Multi-analita biochip (MAB) Sulla base di elettrodi ionoselettivi All-a stato solido (ASSISE) per la ricerca fisiologica

Riepilogo

Elettrodi ione-selettivi All-a stato solido (Assise) costruiti da un polimero conduttivo trasduttore (CP) forniscono diversi mesi di vita funzionale in mezzi liquidi. Qui, descriviamo il processo di fabbricazione e la taratura di Assise in un formato lab-on-a-chip. L'ASSISE è dimostrato di aver mantenuto un profilo pendio vicino-Nernst dopo stoccaggio prolungato in mezzi biologici complessi.

Abstract

Lab-on-a-chip applicazioni (LOC) in, ricerca ambientale, biomedico, agricolo biologico, e il volo spaziale richiedono un elettrodo ione-selettivo (ISE), in grado di sopportare lo stoccaggio prolungato in complessi mezzi biologici ^1-4. Uno ione-selettivo-elettrodo all-solid-state (ASSISE) è particolarmente attraente per le suddette applicazioni. L'elettrodo deve avere le seguenti caratteristiche favorevole: facilità di costruzione, manutenzione bassa, e (potenziale) di miniaturizzazione, consentendo l'elaborazione in batch. Un ASSISE microfabricated inteso per quantificare H ^+, Ca ^{2 +,} e CO ₃ ^{2 -} ioni è stato costruito. È costituita da uno strato di metallo nobile-elettrodo (cioè Pt), uno strato di trasduzione, ed una membrana ione-selettivo (ISM) strato. Le funzioni di strato di trasduzione di trasdurre la concentrazione-dipendente potenziale chimico della membrana ione-selettivo in un segnale elettrico misurabile.

Tegli durata di un ASSISE è trovato a dipendere mantenendo il potenziale al livello / interfaccia membrana conduttiva ^5-7. Per prolungare la vita utile di esercizio ASSISE e quindi mantenere i potenziali stabili presso gli strati interfacciali, abbiamo utilizzato il polimero conduttivo (CP) poli (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) ^7-9 al posto di argento / cloruro di argento (Ag / AgCl) come strato trasduttore. Abbiamo costruito la ASSISE in un formato lab-on-a-chip, che abbiamo chiamato il biochip multi-analita (MAB) (Figura 1).

Calibrazioni nelle soluzioni di prova hanno dimostrato che il MAB può monitorare il pH (pH operativa 4-9), CO ₃ ^{2 -} (misurata gamma 0,01 mm - 1 mm), e Ca ^{2 +} (range log-lineare 0,01 mm a 1 mm). Il MAB di pH fornisce una risposta pendio vicino-Nernst dopo quasi un mese di stoccaggio nel terreno di coltura algale. Biochip carbonato mostrano un profilo potenziometrico simile a quello di un elettrodo ione-selettivo convenzionale. Physiolmisurazioni ogical stati impiegati per monitorare l'attività biologica del sistema modello, la microalga Chlorella vulgaris.

Il MAB veicola un vantaggio in termini di dimensioni, versatilità, e multiplex analita capacità di rilevamento, che lo rende applicabile a molte situazioni di monitoraggio ristretti, sulla Terra o nello spazio.

Biochip Disegno e Metodi Sperimentali

Il biochip è di 10 x 11 mm di dimensioni e dispone di 9 Assise designati come elettrodo di lavoro (WE) e 5 elettrodi di riferimento Ag / AgCl (RES). Ogni elettrodo di lavoro (WE) è di 240 micron di diametro ed è equamente distanziati a 1,4 mm dal RE, che sono 480 micron di diametro. Questi elettrodi sono collegati a rilievi del contatto elettrico con una dimensione di 0,5 mm x 0,5 mm. Lo schema è mostrato in Figura 2.

Voltammetria ciclica (CV) e metodi di deposizione galvanostatici sono usati per i film electropolymerize Pedot utilizzando un BioanalyticAl Systems Inc. (BASI) supporto cella C3 (Figura 3). Il contro-ione del film PEDOT è adatta a soddisfare lo ione analita di interesse. Un PEDOT con poli (styrenesulfonate) contro ione (PEDOT / PSS) è utilizzata per H ⁺ e CO ₃ ^{2 -,} mentre uno con solfato (aggiunto alla soluzione come CaSO ₄₎ vengono usate per Ca ^{2 +.} Le proprietà elettrochimiche della PEDOT rivestita WE è analizzato tramite i CV in soluzione redox-attivo (cioè 2 mM potassio ferricianuro (K ₃ Fe (CN) _6)). Sulla base del profilo CV, analisi Randles-Sevcik stato utilizzato per determinare l'area superficiale effettiva ^10. Spin-coating a 1.500 giri viene utilizzato per lanciare ~ 2 micron di spessore membrane iono-selettivi (ISMS) sugli elettrodi di lavoro MAB (WE).

Il MAB è contenuto in una camera di flusso microfluidica-cella riempita con un volume di 150 ml di terreno di coltura algale; le trecce sono collegati elettricamente al sistema BASI (Figure 4). L'attività fotosintetica di Chlorella vulgaris è monitorato in luce ambiente e al buio.

Protocollo

1. Preparazione di Poli (3,4-ethylenedioxythiophene): Poli (sodio 4-styrenesulfonate) (PEDOT: PSS) elettropolimerizzazione Soluzione per H ⁺ e CO ₃ ^{2 -} Ioni

1. Aggiungere 70 mg di poli (sodio 4-styrenesulfonate) (Na ⁺ PSS ^-) a 10 ml deionizzata (DI) e vortex fino a completa dispersione (circa 10 sec).
2. Aggiungere 10,7 microlitri 3,4-ethlyenedioxythiophene (EDOT) alla soluzione in 1.1 e vortice finché la soluzione è completamente miscelato.

2. Preparazione di Poli (3,4-ethylenedioxythiophene): solfato di calcio (PEDOT: CaSO ₄₎ elettropolimerizzazione Soluzione per Ca ^{2 +} ioni

1. Aggiungere 136 mg di solfato di calcio _(CaSO4) a 10 ml di acqua deionizzata e vortice, la soluzione non sarà completamente disperdere e un aspetto lattiginoso.
2. Aggiungere 10,7 ml EDOT alla soluzione in 2.1 e vortex fino a quando completamente mescolato.

3. Elettropolimerizzazione di PEDOT-basedPolimerici

1. Un Bioanalytical Systems Inc. (BASI) Cavalletto cella C3 (figura 3) e un epsilon CE potenziostato / galvanostato sono usati per formare la cella elettrochimica per elettropolimerizzazione. Collocare il EDOT: soluzione elettropolimerizzazione PSS nella cella elettrochimica e la bolla di azoto per 20 minuti per rimuovere l'ossigeno disciolto.
2. Ora ritagliare una garza platino nella posizione contro elettrodo della cella elettrochimica. Agganciare il MAB nella posizione dell'elettrodo di lavoro della cella elettrochimica con gli elettrodi di lavoro che affrontano il platino garza. Regolare la profondità MAB in modo che solo gli elettrodi circolari sono sommersi nel PEDOT: soluzione elettropolimerizzazione PSS. Evitare il contatto con la soluzione gli elettrodi di contatto elettrico quadrati.
3. Posizionare un saturo argento / cloruro di argento BASI (Ag / AgCl) elettrodo nella posizione dell'elettrodo di riferimento della cella elettrochimica. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento non è tra il lavoro e counter elettrodi.
4. Per PEDOT: deposizione PSS: Bolla della cella elettrochimica per 20 minuti, e utilizzare la CE epsilon potenziostato / galvanostato per eseguire un singolo voltammogramma ciclico da 0 V - 1,1 V, con una velocità di scansione di 20 mV / sec su una scala di ± 100 μA.
5. Per PEDOT: CaSO ₄ deposizione: Bolla della cella elettrochimica per 20 minuti, e utilizzare la CE epsilon potenziostato / galvanostato correre cronopotenziometria a 814 nA per 30 min.

4. Voltammetria ciclica di coniugati polimero PEDOT a base di K ₃ Fe (CN) ₆

1. Eseguire i passaggi 3,1-3,3 sopra.
2. Utilizzare la CE epsilon potenziostato / galvanostato correre voltammograms ciclici singoli da -653 mV a 853 mV con diverse frequenze di scansione di (25, 50, 75, 100, l25, 150, 175, 200) mV / sec su una scala di ± 10 μA .

5. Funzionalizzazione superficiale protocollo

1. Cassetta di polimero conduttivo coniugato specifico per gli ioni di interesse come al punto 3.
2. Applicare membrana ione-selettivi, come nel passaggio 6.

6. Applicazione della membrana ionoselettivo

1. Centrare il MAB sul vuoto filatore mandrino.
2. Cauzione 100 membrana microlitri sul centro del MAB e corsa.
3. Spin-coat membrana ione-selettivo con una induzione di rotazione a 1500 rpm per 30 sec con una rampa di 5 secondi su e giù.
4. Aspirare il MAB spin-rivestito per 30 minuti e cuocere il chip in un forno a 70 ° C per 20 min.

7. Taratura di PEDOT-PSS Polimerici Coniugato con pH e carbonato (CO ₃ ^{2 -)} Membrana ionoselettivo

1. Condizione del MAB durante la notte in 10 mM di bicarbonato di sodio _(NaHCO3) e 5 mM di cloruro di potassio (KCl) in supporti algali.
2. Inserire il MAB nel supporto chip microfluidica cella a flusso.
3. Iniettare 5 ml di soluzione di prova con il valore iniziale del pH o concentrazione (ad esempio, pH 4 o 10 micron per CO ₃ ^{2 -).} Rimuovere bubBles dal titolare chip di cella a flusso.
4. Posizionare il supporto di chip flusso delle cellule sul dispositivo elettrico cella a flusso.
5. Aprire il software CE epsilon ed entrare in modalità potenziale di riposo (OP). Impostare il tempo di 300 min, la scala di tensione di ± 1V, e la frequenza di taglio a 10 kHz, e registrare il valore ogni 2 secondi.
6. Lasciate che il MAB stabilizzi (cercare una linea piatta) prima di continuare con il processo di calibrazione.
7. Una volta che il MAB è stabilizzato, sciacquare la cella di flusso con la soluzione di prova e iniettare la prossima concentrazione da calibrare (pH 5 o 25 mM CO ₃ ^{2 -).} Assicurarsi che non bolle sono autorizzati a entrare nella cella di flusso. Ripetere i passi 7.5 e 7.6 per pH 6, 7, 8, e 9 o CO ₃ ^{2 -} concentrazioni di 50, 75, 100, 250, 500, 750 e 1.000 micron.
8. Dopo l'ultima concentrazione ha eseguito, togliere il MAB e asciugare con aria azoto.
9. Riposizionare il MAB in soluzione di condizionamento fresco fino all'utilizzo successivo.

8. Calibrazione di PEDOT: CaSO ₄ Polimerici Coniugato in CaCl ₂

1. Condizione del MAB durante la notte in 7 ml di 0,1 M CaCl ₂ e 10 micron nano _3.
2. Seguire i passaggi simili a 7,2-7,10. Nel passo 8.3, sostituire soluzione di prova carbonato con una concentrazione iniziale di 0,01 mM CaCl _2. Ripetere l'operazione per le concentrazioni di test-soluzione di 0,05, 0,1, 0,5, 1 e 10 mm.

Risultati

Un esempio di un voltammogramma (CV) risultato ciclica di PEDOT: PSS e la corrispondente corrente di picco catodica (i _p) vs la frequenza di scansione (v _1/2) sono mostrati nelle Figure 5a e 5b, rispettivamente. PEDOT: CaSO ₄ a varie frequenze di scansione e il suo picco di corrente catodica non sono mostrate. Utilizzando Randles Sevcik-analisi ^10, le aree superficiali effettive del contatto solido PEDOT PSS e PEDOT: Ca...

Discussione

Il MAB biochip consiste di Assise che sono costruiti da un ISM cima a un coniugato CP strato trasduzione PEDOT basato su un elettrodo di Pt, la cui combinazione trasduce la concentrazione ionica di interesse ad un segnale elettrico misurabile. Un potenziale elettrodo stabile è definita sia lo strato di CP e lo strato ISM. Entrambi gli strati determinano anche la vita di lavoro del MAB e la qualità (rumore, deriva) del segnale elettrico misurato.

PEDOT è particolarmente attraente come stra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Ethylenedioxythiophene	Sigma-Aldrich	483028
Poly(sodium 4-styrenesulfonate)	Sigma-Aldrich	243051
EC epsilon galvanostat/potentiostat	Bioanalytical Systems Inc.	e2P
Saturated Ag/AgCl reference electrode	Bioanalytical Systems Inc.	MF-2052
Pt gauze	Alfa Aesar	10283
Potassium ferricyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Potassium nitrate	J.T. Baker	3190-01
Sodium bicarbonate	Mallinckrodt/ Macron	7412-12
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S-7127
Calcium chloride	J.T. Baker	1311-01
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Calcium sulphate	Sigma-Aldrich	237132
C3 cell stand	Bioanalytical Systems Inc.	EF-1085
Flow-cell chip holder			Custom, courtesy of NASA Ames
Flow-cell electrical fixture			Custom, courtesy of NASA Ames
Table 2. Specific reagents and equipment.