Исследуя одну молекулу адгезии методом атомно-силовой микроскопии

Резюме

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Аннотация

Атомно-силовая спектроскопия является идеальным инструментом для изучения молекул на поверхностях и границах. Экспериментальный протокол для соединения большой выбор одиночных молекул ковалентно на иглой АСМ представлена. В то же время наконечник АСМ пассивируются для предотвращения неспецифических взаимодействий между зондом и подложкой, которая является необходимым условием для изучения одиночных молекул, прикрепленного к кончику АФМ. Анализы для определения силу адгезии, длина адгезию, и свободной энергии этих молекул на поверхности твердых тел и био-интерфейсов в ближайшее время представлены и внешние ссылки для дальнейшего чтения предусмотрены. Пример молекулы поли (аминокислоты) polytyrosine, привитой полимер PI-г -PS и фосфолипид POPE (1-пальмитоил-2-oleoyl- SN глицеро-3-фосфоэтаноламин). Эти молекулы десорбируются с различных поверхностей, таких как CH ₃ -SAMs, водорода прекращается алмаза и поддерживается бислоев при различных условиях растворителя. И, наконец,Преимущества силовых спектроскопических отдельных экспериментов молекулы рассматриваются в том числе средства, чтобы решить, если действительно одна молекула была изучена в эксперименте.

Введение

За последние 30 лет, атомно-силовая микроскопия (АСМ) оказалась ценным методом визуализации для изучения биологических ^1,2 и синтетические ³ материалов и поверхностей, так как он обеспечивает молекулярную пространственное разрешение во всех трех измерениях и может эксплуатироваться в различных растворителя окружающая среда. Кроме того, АСМ-сингл сила молекула спектроскопии (ОВС) позволяет измерять силы, начиная от ПШ Мп режим и дал беспрецедентный понимание например в сворачивания белка ^4,5, физике полимеров ^{6 - 8,} и одного взаимодействия молекула-поверхность ^{9 - 12} .The обоснование изучения отдельными молекулами, а не ансамбля молекул, чтобы избежать среднем эффекты, которые часто маскируют редкие события или скрытые молекулярных состояний. Кроме того, множество молекулярных параметров, таких как длина контура, длина Кун, адгезии свободной энергии и т.д., могут бытьполучены. Это подробно описано в приведенных ниже примерах. В типичном эксперименте АСМ-ОВС, молекула зонда соединен с очень острым концом с помощью линкерной молекулы. Сам наконечник расположен в конце гибкой консоли. Если кончик приводится в контакт с поверхностью молекула зонда будут взаимодействовать с этой поверхностью. Наблюдая за отклонение кантилевера от втягивания зонда, силы, и, следовательно, свободной энергии, чтобы отделить молекулы с поверхности может быть определена. Чтобы получить значимые статистические данные, большое количество так называемых силовых кривых должны быть приобретены. Кроме того, чтобы иметь истинные эксперименты одной молекулы (т.е. с использованием одного и того же молекулы-зонда в течение продолжительности всего эксперимента) молекула зонда должна быть ковалентно соединенный с иглой АСМ. Здесь экспериментальный протокол для консольной функционализации с одной молекулой посредством ковалентной связи представлена. Одна молекула может быть либо в сочетании с помощью амино или тиол группы к кончику АФМ. Процесс сопряжения может быть выполнена в широком разнообразии растворителей (органической и водной) для учета сольватации свойств полимеров, используемых.

В первой части, общий протокол для ковалентного присоединения одной молекулы ("молекулы зонда") с помощью линкерной молекулы наконечником АСМ описан. С этой целью, органические NHS- или малеимид-химии используется ^13. Наряду с протоколом в течение трех молекул, например, процессы сбора данных и анализа данных описана и ссылки для дальнейшего чтения предоставляются. Примерные молекулы: (линейный) полимер тирозин, привитой полимер PI-г -PS и липидов Папы Римского. Это включает в себя небольшие изменения протокола, например, ковалентно присоединить цистеина. Кроме того, раздел посвящен подготовке различных поверхностей, таких как поверхности алмаза, СН ₃ -самосопряженных монослоя и липидного бислоя. Эти интерфейсы имеют прован быть хорошие ссылки и примеры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлены для обзора технологического потока, включающего подготовку, шаги сбора данных и анализа данных.

1. Настройка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все химикаты должны быть обработаны с осторожностью, и, таким образом, лабораторный халат, следует использовать перчатки и защитные очки. Все операции должны быть выполнены в лабораторном шкафу. В частности, специальные перчатками в случае использования хлороформа.

1. Используйте химических веществ с низким содержанием воды, такие как сухого хлороформа быстро и магазина сухой, но не дольше, чем на неделю. Хранить как химические вещества, при -20 ° С в атмосфере азота или аргона газа из-за APTES ((3-аминопропил) triethoxysilan) (таблица 1) и ПЭГ (полиэтиленгликоль) гигроскопичны и ПЭГ подлежит окислению на воздухе.
2. Чтобы избежать частого воздействия на складе атмосферного кислорода и влаги, подготовить небольшие аликвоты, в идеале в системе перчаточный ящик с atmosphe азотаповторно.

2. Подготовка оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание возможного перекрестного загрязнения, используйте новые и чистые сосуды для каждого шага.

1. Чистый посуда и пинцет в моющем растворе в течение 30 мин в ультразвуковой ванне при 60 ° С.
2. Промыть и обработать ультразвуком оборудование, начиная с шага 2.1 в два раза тщательно сверхчистой воды.
3. Тепло оборудование с шага 2,1 в растворе RCA (сверхчистой воды, перекиси водорода и аммиака (5: 1: 1)) до 75 ° С в сушильном шкафу в течение 45 мин, а затем промыть их сверхчистой водой.
4. И, наконец, сушат в стеклянную посуду и пинцет в потоке сухого азота или в печи (100 ° C, 3 ч).

3. Совет Функционализация

Примечание: С помощью пинцета, сосуды и т.д., изготовленных из нержавеющей стали, PTFE, стекла или любого другого материала, который химически стабильны в органических растворах, если это применимо. Если не указано иное, выполнять все шаги на RТ. Количество инкубационный раствор необходимо, зависит от количества консольных чипов. Убедитесь, что кронштейны погружаются в соответствующих решений на протяжении всего времени.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте капюшон, чтобы избежать вдыхания органических паров.

1. Формирование ОН-групп на поверхности кантилевера ("активации") (примерно 0,5 ч):
   1. Используйте пинцет, чтобы разместить новые фишки консольные (Материал: грех, пружины: 10-100 PN / нм) на чистую стеклянную пластину и положил их в плазменную камеру (100 Вт).
   2. Эвакуировать камеру (~ 0,1 мбар).
   3. Наводнение камера с газообразным кислородом и эвакуировать снова.
   4. Активировать процесс в плазме (мощности: 20%, продолжительность: 15 мин, давление процесса: 0,25 мбар).
2. Амино-силанизация консолей (приблизительно 1 час):
   1. Подготовьте 2,5 мл раствора APTES (таблица 1) в стеклянной чашке Петри - сделать это в идеале в процессе плазмы.
   2. Immediatelу после плазменной обработки, окуните каждый консоль в течение 1 секунды в ацетоне и разместить их сразу после в решении APTES.
   3. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
   4. Тщательно промойте консольные фишки дважды в 10 мл ацетона и один раз в 10 мл хлороформа.
   5. Дополнительные последний шаг: чипсы Место кантилевера на предыдущем шаге на чистую стеклянную пластину и испечь их в течение 30 мин при 70 ° С. Обратите внимание, что есть и альтернативные стратегии для активации поверхности, например, УФ лечения ^12.
3. ПЭГилирование (примерно 2 ч):
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.3.1-3.3.4 во время амино-силанизации. NHS и малеимидные группы могут быть гидролиза в водной среде и сам ПЭГ подлежит окислению на воздухе. Поэтому ГРМ (особенно в между стадиями) является критическим параметром. Обратитесь к ¹³ для получения дополнительной информации.
   1. Подготовка раствора хлороформа (таблица 1).
   2. Чтобы избежать конденсации, Теплый PEG порошки до комнатной температуры перед открытием аликвоту и весом соответствующую сумму.
   3. Для соединения полимеров или липидов с аминогруппами, отдельно решить NHS-PEG-NHS (6 кДа) и метил-PEG-NHS (5 кДа) в растворе хлороформа при интенсивном перемешивании, пока они не будут полностью решена. В Таблице 1 для концентраций.
      1. Кроме того. для сцепления полимеров с тиоловых групп в отдельности решить MAL-PEG NHS- и метил-PEG-NHS в растворе хлороформа.
   4. Смешайте решения, чтобы отрегулировать определенном соотношении число между NHS- или maleimide- и метильных концевыми молекул ПЭГ (как правило, 1: 500). Следует отметить, что идеальное соотношение должно быть определено итеративно в серии циклов подготовки-эксперимента.
   5. Инкубируйте консольные фишки в растворе ПЭГ в течение 1 часа в смеси хлороформ насыщенной атмосфере, чтобы предотвратить испарение хлороформа.
4. Зонд сопряжение молекулу(> 1 ч):
   ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем 3.4.1-3.4.3, три примера для ковалентного связывания различных молекул зонда для АСМ зондом описаны. Для каждой молекулы протокол должен быть отрегулирован. Кроме того обратите внимание, что в примере 1, и 3-NHS химии используется, тогда как в примере 2 тиол функционализованный полимер PI-г -PS соединен с ПЭГ с помощью малеимид-химии. Более подробную информацию см ^14.
   1. Для поли (аминокислоты) поли-D-тирозина (40-100 кДа)
      1. Растворите polytyrosine конъюгированный молекулы-зонда в 1 М NaOH. Регулировка концентрации 1 мг / мл.
      2. Заменить NaOH для натриевоборатной буфера (рН 8,1) с использованием спин обессоливания колонки (7 кДа MWCO) непосредственно перед функционализации
      3. Промыть консолей сначала 5 мл хлороформа, а затем с 5 мл этанола и, наконец, 5 мл боратного буфера.
      4. Выдержите кантилевера фишки в течение 1 ч в буферном растворе polytyrosine бората и затем промыть боратного буфераи сверхчистой водой. Храните в сверхчистой водой до измерения.
   2. Для полимеров с линейной главной цепи (полиизопрен, 119 кДа), имеющих привитые боковыми цепями (полистирол, 88 кДа) ¹⁴
      1. Растворите Пи г -ps в сухом хлороформе. Регулировка концентрации сопряжения раствора до 4 мг / мл.
      2. Промыть консолей с 5 мл хлороформа и инкубировать в течение по крайней мере 1 часа в растворе сопряжения.
      3. Промыть раз в 5 мл хлороформа и хранить в хлороформе в хлороформе насыщенного среды (чтобы предотвратить испарение хлороформ) до измерения.
   3. Для липидного ПАПЫ РИМСКОГО
      1. Растворите Папа в сухом хлороформе. Регулировка концентрации до 20 мМ.
      2. Промыть консолей с 5 мл этанола и 5 мл сверхчистой воды до инкубации консолей в течение 1 часа в растворе липидной.
      3. После инкубации, промыть консолей с 5 мл хлороформа, 5 мл этанол и 5 мл теплой, сверхчистой воды (в этом порядке) для удаления несвязанных молекул зонда и, чтобы избавиться от хлороформа остатков. Использовать немедленно функциональными советы. Кроме того, хранить их в хлороформе до тех пор, пока это необходимо.

Рисунок 1. (А) Схематическое изображение процесса функционализации наконечника на примере NHS химии. (B) Химическая связь используется для присоединения молекулы-зонда до кончика через аминогруппу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Подготовка 4. Поверхность

1. Самоорганизующихся монослоя (SAM)
   Примечание: В поверхности для первого примера, собранного монослой был выбран. Обратитесь к литературе ¹⁵ для деталей.
   1. Чистые предметные стекла с раствором моющего средства, а затем два раза в особо чистой воды в ультразвуковой ванне в течение 30 минут каждый. Тогда, в качестве дополнительного стадии очистки, поместите их в растворе RCA (см шаг 2,3) при 75 ° С в течение 15 мин.
   2. Пальто слайды с 10 нм никель хрома и 100 нм золота в вакуумного напыления. Затем хранить в холодильнике и чист в растворе RCA непосредственно перед следующей стадии.
   3. Инкубируйте слайды на предыдущем шаге 2 мм 1-додекантиола / раствора этанола в течение 12 часов. В тиольные группы связываться с поверхностью золота и гидрофобный монослой самоассоциируется. Промыть слайды с этанолом и сверхчистой воды и затем сухим потоком газообразного азота. Подтвердите гидрофобность подготовленную поверхность статических измерений краевого угла в гониометре с ПЗС-камеры ^10.
2. Водород прекращается алмазов
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве поверхности для второго примера, водород прекращается алмаз был выбран, Подготовка поверхности проводили, как описано ранее ^16.
3. Поддерживаемые липидный бислой
   Примечание: В последнем примере, поверхность поддерживается липидный бислой (SLB) был использован в качестве поверхности. Чтобы получить такую ​​поверхность, раствор (0,1 мг / мл) большие однослойные везикулы (БУВ), состоящий из фосфолипидов РОРС были сформированы методом экструзии. Тогда 50 мкл LUV решения были поставлены на свежесколотой слюды листа (= 1 см²) и инкубировали в течение 30 мин. Наконец раствор промывали 20 мл ультрачистой воды. См ^17,18 за подробным описанием подготовки SLBS.

5. Сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов используют АСМ, которая обеспечивает возможность измерения в жидкостях. Процедуры сбора данных и анализа данных применяются независимо от модели АСМ используется. Кроме того, в некоторых экспериментах это выгодно иметь возможность контролировать TEMPERATURе в жидкой клетки. Кантилевера была обнаружена с помощью лазерного луча методом отклонения ^19. Жесткости пружины были определены с помощью метода ²⁰ теплового шума.

1. Вставьте функционализированного кантилевера в держатель кантилевера АСМ, который пригоден для измерения в жидкостях.
2. Положите на поверхность (получение см выше), которые будут отбираться в АСМ и покрыть ее жидкостью. И, консольные и поверхность теперь должен быть погружен в жидкость с кончика кантилевера указывая на поверхности. Следует отметить, что во многих случаях капли жидкости достаточно. В любом случае испарения жидкости следует избегать, например, с помощью закрытого жидкости клетки.
3. При необходимости, отрегулируйте желаемую температуру на контроллере.
4. Пусть система уравновешивания, по крайней мере полчаса.
5. Запишите тепловой спектр шума кантилевера с консоли далеко от поверхности, чтобы исключить любую поверхность эффекты затухания. Обратите внимание, что, как правило, 10 или более спектры должны быть накоплены для получения достаточной отношение сигнал-шум.
6. Подойдите к поверхности. Обратите внимание, что в целях сохранения геометрии зонда и иглы функционализацию процессный подход должен осуществляться осторожно. Это может быть достигнуто, например, приближается в прерывистом режиме контактной.
7. Определить обратный оптический чувствительность рычаг (InvOLS), измеренное в нм / вольт. Сделайте это, нажав на кончик кантилевера по твердой поверхности.
   1. Определить InvOLS путем измерения наклона расстояния перемещения пьезоэлектрический против изменения напряжения фотодиода. Установите линию к части форс-расстояние кривой, где острие кантилевера находится в контакте с поверхностью. В экспериментах с участием мягкую поверхность, например липидного бислоя, выполнять этот шаг на областях, которые не покрыты липидной двухслойной («дефектных точек»).
8. Определить жесткость пружины (PN / нм) путем установки гармонического осциллятора спектру теплового шума. Использованиеавтоматизированная программная функция для весеннего постоянной определения; в противном случае обратитесь литературы ^20.
9. Начать эксперимент.
   1. Запись кривые многочисленные форс-расстояние в каждой экспериментальной состоянии. Как правило, используются следующие значения для параметров эксперимента: Частота дискретизации 5 кГц, скорость кончика 1 мкм / сек, отказаться расстояние 1 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, в зависимости от динамики изучаемого эксперимента, это может быть необходимо подождать определенное количество времени с наконечником в контакте с поверхностью («время задержки»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: эксперимент конкретные параметры могут существенно отличаться от значений, приведенных выше.
   2. В длительных измерений, ноль положение лазера на фотодиод, время от времени путем перестановки фотодиод.
   3. Дополнительно: После каждой кривой силы, переместите АСМ-наконечник на другую должность ху.
   4. В конце эксперимента, определяют чувствительность и пружину Constaнт снова, чтобы проверить на последовательность и стабильность системы.
      Примечание: Сравнение жесткости пружины и чувствительность до и после эксперимента также является средством, чтобы гарантировать, что свойства системы и свойства оконечности осталась неизменной в течение всего эксперимента. Если разность жесткости пружины не слишком велико (<= 15%), они могут быть усреднены, так как внутренняя неопределенность пружины определения также около 15%. Для больших различий, желательно сначала найти и устранить причину меняющейся видимой постоянной пружины перед продолжением дальнейших экспериментов.

6. Подготовка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе Общая подготовка данных шагов, которые, как правило, проведенных зависит от конкретного типа эксперимента для перевода единиц Ньютон и нанометровых а также для коррекции описаны данные. Конкретные данные анализов эксперимента шiefly описано ниже в соответствующем разделе типичный пример.

1. Как правило, выполнять все подготовки данных и анализ шаги автоматически домашней написан алгоритм, например, на базе программного обеспечения ИГОРЬ Pro 6.
2. Преобразование исходного сигнала отклонения (Defl) [V] в силу путем умножения его с InvOLS [нм / V] и пружины [NN / нм].
3. Смещение усилие таким образом, что сила, действующая на кантилевера в достаточном удалении от поверхности (без нагрузки консольной) становится 0 NN.
4. Рассчитать действительное положение наконечника (также называемый разделение, когда измеренное по отношению к поверхности) Z *, который принимает изгиб кантилевера с учетом:
   
5. Смещение г * таким образом, что Z * = 0 соответствует положению г поверхности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь F является силой, которая действует на верхушке и, следовательно, изгибаš консольные (определено на этапе 6.2.), г является измеренное положение г-сенсор (непосредственно данное прибором) и к представляет жесткость пружины (определяется на этапе 5.8).

Рисунок 2. Процесс схема, показывающая подготовку образца, сбор данных и анализ данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В дальнейшем, результаты описанных выше примеров молекул, а именно полимеры поли (аминокислоты) polytyrosine, привитой полимер PI-г -PS и фосфолипидов папы, представлены. Во-первых для каждого, например, опыт конкретные детали для сбора данных и подготовки данных предоставляются. Тогда, при...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В течение последних десятилетий, одиночные эксперименты молекулы обеспечили беспрецедентный понимание молекулярных механизмов и оказалось бесценным подход в области наук о жизни и за ее пределами. Для достижения хороших и значимой статистики из ОВС экспериментов, в идеале один и тот...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)	Hellma
RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))	Sigma
Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane	Vectorlabs
Dry acetone (< 50 ppm H2O)	Sigma
Dry chloroform (> 99.9%)	Sigma
Triethylamine	Sigma
Ultrapure water	Biochrom, Germany
Di-sodium tetraborate (> 99.5%)	Biochrom, Germany
Boric Acid	Biochrom, Germany
Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS”	Rapp, Germany
Probe molecule (polymer, lipid, etc.)
Equipment
Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids	VWR International GmbH, Germany
[header]
Laboratory oven model UF30	Memmert, Germany
Temperature controlled sonicator	VWR International GmbH, Germany
Plasma system "Femto", 100 W	Diener, Germany
One separate glass syringe for each organic solvent	VWR International GmbH, Germany
Vortex mixer	VWR International GmbH, Germany
Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)	Eppendorf
Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl	Eppendorf
AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater)	Asylulm Research, Santa Barbara
Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT)	Bruker AXS, Santa Barbara