Une plate-forme microfluidique pour l'isolement à haut débit unique cellule et Culture

Résumé

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Résumé

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Introduction

À l'heure actuelle plaçant des cellules isolées individuellement dans un espace de culture est généralement réalisée en utilisant une dilution limitante ou une cellule activé par fluorescence (FACS). Pour de nombreux laboratoires, ce qui limite la dilution est une méthode commode, car il nécessite seulement une pipette et des plaques de culture de tissus, qui sont facilement disponibles. Dans ce cas, la suspension cellulaire est diluée en série jusqu'à une densité cellulaire appropriée, et ensuite placée dans des puits de culture à l'aide d'une pipette manuelle. Ces cellules isolées compartimentés sont ensuite utilisés pour l' analyse de cellules, telles que l' hétérogénéité génétique de dépistage ¹ et ² , la formation de colonies. Cependant, cette méthode est faible débit et la main-d'œuvre, sans avoir recours à un bras de robot d'assistance, car la nature de la distribution de Poisson de la méthode de dilution limitante limite d' événements monocellulaires à une probabilité maximale de 37% ^3. machines FACS avec un bras robotisé intégré peuvent surmonter la limitation de la distribution de Poisson par précision placment une seule cellule dans une culture bien à un moment ^4. Cependant, la contrainte de cisaillement mécanique élevée (ainsi, réduit la viabilité cellulaire) ⁵ et à l' achat des machines et les coûts opérationnels ont limité son utilisation dans de nombreux laboratoires.

Pour surmonter les limitations ci - dessus, les dispositifs micrométriques ont été développés pour charger très efficacement des cellules individuelles dans des micropuits ^6. Cependant, les micropuits ne fournissent pas suffisamment d'espace pour les cellules chargées de proliférer, en raison de la nécessité de rendre la taille de chaque micro-puits proche de celle d'une cellule unique pour maximiser la probabilité de chargement unicellulaire. Que des analyses de culture sont nécessaires dans de nombreuses applications basées sur des cellules (par exemple, le dosage clonogénique ^7), les grands micropuits (90-650 um de diamètre ou une longueur latérale) ont également été utilisées pour permettre les cultures cellulaires étendus. Cependant, comme la méthode de dilution limite, ils possèdent également de faibles rendements cellule de chargement unique, allant de 10 -. 30% ⁸9

Auparavant, nous avons développé une plate - forme microfluidique à haut débit pour isoler des cellules uniques dans des micropuits individuels et démontrer son application dans le dosage clonogénique des cellules isolées. ¹⁰ Le dispositif a été fait avec poly-diméthylsiloxane (PDMS), et comprend deux ensembles de réseaux de micropuits avec différentes tailles de micropuits, qui peut largement améliorer l'efficacité dans le chargement d'une seule cellule dans un micropuits dont la taille est beaucoup plus importante que la cellule. En particulier, ce concept de «double puits» permet à la taille de la zone de culture pour être ajustée de manière flexible sans affecter l'efficacité de capture de cellule unique, ce qui rend facile d'ajuster la conception du dispositif en fonction de différents types de cellules et d'applications. Cette méthode à haut rendement devrait être utile pour des expériences de culture cellulaire à long terme pour les études d'hétérogénéité cellulaire et monoclonal établissement de la lignée cellulaire.

Protocole

Remarque: Les modèles de photomasques pour notre fabrication de dispositif microfluidique ont été établis à l'aide d'un ordinateur de conception assistée (CAO). Les dessins ont ensuite été utilisés pour fabriquer des photomasques chrome en utilisant un service commercial. Les dispositifs PDMS ont été réalisés en utilisant des techniques de lithographie douce ^11.

1. Fabrication de Maître Moisissures par Lithography

1. Avant le processus de photolithographie ^12, en utilisant les pastilles de silicium de 4 pouces en tant que substrat et déshydrater les pastilles dans un four conventionnel à 120 ° C pendant 10 min.
2. Nettoyer les plaquettes de silicium déshydratées en utilisant un traitement par plasma d'oxygène à 100 watts pendant 30 secondes dans un filtre à plasma.
3. Préchauffer deux plaques de cuisson à 65 ° C et 95 ° C, respectivement, pour le processus de cuisson suivant.
4. Coat 5 g de résine photosensible négative (PR) sur les tranches de silicium nettoyées par une tournette; centrifuger à 1200 tours par minute (SU-8 50) pendant 30 secondes pour produire la couche de microcanaux.
5. Placer le RPplaquette revêtue sur une plaque de cuisson préchauffé à 65 ° C pendant 12 min et le transférer à une autre plaque de cuisson préchauffé à 95 ° C pendant 33 min (pour 100 um d'épaisseur des modèles) pour effectuer un processus de cuisson douce.
6. Après la cuisson, placez le PR enduit plaquette de silicium sur le support d'un masque d'alignement semi-automatique et l'aligner à une transparence photomasque 25400 dpi de résolution.
7. Exposer le PR revêtu de plaquette de silicium à la lumière UV (365 nm) à une dose de 500 mJ / ^cm2 pour créer le motif de la PR sur la plaquette de silicium.
8. Retirer la plaquette de l'alignement et le placer sur une plaque chauffante pour la post-cuisson à 95 ° C pendant 12 min.
9. Faire tremper les tranches de SU-8 développeur (acétate d'éther monométhylique du propylène glycol, PGMEA) solution pour laver PR non réticulés pendant 12 min et doucement à sec avec de l'azote gazeux pour exposer les marques d'alignement.
10. Encore une fois, le manteau 5 g de résine photosensible négative sur les tranches par une tournette; centrifuger à 700 tours par minute (SU-8 100) pendant 30 secondes et 1 200 tours par minute (SU-8 10) pendant 30 s à 300 &# 181; m motif d'épaisseur et 27 um d'épaisseur modèle respectivement pour rendre la couche de micropuits.
11. Placez la tranche revêtue PR sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 4 minutes et à 95 ° C pendant 8 min (pour 27 um couche de capture-puits profond); et à 65 ° C pendant 40 min et à 95 ° C pendant 110 min (pour 300 um couche culture-puits profond).
12. Après refroidissement, placer le PR revêtu plaquette de silicium sur le masque d'alignement équipé d'une lumière UV.
13. Exposer le PR enduit plaquette de silicium à la lumière UV (365 nm) à une dose de 250 mJ / cm ² (27 um d' épaisseur modèle) et 700 mJ / cm ² (pour 300 um d' épaisseur motif).
14. Cuire les tranches à 95 ° C pendant 5 min (27 um de motif d'épaisseur) et 30 min (300 um d'épaisseur motif), respectivement.
15. Laver le PR non réticulé par le PGMEA pendant 6 min (27 um de motif d'épaisseur) et 25 min (300 um d'épaisseur motif), respectivement, puis les sécher avec de l'azote gazeux.
16. Mesurer la hauteur du modèle figure surla tranche avec un profilomètre laser de balayage en plaçant la tranche sur la platine XY d'un profilomètre laser de balayage.
    1. Ajuster le plan focal pour montrer clairement le modèle figure sur la plaquette en utilisant le "vue de la caméra" mode d'observation sous un objectif 20X.
    2. Changez le mode d'observation de la "vue de la caméra" à "vue laser", et définir les positions supérieures et inférieures des caractéristiques.
    3. Réglez le mode de mesure, la zone, la qualité et z-hauteur jusqu'à transparent (en haut), 1 ligne (1,024 x 1), de haute précision et 0,5 um, respectivement, puis appuyez sur le bas de départ pour commencer la mesure.

2. Préparation des dispositifs PDMS pour l'isolement cellulaire unique

1. Avant PDMS coulée, silaniser les moules de maître avec trichlorosilane pour créer une surface hydrophobe, ce qui le rend plus facile à décoller les PDMS répliques des moules maîtres.
   1. Placer les moules de maître et un bateau de pondération contenant200 pi de trichlorosilane dans un dessiccateur, et appliquer le vide (-85 kPa) pendant 15 min.
   2. Arrêtez le vide, puis laisser les moules maîtres dans le dessiccateur à silaniser les moules maîtres à la température ambiante pendant au moins 1 h.
   3. Retirer les moules de maître du dessiccateur et placer chaque moule maître dans un plat de 10 cm de Pétri.
2. Mélanger une quantité totale de kit de polymère PDMS 17,6 g contenant une base et un agent de durcissement à un ratio de 10: 1, puis verser le PDMS sur le moule maître dans la boîte de Pétri.
3. Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur et appliquer le vide (-85 kPa) pendant 1 heure pour éliminer les bulles d'air dans les PDMS.
4. Retirer la boîte de Pétri du dessiccateur et le placer dans un four conventionnel à 65 ° C pendant 3-6 heures pour guérir les PDMS.
5. Retirer les répliques PDMS guéri des moules maîtres et de punch deux trous comme une entrée et une sortie aux deux extrémités du microcanal sur la matrice PDMS réplique de capture-bien par un perforateur avec diamètre intérieur de 0.75 mm pour le canal fluidique (figure 2A).
6. Utilisez du ruban adhésif pour nettoyer la surface des répliques PDMS, puis placer les répliques PDMS dans un nettoyeur à plasma pour un bref traitement par plasma d'oxygène (100 watts pour 14 sec).
7. Retirer les répliques PDMS de la machine à plasma d'oxygène.
8. Alignez un sommet (contenant les micropuits de capture) et un PDMS de fond (contenant les micropuits de culture) réplique à la main sous un stéréomicroscope et les mettre en contact.
9. Placez les PDMS répliques alignés dans un four à 65 ° C pendant 24 heures pour obtenir une liaison permanente entre les PDMS répliques pour former le dispositif final.
10. Faire tremper le dispositif PDMS dans un désionisée (DI) récipient rempli -eau et placez le récipient dans un dessiccateur sous vide (-85 kPa) pendant 15 minutes pour éliminer l'air du microcanaux du dispositif PDMS.
11. Placer le dispositif de PDMS rempli d'eau DI dans une hotte de culture tissulaire et en utilisant une lumière UV (longueur d'onde de la lumière: 254 nm) pour la stérilisation du dispositif de 30 min.
12. Remplacer l'eau DI dans le dispositif de PDMS avec une albumine de sérum bovin à 5% (BSA) dans une solution 1 x PBS et on incube à 37 ° C pendant 30 min pour empêcher les cellules de se coller à la surface du PDMS.
    Remarque: Le revêtement BSA est essentiel pour améliorer l'efficacité du transfert de cellules isolées de la capture-bien à la culture puits.
13. Remplacer la solution de BSA à 5% dans le dispositif PDMS avec stérilisée solution PBS 1x.

3. Préparation de la suspension unicellulaire

1. Culture de souches neurales KT98 des cellules et un carcinome humain cellules A549 et MDA-MB-435 nous en boîte de Petri dans l' incubateur de culture cellulaire classique (37 ° C, 5% CO ₂ et 95% d' humidité) pour préparer des cellules pour l'essai de cellules de dispositif PDMS .
2. Retirer et jeter le milieu de culture usé (milieu de base DMEM fourni avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% des antibiotiques) à partir de la boîte de culture avec des cellules cultivées à 70 - 80% de confluence.
3. Lavez délicatement les cellules avec stérilisées PBS trois fois.
4. Retirer et jeter le PBS, et ajouter 2 ml d'un mélange d'enzyme recombinante avec protéolytiques, et les activités de DNase collagénolytique (s'il vous plaît voir la liste des matériaux pour les informations détaillées).
5. Incuber la boîte de culture à la température ambiante pendant 5 min, puis appuyez sur la boîte de culture pour faciliter le détachement des cellules.
6. Ajouter 4 ml de PBS stérile pour disperser les cellules, puis transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml.
7. Centrifuger le tube à 300 g pendant 3 min et retirer le surnageant.
8. Resuspendre doucement le culot cellulaire dans 1 ml stérilisées PBS et compter le nombre de cellules vivantes en utilisant la méthode d'exclusion au bleu Trypan norme ^13.
   Remarque: Cette étape de remise en suspension est critique pour la préparation bien dissociées suspension à cellule unique pour améliorer l'efficacité de l'isolement de cellules isolées.

4. Isolation simple cellule et Culture clonale

1. Charge 50 pi de suspension cellulaire à une concentration de 2,2 à 2,5 x10 ^{6 cellules / ml dans le micro - canal du dispositif de PDMS par l' intermédiaire du trou de sortie de l'appareil avec une pipette à main.
   Remarque: Le chargement pipette de suspension cellulaire doit être arrêté et maintenu à la première position d'arrêt afin d'éviter l'introduction de bulles d'air dans le microcanal.}
2. Chargez encore 50 pl de suspension cellulaire à travers le trou d'entrée pour remplir uniformément jusqu'à l'ensemble microcanaux avec des cellules.
3. Sceller le trou de sortie d'un bouchon (une ligne de 3 mm de long, 1 mm de diamètre en nylon coupe pêche) afin d'éviter l'écoulement induit par la pression hydrostatique des gouttelettes sur entrée et de sortie des trous.
   Remarque: Les bouchons ont été stérilisée par UV à l'intérieur d'une culture hotte de tissu avant utilisation.
4. Remplir une seringue stérile de 1 ml de milieu de culture, éjecter les bulles d'air, et le mettre en place sur une pompe à seringue.
5. Branchez le moyen chargé seringue à l'orifice d'entrée du dispositif PDMS via une aiguille émoussée G 23 et une poly-tétrafluoroéthène (PTFE) tube.
6. Retirer le bouchon du trou de sortie et toutow un intervalle de temps de 2 minutes pour permettre aux cellules de se déposer dans les unicellulaires capture des puits par la force gravitationnelle.
7. Laver les cellules avec 300 pl non captées de milieu de culture à une vitesse de 600 pi / min entraîné par la pompe de la seringue d'écoulement.
8. Attendre pendant 2 minutes afin de stabiliser l'appareil, et sceller les orifices d'entrée et de sortie avec des bouchons pour former un système de culture fermé.
9. Retournez le périphérique à la main pour transférer les cellules mono-capturées dans les puits de culture.
10. Placez le dispositif PDMS dans une boîte de culture de tissu de 100 mm, et ajouter 10 ml de PBS stérilisé autour du dispositif pour éviter le milieu de culture évaporation de la microcanaux.
11. Déplacer la boîte de culture à un incubateur classique de culture cellulaire (37 ° C, 5% CO ₂ et 95% d' humidité) pour la culture clonale des cellules unique.

5. Culture moyenne reconstitution

1. Après 1 d de la culture, remplacer le milieu de culture dans le dispositif PDMS avec du milieu frais pour améliorer pr cellulaireoliferation.
2. Placer deux gouttes de milieu de culture au-dessus du dispositif PDMS à proximité des zones d'entrée et de sortie des trous pour éviter l'introduction de bulles d'air dans le micro-canal tout en effectuant l'étape suivante.
3. Poinçonner deux trous de la partie supérieure du dispositif PDMS à proximité des deux extrémités du microcanal comme une entrée et une sortie pour le microcanal.
   Note: Ne pas perforer la totalité des deux couches du dispositif de PDMS; à la place, il suffit de percer à travers la couche supérieure du PDMS.
4. Connecter une seringue en plastique de 1 ml contenant du milieu frais à l'entrée par l'intermédiaire d'une aiguille émoussée G 23 et PTFE tube.
5. Débit moyen 120 pi frais dans l'appareil pendant 5 minutes pour remplacer l'ancien milieu.
6. Insérez deux bouchons pour sceller l'entrée et de sortie des trous, et renvoyer l'appareil à l'incubateur de culture cellulaire.
7. Rafraîchir le milieu de culture tous les 2 j au cours de la période de culture en enlevant les bouchons d'étanchéité, puis en répétant les étapes 05/04 à 05/05.

Résultats

La plate - forme microfluidique pour l' isolement et la culture de cellules isolées comprend un micro - canal (200 um de hauteur) avec deux ensembles de matrices de micro - puits (figure 2A). Les deux ensembles de réseaux de micropuits sont appelés comme la capture de puits (25 m de diamètre et 27 um de profondeur) et de la culture puits (285 m de diamètre et de 300 um de profondeur) pour l'isolement de cellules isolées et de la culture, respectivement, et ...

Discussion

Systèmes de dispositifs à base de ^{micropuits-6,14} ont été utilisés pour la manipulation de cellules isolées et de l' analyse, comme à grande échelle cellule unique piégeage ⁶ et souches hématopoïétiques seule la prolifération des cellules ^15. Bien que la taille bien, le nombre et la forme peut être ajustée pour des applications spécifiques, l'efficacité de l' isolement à cellule unique est toujours compromise lorsque la taille du puits est augmentée. ^9...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumin (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basal medium	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Plastic syringe (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge blunt needles	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm