Multi-Analyt-Biochip (MAB) auf All-Solid-State-Ionen-selektiven Elektroden (ASSISE) für physiologische Forschung Grundlage

Zusammenfassung

All-Solid-State-Ionen-selektiven Elektroden (Assises) aus einem leitfähigen Polymer (CP) Wandler konstruiert ist mehrere Monate von funktionellen Lebensdauer in flüssigen Medien. Hier beschreiben wir die Herstellung und Kalibrierung von Assises in einem Lab-on-a-Chip-Format. Die ASSISE nachgewiesen wird beibehalten eine nahezu Nernst Höhenprofil nach längerer Lagerung in komplexen biologischen Medien.

Zusammenfassung

Lab-on-a-chip (LOC) Anwendungen in der Umwelttechnik, Biomedizin, Landwirtschaft, biologische und Raumfahrt Forschung erfordern einen ionenselektiven Elektrode (ISE), die längere Lagerung in komplexen biologischen Medien ^1-4 standhalten können. Ein all-solid-state ionenselektiven Elektrode (ASSISE) ist besonders attraktiv für die oben genannten Anwendungen. Die Elektrode sollte die folgenden günstigen Eigenschaften: einfache Konstruktion, geringer Wartungsaufwand, und (Potenzial für) Miniaturisierung, so dass für die Stapelverarbeitung. Mikrohergestellte ASSISE zur Quantifizierung H ^+, Ca ^{2 +} und CO ₃ ² soll ^- Ionen konstruiert. Es besteht aus einer Edelmetall-Elektrodenschicht (dh Pt), einer Transduktion Schicht und einer ionenselektiven Membran (ISM)-Schicht. Die Transduktion Schicht dient dazu, die Konzentration abhängigen chemischen Potentials der ionenselektiven Membran in ein messbares elektrisches Signal zu transduzieren.

Ter Lebensdauer eines ASSISE gefunden wird, auf die Erhaltung der Potential an der leitfähigen Schicht / Membran-Grenzfläche ^5-7 ab. Um die Lebensdauer zu verlängern ASSISE und dadurch eine stabile Potentiale an den Grenzschichten, verwendeten wir das leitfähige Polymer (CP) Poly (3,4-ethylendioxythiophen) (PEDOT) ^7-9 anstelle von Silber / Silberchlorid (Ag / AgCl) wie der Wandler aufweist. Wir konstruierten die ASSISE in einem Lab-on-a-Chip-Format, die wir als die Multi-Analyt-Biochip (MAB) (Abbildung 1).

Kalibrierungen in Testlösungen gezeigt, dass die MAB können pH-Wert (pH 4-9 Betriebsbereich), CO ₃ ² überwachen ^- (Messbereich 0,01 mm - 1 mm) und Ca ^{2 +} (log-linearen Bereich von 0,01 mm bis 1 mm). Die MAB für pH bietet eine nahezu Nernst Steigung Antwort nach fast einen Monat Lagerung in Algenmedium. Die Carbonat Biochips zeigen eine potentiometrische Profil ähnlich dem eines herkömmlichen ionenselektiven Elektrode. Physiolgroßartiges Puzzle-Messungen wurden verwendet, um die biologische Aktivität des Modellsystems, die Mikroalge Chlorella vulgaris überwachen.

Die MAB vermittelt einen Vorteil in der Größe, Vielseitigkeit und Multiplex-Analyten Sensing-Funktion, so dass es für viele beschränkt Überwachung von Situationen, auf der Erde oder im Weltraum.

Biochip Entwurf und experimentelle Methoden

Der Biochip 10 x 11 mm in Dimension und ist mit 9 Assises als Arbeitselektroden (wes) und 5 Ag / AgCl Referenzelektrode (EE) bezeichnet. Jede Arbeitselektrode (WE) ist 240 um im Durchmesser und ist gleichermaßen bei 1,4 mm von der REs, die 480 um im Durchmesser angeordnet sind. Diese Elektroden sind an elektrischen Kontaktstellen mit einer Größe von 0,5 mm x 0,5 mm verbunden ist. Die schematische wird in Abbildung 2 gezeigt.

Cyclovoltammetrie (CV) und galvanostatischen Ablagerung Methoden werden verwendet, um die Filme mit einer PEDOT Bioanalytic electropolymerizeal Systems Inc. (BASI) C3 Stand Zelle (Abbildung 3). Das Gegenion für die PEDOT Film zugeschnitten ist, um den Analyten Ionen von Interesse zu entsprechen. A PEDOT mit Poly (styrolsulfonat) Gegenion (PEDOT / PSS) für H ⁺ und CO ₃ ² verwendet ^-, während man mit Sulfat (zu der Lösung als CaSO ₄₎ für Ca ^{2 +} verwendet wird. Die elektrochemischen Eigenschaften der PEDOT beschichtete WE wird unter Verwendung Lebensläufe in Redox-aktive Lösung (dh 2 mM Kaliumhexacyanoferrat (K ₃ Fe (CN) _6)). Basierend auf dem CV-Profil wurde Randles-Sevcik Analyse verwendet werden, um die effektive Oberfläche ¹⁰ zu bestimmen. Spin-Coating bei 1500 rpm wird verwendet, um ~ 2 um dick ionenselektiven Membranen (ISMS) auf den MAB Arbeiten Elektroden (WES) gegossen.

Die MAB in einem Mikrofluidik-Kammer-Zelle mit 150 ul Volumen Algenmedium gefüllt enthalten, die Kontaktpads elektrisch mit der BASI verbunden (Abb.Abbildung 4). Die photosynthetische Aktivität von Chlorella vulgaris ist in Umgebungslicht und dunkler Umgebung überwacht.

Protokoll

Ein. Herstellung von Poly (3,4-ethylendioxythiophen): Poly (natrium-4-styrolsulfonat) (PEDOT: PSS) Elektropolymerisation Lösung für H ⁺ und CO ₃ ^{2 -} Ionen

1. In 70 mg Poly (natrium-4-styrolsulfonat) (Na ⁺ PSS ^-) und 10 ml entionisiertem (DI) Wasser und Wirbel bis alles aufgelöst ist (ca. 10 sec).
2. In 10,7 ul 3,4-ethlyenedioxythiophene (EDOT) zu der Lösung in 1.1 und Wirbel, bis die Lösung vollständig vermischt wird.

2. Herstellung von Poly (3,4-ethylendioxythiophen): Calciumsulfat (PEDOT: CaSO ₄₎ Elektropolymerisation Lösung für Ca ^{2 +-Ionen}

1. In 136 mg Calciumsulfat (CaSO ₄₎ bis 10 ml VE-Wasser und Wirbel, die Lösung wird nicht vollständig zerstreuen und milchig.
2. In 10,7 ul EDOT der Lösung in 2.1 und Wirbel, bis sie vollständig vermischt.

3. Elektropolymerisation von PEDOT-basierteLeitfähigem Polymer

1. Ein Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 Stand Zelle (Abbildung 3) und eine EG-Epsilon Potentiostaten / Galvanostat werden verwendet, um die elektrochemische Zelle für Elektropolymerisationsverfahren bilden. Legen Sie die EDOT: PSS Elektropolymerisationsverfahren Lösung in der elektrochemischen Zelle und Stickstoff-Blase für 20 min, um gelösten Sauerstoff zu entfernen.
2. Jetzt Clip eine Platin-Gaze ​​an der Gegenelektrode Position der elektrochemischen Zelle. Dann schneiden Sie die MAB an der Arbeitselektrode Position der elektrochemischen Zelle mit den Arbeits-Elektroden mit Blick auf den Platin-Gaze. Einstellen der MAB Tiefe, so dass nur die kreisförmigen Elektroden in der PEDOT eingetaucht: PSS Elektropolymerisation Lösung. Vermeiden Lösung Kontakt mit den quadratischen elektrischen Kontaktstellen.
3. Legen Sie eine BASI gesättigte Silber / Silberchlorid (Ag / AgCl) Elektrode in der Referenz-Elektrode Position des elektrochemischen Zelle. Stellen Sie sicher, dass die Referenz-Elektrode ist nicht zwischen dem Arbeits-und counter Elektroden.
4. Für PEDOT: PSS Abscheidung: Blase die elektrochemische Zelle für 20 min, und verwenden Sie die EG epsilon Potentiostaten / Galvanostat einen einzigen Cyclovoltammogramm von 0 V laufen - 1.1V mit einer Abtastrate von 20 mV / sec auf einem ± 100 uA Skala.
5. Für PEDOT: CaSO ₄ Abscheidung: Blase die elektrochemische Zelle für 20 min, und verwenden Sie die EG epsilon Potentiostaten / Galvanostat zu Chronopotentiometrie bei 814 nA laufen für 30 min.

4. Cyclovoltammetrie von PEDOT-basierte Polymer-Konjugate in K ₃ Fe (CN) ₆

1. Führen Sie die Schritte 3,1-3,3 oben.
2. Verwenden Sie die EG epsilon Potentiostaten / Galvanostat einzelne Cyclovoltammogramme von -653 mV bis 853 mV laufen mit unterschiedlichen Abtastraten von (25, 50, 75, 100, l25, 150, 175, 200) mV / sec auf einem ± 10 uA Skala .

5. Funktionalisierung von Oberflächen Protocol

1. Kaution leitfähigen Polymer-Konjugat spezifisch für die Ionen von Interesse, wie in Schritt 3.
2. Bewerben ionenselektiven Membran wie in Schritt 6.

6. Verwendung des ionenselektiven Membran

1. Zentrieren Sie das MAB auf dem Vakuum spinner Futter.
2. Kaution 100 ul Membran auf der Mitte des MAB und Lauf.
3. Spin-Coat-ionenselektive Membran mit einem Spin-Coater bei 1500 UpM für 30 Sekunden mit einer 5 sec Rampe nach oben und unten.
4. Saugen Sie den Spin-Coating MAB für 30 min backen und den Chip in einem Ofen bei 70 ° C für 20 min.

7. Kalibrierung von PEDOT-PSS leitfähige Polymer-Konjugat mit pH-Wert und Carbonate (CO ₃ ^{2 -)} Ionen-selektive Membran

1. Zustand der MAB über Nacht in 10 uM Natriumhydrogencarbonat (NaHCO ₃₎ und 5 mM Kaliumchlorid (KCl) in Algen Medien.
2. Legen Sie die MAB in der Mikrofluidik-Zell-Chip-Halter.
3. Spritzen 5 ml Testlösung mit Anfangs-pH-Wert oder der Konzentration (zB pH 4 oder 10 pM für CO ₃ ^{2 -).} Entfernen bubBles aus dem Strom-Zell-Chip-Halter.
4. Setzen Sie den Durchfluss-Zelle Chip Halter auf dem Strom-Zelle elektrische Leuchte.
5. Öffnen Sie die EG Epsilon Software und geben Ruhepotential (OP)-Modus. Stellen Sie die Zeit bis 300 min, die Spannung Skala bis ± 1 V und der Cutoff-Frequenz 10 kHz, und notieren Sie den Wert alle 2 Sek..
6. Lassen Sie die MAB stabilisieren (suchen Sie nach einer flachen Linie), bevor Sie mit der Kalibrierung.
7. Sobald die MAB stabilisiert ist, spülen Sie die Messzelle mit Testlösung und injizieren das nächste Konzentration kalibriert werden (pH 5 oder 25 pM CO ₃ ^{2 -).} Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen sind erlaubt, um den Fluss Zelle eingeben. Die Schritte 7.5 und 7.6 für pH 6, 7, 8 und 9 oder CO ₃ ^{2 -} Konzentrationen von 50, 75, 100, 250, 500, 750 und 1000 um.
8. Nachdem die letzte Konzentration ausgeführt wurde, entfernen Sie die MAB und mit Stickstoff trocken Luft.
9. Legen Sie die MAB wieder in frischem Klimaanlage Lösung bis zum nächsten Gebrauch.

8. Kalibrierung von PEDOT: CaSO ₄ leitfähige Polymer-Konjugat in CaCl ₂

1. Zustand der MAB über Nacht in 7 ml 0,1 M CaCl ₂ und 10 uM NaNO _3.
2. Folgen Sie den Schritten ähnlich 7,2-7,10. In Schritt 8.3, ersetzen Carbonat Testlösung mit einer anfänglichen Konzentration von 0,01 mM CaCl _2. Wiederholen für Test-Lösung Konzentrationen von 0,05, 0,1, 0,5, 1 und 10 mm.

Ergebnisse

Ein Beispiel für eine zyklische voltammetrische Kurve (CV) Ergebnis der PEDOT: PSS und dem entsprechenden kathodischen Spitzenstrom (I _p) verglichen mit der Abtastrate (v _1/2) sind in den Fig. 5a und 5b gezeigt. PEDOT: CaSO ₄ bei verschiedenen Abtastraten und seine kathodischen Spitzenstrom sind nicht dargestellt. Mit Randles-Sevcik Analyse ^10, die wirksamen Flächen des festen Kontakt PEDOT: PSS und PEDOT: CaSO _4...

Diskussion

Die MAB Biochip besteht aus Assises, die von einem ISM auf einem PEDOT-basierte CP Konjugat Transduktion Schicht auf einem Pt-Elektrode, deren Kombination die Ionenkonzentration von Interesse umwandelt, um ein messbares elektrisches Signal ausgebildet sind. Eine stabile Elektrodenpotential wird sowohl durch die CP-Schicht und der ISM Schicht definiert. Beide Schichten bestimmen auch die Betriebslebensdauer des MAB und die Qualität (Rauschen, Drift) der gemessenen elektrischen Signals.

PEDOT...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Ethylenedioxythiophene	Sigma-Aldrich	483028
Poly(sodium 4-styrenesulfonate)	Sigma-Aldrich	243051
EC epsilon galvanostat/potentiostat	Bioanalytical Systems Inc.	e2P
Saturated Ag/AgCl reference electrode	Bioanalytical Systems Inc.	MF-2052
Pt gauze	Alfa Aesar	10283
Potassium ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Potassium nitrate	J.T. Baker	3190-01
Sodium bicarbonate	Mallinckrodt/ Macron	7412-12
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S-7127
Calcium chloride	J.T. Baker	1311-01
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Calcium sulphate	Sigma-Aldrich	237132
C3 cell stand	Bioanalytical Systems Inc.	EF-1085
Flow-cell chip holder			Custom, courtesy of NASA Ames
Flow-cell electrical fixture			Custom, courtesy of NASA Ames
Table 2. Specific reagents and equipment.