Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie

Résumé

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Résumé

La spectroscopie de force atomique est un outil idéal pour étudier des molécules sur des surfaces et des interfaces. Un protocole expérimental pour coupler une grande variété de molécules simples de manière covalente sur une pointe d'AFM est présenté. Dans le même temps la pointe AFM est passive pour prévenir les interactions non spécifiques entre la pointe et le substrat, qui est une condition préalable pour étudier molécules simples attachés à la pointe de l'AFM. Analyses pour déterminer la force d'adhérence, la longueur d'adhérence, et l'énergie libre de ces molécules sur des surfaces solides et bio-interfaces sont peu présentés et références externes pour davantage de lecture sont fournis. molécules d'exemple sont les polytyrosine poly (acides aminés), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine). Ces molécules sont désorbés de surfaces différentes, comme CH ₃ -SAMs, l'hydrogène fin diamant et soutenus bicouches lipidiques dans diverses conditions de solvant. Enfin, laavantages de la force spectroscopiques expériences de molécules simples sont discutés comprenant des moyens pour décider si vraiment une seule molécule a été étudié dans l'expérience.

Introduction

Au cours des 30 dernières années, la microscopie à force atomique (AFM) se est avérée être une technique d'imagerie précieux pour étudier biologiques ^1,2 synthétiques et des matériaux et des surfaces ^3, car il fournit une résolution spatiale moléculaire dans les trois dimensions et peut être utilisé dans divers solvant environnements. En outre, la force de molécule spectroscopie AFM-unique (SMFS) permet de mesurer des forces allant de la PN μN régime et a donné un aperçu sans précédent par exemple dans le repliement des protéines ^4,5, la physique des polymères ^6-8, et seule interaction molécule-surface ^{9 - 12}....

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Protocole

REMARQUE: Voir la Figure 2 pour un aperçu du flux de traitement comprenant la préparation, l'acquisition des données et d'analyse de données étapes.

1. Réactif Setup

REMARQUE: Tous les produits chimiques doivent être manipulés avec soin, et donc une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection devraient être utilisées. Toutes les opérations doivent être effectuées dans une hotte de laboratoire. En particulier, des gants spéciaux doivent être portés en cas d'utilisation de chloroforme.

1. Utiliser des produits chimiques avec faible teneur en eau tel que le ....

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Résultats

Dans ce qui suit, les résultats décrits ci-dessus pour l'exemple des molécules, à savoir la polytyrosine polymères poly (acide aminé), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide, sont présentés. Première pour chaque exemple, expérimenter des détails spécifiques pour l'acquisition des données et la préparation des données sont fournies. Ensuite, les résultats exemplaires pour des expériences où ces molécules ont été désorbé de surfaces différentes (CH ₃ -SAM.......

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Discussion

Durant les dernières décennies, des expériences de molécules simples ont donné un aperçu sans précédent sur les mécanismes moléculaires et se est avéré être une approche précieuse en sciences de la vie et au-delà. Pour obtenir de bons et significatives expériences statistiques de SMF, idéalement une seule et même molécule est utilisée sur toute la durée de l'expérience. Contrairement aux expériences avec des ensembles de molécules, des expériences SMF sont capables de détecter des événeme.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)	Hellma
RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))	Sigma
Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane	Vectorlabs
Dry acetone (< 50 ppm H2O)	Sigma
Dry chloroform (> 99.9%)	Sigma
Triethylamine	Sigma
Ultrapure water	Biochrom, Germany
Di-sodium tetraborate (> 99.5%)	Biochrom, Germany
Boric Acid	Biochrom, Germany
Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Probe molecule (polymer, lipid, etc.)
Equipment
Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids	VWR International GmbH, Germany
[header]
Laboratory oven model UF30	Memmert, Germany
Temperature controlled sonicator	VWR International GmbH, Germany
Plasma system "Femto", 100 W	Diener, Germany
One separate glass syringe for each organic solvent	VWR International GmbH, Germany
Vortex mixer	VWR International GmbH, Germany
Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)	Eppendorf
Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl	Eppendorf
AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater)	Asylulm Research, Santa Barbara
Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT)	Bruker AXS, Santa Barbara