Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza

Riepilogo

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Abstract

Spettroscopia a forza atomica è uno strumento ideale per lo studio di molecole a superfici e interfacce. Un protocollo sperimentale per accoppiare una grande varietà di singole molecole covalentemente su una punta AFM è presentato. Allo stesso tempo, la punta AFM viene passivato per evitare interazioni aspecifiche tra la punta e il substrato, che è un prerequisito per studiare singole molecole allegate alla punta AFM. Le analisi per determinare la forza di adesione, la lunghezza di adesione, e l'energia libera di queste molecole su superfici solide e bio-interfacce sono poco presentati e sono forniti riferimenti esterni per ulteriori letture. Molecole esempio sono le polytyrosine poli (aminoacidi), il polimero trapianto PI- g -PS e fosfolipidi PAPA (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina). Queste molecole sono desorbiti da superfici diverse come CH ₃ -SAMs, idrogeno terminato diamante e supportati doppi strati lipidici in varie condizioni di solvente. Infine, lavantaggi di forza spettroscopiche esperimenti di singola molecola sono discussi tra cui mezzi per decidere se veramente una singola molecola è stato studiato nell'esperimento.

Introduzione

Negli ultimi 30 anni, microscopia a forza atomica (AFM) è risultato essere una tecnica di imaging prezioso per studiare biologici ^1,2 e ³ sintetici materiali e superfici in quanto fornisce una risoluzione spaziale molecolare in tre dimensioni e può essere azionato in vari solventi ambienti. Inoltre, la spettroscopia di forza molecola AFM-single (SMFS) permette di misurare le forze che vanno dal PN μN regime e ha dato una visibilità senza precedenti, ad esempio in proteine ​​pieghevole ^4,5, polimero fisica ^6-8, e singola interazione molecola-superficie ^{9 - 12} .La logica studiare singole molecole, piuttosto che un insieme di molecole è quello di evitare gli effetti che spesso mascherano rari eventi o stati molecolari nascosti media. Inoltre, un gran numero di parametri molecolari, quali la lunghezza del profilo, la lunghezza Kuhn, l'energia libera di adesione, ecc può essereottenuto. Questa procedura è descritta negli esempi che seguono. In un tipico esperimento AFM-SMFS, la molecola sonda è accoppiato ad una punta molto affilata tramite una molecola linker. La punta sé è situato alla fine di un cantilever pieghevole. Se la punta viene portato a contatto con la superficie della molecola sonda interagire con questa superficie. Osservando la deflessione del cantilever su retrazione della punta, la forza, e quindi l'energia libera, per staccare la molecola dalla superficie può essere determinato. Per ottenere statistiche significative, un gran numero di cosiddetti curve forza-distanza devono essere acquisiti. Inoltre, per avere veri esperimenti singola molecola (cioè, utilizzando una stessa molecola di sonda per la durata di tutto l'esperimento) la molecola sonda deve essere accoppiato covalentemente alla punta AFM. Qui, un protocollo sperimentale per cantilever funzionalizzazione con una singola molecola mediante un legame covalente è presentato. La singola molecola può o essere accoppiato tramite un amino o tioGruppo L alla punta AFM. Il processo di coniugazione può essere effettuata in una grande varietà di solventi (organici e acquosi) per spiegare le proprietà di solvatazione dei polimeri utilizzati.

Nella prima parte, un protocollo generale per attaccare covalentemente una singola molecola ("probe molecola") tramite una molecola linker di una punta AFM descritto. A tal fine, NHS- organico o maleimmide-chimica viene utilizzato ^13. Insieme con il protocollo per tre molecole esempio, i processi di acquisizione dati e di analisi dei dati sono descritti e sono forniti i riferimenti per ulteriori letture. Le molecole di esempio sono: il (lineare) tirosina polimero, il polimero trapianto PI- g -PS e il papa lipidi. Questo include lievi variazioni del protocollo, per esempio per collegare covalentemente cisteine. Inoltre, una sezione dedicata alla preparazione di superfici differenti come superficie diamantata, un CH ₃ -self-assemblato monostrato e bistrati lipidici. Queste interfacce hanno provit di essere buone referenze ed esempi.

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Protocollo

NOTA: Vedi figura 2 per una panoramica del flusso di processo che comprende la preparazione, i passaggi di acquisizione dati e di analisi dei dati.

1. reagente Setup

NOTA: Tutte le sostanze chimiche devono essere maneggiati con cura, e quindi un camice da laboratorio, devono essere utilizzati guanti e occhiali protettivi. Tutte le operazioni devono essere eseguite in una cappa di laboratorio. In particolare, guanti speciali devono essere indossati in caso di uso di cloroformio.

1. Utilizzare prodotti chimici a basso contenuto d'acqua, come il cloroformio secca rapidamente e magazzino a secco, ma non più di una settimana. Conservare entrambe chimici a -20 ° C e sotto azoto o argon gas perché APTES ((3-amminopropil) triethoxysilan) (vedi Tabella 1) e PEG (polietilenglicole) sono igroscopici e PEG è soggetto ad ossidazione in aria.
2. Per evitare l'esposizione frequente dello stock di ossigeno atmosferico e umidità, preparare aliquote più piccoli, idealmente all'interno di un sistema vano portaoggetti con una cucina de azotori.

2. apparecchiature Setup

NOTA: Per evitare possibili contaminazioni, utilizzare vasi fresca e pulita per ogni passo.

1. Pulire vetro e pinzette in soluzione detergente per 30 min in un bagno ad ultrasuoni a 60 ° C.
2. Sciacquare e attrezzature sonicare dal punto 2.1 per due volte con acqua ultrapura.
3. Apparecchiature calore dal punto 2.1 in soluzione RCA (acqua ultrapura, acqua ossigenata e ammoniaca (5: 1: 1)) a 75 ° C in un forno per 45 minuti e successivamente risciacquare con acqua ultrapura.
4. Infine, asciugare il vetro e pinzette sotto flusso di azoto secco o in un forno (100 ° C, 3 h).

3. Tip Funzionalizzazione

NOTA: Utilizzare pinzette, navi, ecc in acciaio inox, PTFE, vetro o qualsiasi altro materiale che sia chimicamente stabile in soluzioni organiche se applicabile. Se non diversamente specificato, eseguire tutti i passaggi a RT. La quantità di soluzione di incubazione necessaria dipende dal numero di chip a sbalzo. Assicurarsi che i cantilever sono immersi nelle rispettive soluzioni a tutti i tempi.

NOTA: Utilizzare un cappuccio per evitare l'inalazione dei vapori organici.

1. Formazione di gruppi-OH sulla superficie a sbalzo ('attivazione') (circa 0,5 ore):
   1. Utilizzare le pinzette per posizionare i chip freschi sbalzo (materiale: peccato, costanti primavera: 10-100 PN / nm) su un vetrino pulito e metterli in una camera di plasma (100 W).
   2. Evacuare camera (~ 0,1 mbar).
   3. Camera a Flood con ossigeno gassoso e evacuare di nuovo.
   4. Attivare il processo al plasma (potenza: 20%, durata: 15 min, pressione di processo: 0.25 mbar).
2. Amino-silanizzazione di cantilever (circa 1 ora):
   1. Preparare 2,5 ml di soluzione APTES (vedi Tabella 1) in una piastra di Petri di vetro - do questa posizione durante il processo al plasma.
   2. Immediately dopo il processo al plasma, immergere ogni cantilever per 1 sec in acetone e metterli subito dopo nella soluzione APTES.
   3. Incubare per 15 minuti a RT.
   4. Sciacquare con cura i chip cantilever per due volte in 10 ml di acetone e una volta in 10 ml di cloroformio.
   5. Finali opzionali passo: chip posto a sbalzo dal passo precedente su un vetrino pulito e cuocere per 30 minuti a 70 ° C. Si noti che ci sono anche strategie alternative per l'attivazione di superficie, ad esempio, il trattamento UV ^12.
3. PEGylation (circa 2 ore):
   NOTA: Eseguire i punti 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanizzazione. NHS e gruppi maleimmide sono soggetti a idrolisi in ambienti acquosi e PEG stesso è soggetto ad ossidazione in aria. Pertanto temporizzazione (soprattutto tra i passaggi) è un parametro critico. Vedere ¹³ per ulteriori informazioni.
   1. Preparare la soluzione cloroformio (vedi Tabella 1).
   2. Per evitare la formazione di condensa, Warm PEG polveri fino a RT prima di aprire il un'aliquota pesata e la giusta quantità.
   3. Per l'accoppiamento di polimeri o lipidi con gruppi amminici, separatamente risolvere NHS-PEG-NHS (6 kDa) e metil-PEG-NHS (5 kDa) nella soluzione cloroformica vortexando fino a che non sono completamente risolti. Fare riferimento alla Tabella 1 per le concentrazioni.
      1. In alternativa. per l'accoppiamento di polimeri con gruppi tiolici separatamente risolvere Mal-NHS- PEG e metil-PEG-NHS in soluzione di cloroformio.
   4. Mescolare le soluzioni come richiesto per regolare un certo rapporto fra il numero di NHS- o maleimide- e le molecole di PEG metil-terminato (tipicamente 1: 500). Si noti che il rapporto ideale deve essere determinato iterativamente in una serie di cicli di preparazione-esperimento.
   5. Incubare chip sbalzo nella soluzione di PEG per 1 ora in un ambiente saturo cloroformio per evitare l'evaporazione del cloroformio.
4. Sonda coniugazione molecola(> 1 ora):
   NOTA: Nel seguente 3.4.1-3.4.3, tre esempi per l'accoppiamento covalente di diverse molecole sonda fino alla punta AFM sono descritti. Per ogni molecola il protocollo deve essere regolata. Ulteriore nota, che nell'esempio 1 e 3 NHS-chimica utilizzata mentre nell'esempio 2 del tiolo funzionalizzato polimero PI- g -PS è accoppiato al PEG-maleimmide via chimica. Per i dettagli, vedere ^14.
   1. Per poli (amminoacido) poli-D-tirosina (40-100 kDa)
      1. Sciogliere il polytyrosine coniugato sonda molecola in 1 M NaOH. Regolare la concentrazione di 1 mg / ml.
      2. Sostituire il NaOH per tampone borato di sodio (pH 8.1) con colonne di spin dissalazione (7 kDa MWCO) immediatamente prima della funzionalizzazione
      3. Risciacquare cantilever prima con 5 ml di cloroformio, poi con 5 ml di etanolo e infine con 5 ml di tampone borato.
      4. Incubare i chip a sbalzo per 1 ora nella soluzione tampone polytyrosine borato e poi risciacquare con tampone boratoe acqua ultrapura. Conservare in acqua ultrapura fino alla misura.
   2. Per polimeri con un backbone lineare (poliisoprene, 119 kDa) con catene laterali innestate (polistirolo, 88 kDa) ¹⁴
      1. Sciogliere il PI- g -PS in cloroformio asciutta. Regolare la concentrazione della soluzione coniugazione a 4 mg / ml.
      2. Risciacquare le cantilever con 5 ml di cloroformio e incubare per almeno 1 ora in soluzione coniugazione.
      3. Risciacquare nuovamente in 5 ml di cloroformio e memorizzare in cloroformio in un ambiente saturo cloroformio (per evitare l'evaporazione cloroformio) fino alla misura.
   3. Per la lipidi PAPA
      1. Sciogliere PAPA in cloroformio asciutta. Regolare la concentrazione di 20 mm.
      2. Risciacquare le cantilever con 5 ml di etanolo e 5 ml di acqua ultrapura prima incubazione delle cantilever per 1 hr nella soluzione lipidica.
      3. Dopo l'incubazione, risciacquare cantilever con 5 ml di cloroformio, 5 ml di ethanol e 5 ml di acqua calda e ultrapura (in questo ordine) per rimuovere molecole sonda non legato e di sbarazzarsi di residui di cloroformio. Utilizzare immediatamente punte funzionalizzate. In alternativa, memorizzarli in cloroformio fino al momento.

Figura 1. (A) Schema che mostra il processo di funzionalizzazione punta utilizzando l'esempio di NHS chimica. Bonding (B) Chemical impiegato per collegare una molecola sonda punta tramite un gruppo amminico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Preparazione 4. Surface

1. Self-assemblati monostrato (SAM)
   NOTA: Come superficie per il primo esempio, un monostrato auto-assemblato è stata scelta. Fare riferimento alla letteratura ¹⁵ per i dettagli.
   1. Vetrini pulite con soluzione detergente e poi due volte in acqua ultrapura in un bagno ad ultrasuoni per 30 min ciascuno. Poi, come un passo ulteriore pulizia, metterli nella soluzione RCA (vedi punto 2.3) a 75 ° C per 15 min.
   2. Rivestire le diapositive con 10 nm nichel cromo e oro 100 nm in una trafila sottovuoto. Poi conservare in frigorifero e pulito di nuovo nella soluzione RCA direttamente prima della fase successiva.
   3. Incubare i vetrini del passo precedente in 2 mM soluzione 1-dodecantiolo / etanolo per 12 ore. I gruppi tiolo si legano alla superficie d'oro e un monostrato auto idrofobica assembla. Risciacquare i vetrini con etanolo e acqua ultrapura e poi a secco da una corrente di gas di azoto. Confermare l'idrofobicità della superficie preparata con misure di angolo di contatto statico in un goniometro con una telecamera CCD ^10.
2. Hydrogen diamante terminato
   NOTA: Come una superficie per il secondo esempio, è stato scelto un idrogeno diamante terminato. La preparazione della superficie è stata eseguita come descritto in precedenza ^16.
3. Doppio strato lipidico supportati
   NOTA: Nell'ultimo esempio, una superficie supportato doppio strato lipidico (SLB) è stato utilizzato come superficie. Per ottenere una tale superficie, una soluzione (0,1 mg / ml) di grandi vescicole unilamellari (Luvs) costituiti dalla POPC fosfolipidi sono formati con il metodo di estrusione. Quindi 50 ml di soluzione LUV sono stati messi su un foglio di mica appena spaccati (A = 1 cm²) e incubate per 30 min. Infine la soluzione è stata lavata con 20 ml di acqua ultrapura. Vedere ^17,18 per una descrizione dettagliata della preparazione di SLB.

5. Acquisizione Dati

NOTA: Per gli esperimenti, utilizzare un AFM, che fornisce la capacità di misurare in liquidi. Le procedure di acquisizione dati e di analisi dei dati sono applicabili a prescindere dal modello di AFM utilizzato. Inoltre, in alcuni esperimenti è vantaggioso avere la possibilità di controllare la temperature all'interno della cellula liquido. Cantilever deflessione stata rilevata tramite il metodo di deflessione del fascio laser ^19. Costanti primavera sono stati determinati con il metodo del rumore termico ^20.

1. Inserire il cantilever funzionalizzata in un supporto cantilever AFM che è adatto per la misura in fluidi.
2. Mettere la superficie (preparazione vedi sopra) per campionare in AFM e coprire con del liquido. Entrambi, a sbalzo e la superficie dovrebbe ora essere immerso nel liquido con la punta a sbalzo che punta verso la superficie. Si noti che in molti casi una goccia di liquido è sufficiente. In ogni caso l'evaporazione del fluido dovrebbe essere evitato, per esempio, utilizzando una cella chiusa di fluido.
3. Se del caso, regolare la temperatura desiderata sul controller.
4. Lasciate che il sistema di stabilizzare almeno mezz'ora.
5. Registrare uno spettro di rumore termico del cantilever con il cantilever lontano dalla superficie in modo da escludere qualsiasi superficie effetti di smorzamento. Si noti che in genere 10 o più spettri devono essere accumulati per ottenere un sufficiente rapporto segnale-rumore.
6. Avvicinarsi alla superficie. Si noti che al fine di conservare geometria della punta e punta funzionalizzazione processo approccio deve essere effettuata con attenzione. Ciò può essere realizzato, ad esempio, si avvicina in modo contatto intermittente.
7. Determinare la sensibilità inversa ottica leva (InvOLS) misurato in nm / volt. A tale scopo, spingendo la punta cantilever contro una superficie dura.
   1. Determinare i InvOLS misurando la pendenza della distanza da percorrere piezo contro la variazione di tensione fotodiodo. Montare una linea alla parte della curva di forza-distanza in cui la punta cantilever è in contatto con la superficie. In esperimenti su una superficie morbida come doppi strati lipidici, eseguire questo passaggio in aree che non sono coperte da un doppio strato lipidico ("punti di errori").
8. Determinare la costante della molla (pN / nm) montando un oscillatore armonico allo spettro del rumore termico. UsoFunzione software automatico per la primavera costante determinazione; altrimenti consultare la letteratura ^20.
9. Avviare l'esperimento.
   1. Registra curve numerosi forza-distanza per ogni condizione sperimentale. In genere, utilizzare i seguenti valori per i parametri sperimentali: La frequenza di campionamento di 5 kHz, velocità di punta di 1 micron / sec, ritrattare distanza di 1 micron.
      NOTA: A volte, a seconda della dinamica dell'esperimento studiata, potrebbe essere necessario attendere un certo periodo di tempo con la punta in contatto con la superficie ('tempo di sosta').
      NOTA: L'esperimento parametri specifici può discostarsi nettamente dai valori di cui sopra.
   2. Durante le misurazioni a lungo termine, azzerare la posizione laser sul fotodiodo di volta in volta riposizionando il fotodiodo.
   3. Optional: Dopo ogni curva di forza, riposizionare l'AFM-punta in un'altra posizione xy.
   4. Alla fine dell'esperimento, determinare la sensibilità e la molla constant nuovamente per verificare la coerenza e stabilità del sistema.
      NOTA: Confrontando la costante della molla e la sensibilità prima e dopo l'esperimento è anche un mezzo per assicurare che le proprietà del sistema e le proprietà della punta rimaste invariate nel corso dell'esperimento. Se la differenza delle costanti a molla non è troppo grande (<= 15%), possono essere mediati, poiché l'incertezza intrinseca della costante della molla determinazione è anche circa il 15%. Per le differenze più grandi, si consiglia di trovare la prima ed eliminare la causa per il cambiamento costante della molla apparente prima di proseguire con ulteriori esperimenti.

6. Preparazione dati

NOTA: In questa sezione generale fasi di preparazione dei dati che sono tipicamente effettuati indipendentemente dal tipo specifico di esperimento per convertire le unità di Newton e nanometri, nonché di correggere i dati sono descritti. Le analisi di dati specifici esperimento sono briefly descritto più avanti nella rispettiva sezione rappresentante esempio.

1. Tipicamente, effettuare tutti preparazione dei dati e l'analisi passi automaticamente da un algoritmo-home scritta, ad esempio, sulla base del software IGOR Pro 6.
2. Convertire il segnale di deflessione grezzo (DEFL) [V] in vigore moltiplicando con le InvOLS [nm / V] e la costante della molla [nN / nm].
3. Offset la forza in modo tale che la forza sul cantilever sufficiente distanza dalla superficie (cantilever carico) diventa 0 nN.
4. Calcolare la posizione della punta effettiva (chiamato anche separazione, misurata rispetto alla superficie) z *, che prende la flessione del cantilever in considerazione:
   
5. Offset z * in modo tale che z * = 0 corrisponde alla posizione z della superficie.
   NOTA: Qui, F è la forza che agisce sulla punta e quindi piegatos cantilever (determinata nella fase 6.2.), z è la posizione z-sensore misurata (dato direttamente dallo strumento) e k rappresenta la costante della molla (determinato nel passo 5.8).

Figura diagramma di flusso 2. Processo che mostra la preparazione del campione, l'acquisizione dei dati e l'analisi dei dati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Nel seguito, i risultati sopra descritti esempio molecole, cioè la polytyrosine polimeri poli (amminoacido), il polimero graft PI- g -PS e PAPA fosfolipide, sono presentati. Primo per ogni esempio, sperimentare dettagli specifici per l'acquisizione dei dati e la preparazione dei dati sono forniti. Poi, vengono visualizzati i risultati esemplari per esperimenti in cui queste molecole sono state desorbita da superfici diverse (CH ₃ -SAMs, idrogeno terminato diamanti e doppi strati lipidici). Deter...

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Discussione

Nel corso degli ultimi decenni, gli esperimenti di singola molecola hanno fornito intuizioni senza precedenti nei meccanismi molecolari e si è rivelato essere un approccio inestimabile nella vita della scienza e non solo. Per ottenere buone statistiche e significative da esperimenti SMF, idealmente una stessa molecola viene utilizzato su tutto il corso dell'esperimento. In contrasto con esperimenti con insiemi di molecole, esperimenti SMFS sono in grado di rilevare eventi rari e stati molecolari nascosti. Un altro ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)	Hellma
RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))	Sigma
Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane	Vectorlabs
Dry acetone (< 50 ppm H2O)	Sigma
Dry chloroform (> 99.9%)	Sigma
Triethylamine	Sigma
Ultrapure water	Biochrom, Germany
Di-sodium tetraborate (> 99.5%)	Biochrom, Germany
Boric Acid	Biochrom, Germany
Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Probe molecule (polymer, lipid, etc.)
Equipment
Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids	VWR International GmbH, Germany
[header]
Laboratory oven model UF30	Memmert, Germany
Temperature controlled sonicator	VWR International GmbH, Germany
Plasma system "Femto", 100 W	Diener, Germany
One separate glass syringe for each organic solvent	VWR International GmbH, Germany
Vortex mixer	VWR International GmbH, Germany
Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)	Eppendorf
Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl	Eppendorf
AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater)	Asylulm Research, Santa Barbara
Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT)	Bruker AXS, Santa Barbara