorure de potassium (KCl) dans les médias d'algues.
2. Insérez le MAB dans le porte-puce-cellule d'écoulement microfluidique.
3. Injecter la solution d'essai de 5 ml avec une valeur initiale du pH ou de la concentration (par exemple pH 4 ou 10 uM de CO ₃ ^{2 -).} Retirer Bubbles à partir du support de puce-cellule d'écoulement.
4. Placer le support de puce-cellule d'écoulement sur l'appareil électrique, la cellule d'écoulement.
5. Ouvrez le logiciel epsilon CE et entrer en mode de potentiel en circuit ouvert (OP). Réglez l'heure à 300 min, l'échelle de tension à ± 1V, et la fréquence de coupure à 10 kHz, et d'enregistrer la valeur toutes les 2 sec.
6. Laissez le MAB stabiliser (cherchez une ligne plate) avant de continuer avec le processus d'étalonnage.
7. Une fois que le MAB est stabilisée, rincer la cellule de flux avec une solution d'essai et d'injecter la prochaine concentration à étalonner (pH 5 ou 25 pM de CO ₃ ^{2 -).} Assurez-vous qu'aucune bulle sont autorisés à entrer dans la cellule d'écoulement. Répétez les étapes 7.5 et 7.6 de pH 6, 7, 8 et 9 ou CO ₃ ^{2 -} des concentrations de 50, 75, 100, 250, 500, 750 et 1000 um.
8. Après la dernière concentration a été exécuté, retirez le MAB et sécher à l'air d'azote.
9. Replacez le MAB dans une solution de conditionnement frais jusqu'à la prochaine utilisation.

8. Calibration de PEDOT: CaSO ₄ Conductive Polymer conjugué à _CaCl2

1. Condition du MAB nuit dans 7 ml de _CaCl2 0,1 M et 10 uM nano _3.
2. Suivez les étapes similaires à 07.02 à 07.10. Dans l'étape 8.3, remplacer la solution de test de carbonate avec une concentration initiale de 0,01 mM de CaCl _2. Répétez l'opération pour les concentrations solution de test de 0,05, 0,1, 0,5, 1 et 10 mm.

Résultats

Un exemple de voltammogramme (CV) suite cyclique de PEDOT: PSS et son courant de crête cathodique correspondant (i _p) vs la vitesse de balayage (v _1/2) sont représentées respectivement dans les figures 5a et 5b. PEDOT: CaSO ₄ à diverses vitesses de balayage et son courant pic cathodique ne sont pas représentés. En utilisant l'analyse Randles-Sevcik ^10, les surfaces effectives du contact solide PEDOT: PSS et PE...

Discussion

La biopuce MAB se compose d'assises qui sont construits à partir d'un sommet d'une couche ISM de transduction conjugué CP PEDOT basée sur une électrode de Pt, la combinaison de ce qui transduit la concentration ionique d'intérêt à un signal électrique mesurable. Un potentiel d'électrode stable est définie à la fois par la couche de PP et la couche ISM. Les deux couches déterminent également la durée de vie de travail du MAB et de la qualité (bruit, dérive) du signal électrique mesur?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Ethylenedioxythiophene	Sigma-Aldrich	483028
Poly(sodium 4-styrenesulfonate)	Sigma-Aldrich	243051
EC epsilon galvanostat/potentiostat	Bioanalytical Systems Inc.	e2P
Saturated Ag/AgCl reference electrode	Bioanalytical Systems Inc.	MF-2052
Pt gauze	Alfa Aesar	10283
Potassium ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Potassium nitrate	J.T. Baker	3190-01
Sodium bicarbonate	Mallinckrodt/ Macron	7412-12
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S-7127
Calcium chloride	J.T. Baker	1311-01
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Calcium sulphate	Sigma-Aldrich	237132
C3 cell stand	Bioanalytical Systems Inc.	EF-1085
Flow-cell chip holder			Custom, courtesy of NASA Ames
Flow-cell electrical fixture			Custom, courtesy of NASA Ames
Table 2. Specific reagents and equipment.