Multi-аналита биочипов (МАБ) на основе всех твердотельных ион-селективных электродов (пачка) для физиологических исследований

Резюме

Все твердотельные ион-селективных электродов (ASSISEs), построенных из проводящего полимера (CP) преобразователь обеспечивают несколько месяцев функциональной жизни в жидких средах. Здесь мы описываем изготовление и калибровка процесса ASSISEs в лаборатории-на-чипе формате. Assise доказано, сохранили почти нернстовским профиля склона после длительного хранения в сложных биологических средах.

Аннотация

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media ^1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H⁺, Ca²⁺, and CO₃^2- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.

The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface ^5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) ^7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).

Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO₃^2- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca²⁺ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.

The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.

Biochip Design and Experimental Methods

The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 μm in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 μm in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.

Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H⁺ and CO₃^2-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO₄) is utilized for Ca²⁺. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K₃Fe(CN)₆)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area ¹⁰. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 μm thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).

The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 μl volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

протокол

1. Получение поли (3,4-этилендиокситиофена): поли (натрий 4-стиролсульфоната) (PEDOT: PSS) электрополимеризации решение для Н ⁺ и CO ₃ ^{2 -} ионы

1. Добавить 70 мг поли (натрий 4-стиролсульфоната) (PSS Na ^{+ -)} в 10 мл деионизированной (ДИ) воды и вихрь до полного диспергирования (примерно 10 секунд).
2. Добавить 10,7 мкл 3,4-ethlyenedioxythiophene (Edot) к решению в 1,1 и вихревые, пока решение не будет полностью перемешаны.

2. Получение поли (3,4-этилендиокситиофена): Сульфат кальция (PEDOT: CaSO ₄₎ электрополимеризации решение для ионов Са ^{2 +}

1. Добавить 136 мг сульфата кальция (CaSO ₄₎ по 10 мл деионизированной воды и вихревые, решение не будет полностью разойтись и кажется молочной.
2. Добавить 10,7 мкл Edot к решению в 2,1 и вихревые, пока полностью перемешаны.

3. Электрополимеризации из PEDOT основеПолимерные

1. Биоаналитическая Systems, Inc (BASI) C3 клетки подставке (Рисунок 3) и EC эпсилон потенциостате / гальваностатом используются для формирования электрохимической ячейки для электрополимеризации. Поместите Edot: PSS решение электрополимеризации в электрохимической ячейке и азота пузырь в течение 20 мин для удаления растворенного кислорода.
2. Теперь клип платины марли на встречной позиции электрода электрохимической ячейки. Затем закрепите МАБ на рабочем электроде положение электрохимической ячейки с рабочими электродами, стоящих перед платиной марлю. Регулировка глубины МАВ, так что только круговые электроды погружены в PEDOT: PSS решение электрополимеризации. Избегайте контакта с решением квадратных электрических контактных площадок.
3. Наведите BASI насыщенных серебро / хлорид серебра (Ag / AgCl) электродом в положении электрода сравнения электрохимической ячейки. Убедитесь в том, что ссылка электрод не между рабочим и CounteR электродов.
4. Для PEDOT: PSS осаждения: Bubble электрохимической ячейке в течение 20 мин, а также использовать EC эпсилон потенциостате / гальваностатом для выполнения одной циклической вольтамперограмме с 0 - 1,1 В со скоростью сканирования 20 мВ / сек на ± 100 мкА масштабе.
5. Для PEDOT: CaSO ₄ осаждения: Bubble электрохимической ячейке в течение 20 мин, а также использовать EC эпсилон потенциостате / гальваностатом запустить хронопотенциометрии 814 нА в течение 30 мин.

4. Циклической вольтамперометрии из PEDOT на основе полимерных конъюгатов в K ₃ Fe (CN) ₆

1. Выполните пункты 3.1-3.3 выше.
2. Используйте EC эпсилон потенциостате / гальваностатом для запуска одного из циклических вольтамперограмм -653 мВ до 853 мВ с различной скорости сканирования (25, 50, 75, 100, L25, 150, 175, 200) мВ / сек на ± 10 мкА масштабе .

5. Протокол поверхности Функционализация

1. Депозит проводящий полимер сопряженного специфичных для ионов представляет интерес как в шаге 3.
2. Применить ион-селективные мембраны, как в шаге 6.

6. Применение ионообменной мембраной

1. Центр МАБ на вакуумном Spinner патрона.
2. Депозит 100 мкл мембран на центр МАБ и запустить.
3. Спин-пальто ион-селективные мембраны со спином нанесения покрытий при 1500 оборотах в минуту в течение 30 сек с 5 сек рампы вверх и вниз.
4. Вакуумные спин-покрытием МАВ в течение 30 мин и выпекать чипа в печи при 70 ° С в течение 20 мин.

7. Калибровка PEDOT-PSS полимерные сопряженных с рН и карбонатной (CO ₃ ^{2 -)} с ионообменной мембраной

1. Условие МАБ в течение ночи в 10 мкМ бикарбонат натрия (NaHCO ₃₎ и 5 мМ хлорид калия (KCl) в средствах массовой информации водорослей.
2. Вставьте МАБ в микрожидкостной поток-клеточного чипа держателя.
3. Введите 5 мл исследуемого раствора с начальным значением рН или концентрации (например, при рН 4 или 10 мкМ для CO ₃ ^{2 -).} Удалите пузырькиБлес от потока-клеточного чипа держателя.
4. Поместите поток-клеточного чипа держатель на поток-клеток электрического прибора.
5. Откройте программу ЕС эпсилон и введите холостого потенциала (ОП) режиме. Установите время 300 мин, напряжение масштабе ± 1 В, а частота среза до 10 кГц, и запишите значение раз в 2 сек.
6. Пусть МАБ стабилизации (ищите плоская линия) перед продолжением процесса калибровки.
7. Как только стабилизируется МАБ, промойте проточной ячейки с испытуемым раствором и ввести следующую концентрацию быть откалиброван (рН 5 или 25 мкм CO _​​3 ^{2 -).} Убедитесь, что не было пузырей разрешили войти в проточную ячейку. Повторите этапы 7,5 и 7,6 для рН 6, 7, 8, 9 или СО ₃ ^{2 -} концентрациях 50, 75, 100, 250, 500, 750 и 1000 мкМ.
8. После последней концентрации побежал, удалите МАБ и сухой азот с воздуха.
9. Положите заднюю МАБ в свежий раствор для кондиционирования до следующего использования.

8. Калибровка PEDOT: CaSO ₄ полимерные сопряжены в CaCl ₂

1. Условие МАБ ночь в 7 мл 0,1 М CaCl ₂ и 10 мкМ NaNO _3.
2. Выполните шаги похожи на 7.2 - 7.10. На шаге 8.3, заменить раствором карбоната тест при начальной концентрации 0,01 мМ CaCl _2. Повторите тест-раствор концентрации 0,05, 0,1, 0,5, 1 и 10 мМ.

Результаты

Примером циклического вольтамперограмме (CV) Результат PEDOT: PSS и соответствующей катодной пиковый ток (I _P) в зависимости от скорости сканирования (у _1/2) показаны на фиг.5а и 5b соответственно. PEDOT: CaSO ₄ при различных скоростях сканирования и ег?...

Обсуждение

МАВ состоит из биочипа ASSISEs, которые построены из ISM вершине PEDOT на основе сопряженных CP трансдукции слой на электроде Pt, сочетание которых преобразовывает ионной концентрации интерес к измеримой электрический сигнал. Стабильный потенциал электрода определяется как слой CP и слой ISM. Об?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Ethylenedioxythiophene	Sigma-Aldrich	483028
Poly(sodium 4-styrenesulfonate)	Sigma-Aldrich	243051
EC epsilon galvanostat/potentiostat	Bioanalytical Systems Inc.	e2P
Saturated Ag/AgCl reference electrode	Bioanalytical Systems Inc.	MF-2052
Pt gauze	Alfa Aesar	10283
Potassium ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Potassium nitrate	J.T. Baker	3190-01
Sodium bicarbonate	Mallinckrodt/ Macron	7412-12
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S-7127
Calcium chloride	J.T. Baker	1311-01
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Calcium sulphate	Sigma-Aldrich	237132
C3 cell stand	Bioanalytical Systems Inc.	EF-1085
Flow-cell chip holder			Custom, courtesy of NASA Ames
Flow-cell electrical fixture			Custom, courtesy of NASA Ames
Table 2. Specific reagents and equipment.