Évaluation de l’Impact de l’agrégation de protéines sur le Stress oxydatif cellulaire chez la levure

Résumé

Agrégation de la protéine provoque un stress oxydatif cellulaire. Ce protocole décrit une méthode pour surveiller les États intracellulaires des protéines amyloïdogène et le stress oxydatif qui leur sont associés, à l’aide de cytométrie en flux. L’approche est utilisée pour étudier le comportement des variantes solubles et sujette à l’agrégation du peptide amyloïde-β.

Résumé

Repliement et agrégation en conformations amyloïdes ont été associés à l’apparition et la progression de maladies neurodégénératives. Cependant, il y a encore peu d’informations sur les protéines insolubles comment agrégats exercent leurs effets toxiques in vivo. Les organismes de modèle simple de procaryotes et eucaryotes, comme les bactéries et les levures, ont largement contribué à notre compréhension actuelle des mécanismes à l’origine de la formation d’amyloïde intracellulaire, propagation des agrégats et la toxicité. Dans ce protocole, l’utilisation de levure est décrit comme un modèle à disséquer la relation entre la formation d’agrégats de protéines et de leur impact sur le stress oxydatif cellulaire. La méthode associe la détection de l’État soluble/agrégés intracellulaire d’une protéine amyloïdogène la quantification du dommage oxydatif cellulaire résultant de son expression à l’aide de cytométrie en flux (FC). Cette approche est simple, rapide et quantitative. L’étude illustre la technique en mettant en corrélation le stress oxydatif cellulaire provoqué par un grand nombre de variantes de peptide amyloïde-β avec leurs propensions agrégation intrinsèque respectifs.

Introduction

Protéostasie est un déterminant fondamental du processus de remise en forme et le vieillissement cellulaire. Dans les cellules, homéostasie des protéines est maintenue par contrôle de la qualité sophistiqué protéine réseaux ayant pour but d’assurer le repliement correct des conformères les protéines mal repliées par chaperons et/ou leur protéolyse ciblée avec des mécanismes bien conservés plusieurs^{1 ,2,3,4,5}. Un grand nombre d’études soutiennent le lien entre le déclenchement et la progression d’un large éventail de maladies humaines et l’échec de protéostasie, conduisant à un mauvais repliement des protéines et de l’agrégation. Par exemple, la présence de dépôts protéiques est considéré comme une caractéristique pathologique des nombreuses maladies neurodégénératives, comme Alzheimer, Parkinson, Huntington maladies^6,7,8, prionogenic maladies et non-dégénératives amyloses⁹. Il a été suggéré que premières assemblées oligomères et protofibrillar dans la réaction d’agrégation sont les éliciteurs principales de cytotoxicité, établissant des interactions avec d’autres protéines aberrantes dans le milieu cellulaire bondé¹⁰. En outre, des inclusions protéiques (PI) peuvent être transmises entre les cellules, se propageant leur effet toxique^11,12. Par conséquent, il est possible que la formation de PI pourrait en effet constituer un mécanisme de détoxification qui limite la présence d’espèces agrégées dangereux vers des emplacements spécifiques dans la cellule, où ils peuvent être transformés ou accumulés sans effets secondaires majeurs ^{13 , 14}.

Norme in vitro des approches biochimiques ont fourni des renseignements importants sur les différentes espèces qui peuplent les réactions de l’agrégation et leurs propriétés^15,16. Toutefois, les conditions utilisées dans ces essais sont clairement différentes de ceux qui se produisent au sein de la cellule et, par conséquent, la question leur pertinence physiologique. En raison de la conservation remarquable des voies cellulaires tels que le contrôle de la qualité protéique, autophagie ou le règlement de l’oxydo-réduction cellulaire état^17,18 chez les eucaryotes^{19,20,21 ,22,23}, la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) s’est imposé comme un modèle cellulaire simple privilégié pour étudier les déterminants moléculaires de l’agrégation des protéines et son impact cytotoxique associé dans des environnements biologiquement pertinente^24,25,26.

Propension de l’agrégation de protéines est une fonctionnalité intrinsèquement encodée dans la séquence primaire. Ainsi, la formation de structures de type amyloïde peut être prédite basée sur l’identification et l’évaluation de l’activité de promotion à l’agrégation de polypeptides²⁷régions. Cependant, malgré le succès des algorithmes bioinformatiques pour prévoir les propriétés de l’agrégation in vitro de séquences protéiques, elles sont loin de prévoir comment ces penchants se traduiront in vivo des effets cytotoxiques. Les études qui portent sur le lien entre l’état agrégé d’une protéine donnée et ses dommages cellulaires associées de manière systématique peuvent aider à contourner cette limitation computationnelle. Ce sujet est abordé dans la présente étude, en profitant d’un grand nombre de variantes du peptide amyloïde-β Aβ42 ne différant que par un seul résidu, mais affichant une gamme continue de propensions de l’agrégation en vivo²⁸. En particulier, une approche axée sur les FC pour déterminer l’espèce conformationnelle représentent les dommages oxydatifs induits par agrégation sujettes aux protéines dans les cellules de levure est décrite. La méthodologie fournit de nombreux avantages comme la simplicité, la capacité de haut débit et une mesure quantitative précise. Cette approche a permis de confirmer que le jeu PI un rôle protecteur contre le stress oxydatif.

Protocole

1. Cultures de S. cerevisiae et Expression de la protéine

Remarque : Les variantes Aβ pièce propensions d’agréger les relative due à une mutation dans un seul résidu à la position 19 (Phe19) du peptide Aβ42 (Figure 1 a). Ces variantes de peptide sont marquées par la protéine fluorescente verte (GFP), constituant ainsi une agrégation journaliste (Figure 1)²⁹.

1. Transformer les plasmides codant pour 20 variantes Aβ42-GFP dans des cellules de levure avec une BY4741 fond parental (MATa sa3Δ1 leu2Δ0 a rencontré15Δ0 ura3Δ0)³⁰. Chaque plasmide codant pour un mutant Aβ42 fusionné à la GFP par un éditeur de liens GSSGSSG. Les plasmides sont pESC(-URA) et incluent le marqueur sélectionnable URA3²⁹.
   1. Préparer le milieu synthétique complet sans uracile (SC-URA) avec les composants suivants : 1,9 g/L azote de levure base sans uracile, sulfate d’ammonium 5 g/L et 900 mL de ddH₂O combiné avec 100 mL de glucose 20 % (p/v).
   2. Mettez une colonie les transformé des cellules de levure dans 20 mL de milieu SC-URA contenant 2 % de glucose et poussent les cultures du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation à 210 t/mn.
2. Le lendemain, poussent les nouvelles cultures de cellules de levure par inoculation 100µl de la culture au jour le jour dans 5 mL de milieu frais de SC-URA.
3. Une OD₅₉₀ de 0,5, centrifuger les cultures à 3 000 x g pendant 4 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le même volume de milieu SC-URA frais contenant 2 % raffinose.
4. Incuber à 30 ° C sous agitation à 210 tr/min pendant 30 min. Puis, centrifuger les cellules à 3 000 x g pendant 4 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un milieu frais SC-URA contenant 2 % de galactose pour induire l’expression de protéine recombinante.
5. Après 16 h d’induire l’expression de la protéine dans un milieu SC-URA contenant 2 % de galactose, récolter 1 mL des cellules induits dans des microtubes stériles à par centrifugation à 3 000 x g pendant 4 min.
   Remarque : Les différences principales se produisent après qu’une période d’induction de 16 h. Induced levures exprimant des variantes Aβ42-GFP peut être visualisée par microscopie à fluorescence pour déterminer la distribution de protéines recombinantes dans les cellules (Figure 2 b).

2. coloration de la cellule

Remarque : Des cellules fraîches non induite sont requis comme témoin négatif de fixer un seuil de fluorescent au cours d’une analyse FC.

1. Prenez les cellules de levure induite par h 16 et de déterminer leur densité optique à 590 nm (OD₅₉₀)_. Diluez-les dans une saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à une OD₅₉₀ de 0,1.
   1. Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate comme suit : ajouter 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄, et de 0,24 g de KH₂PO₄ à 800 mL de ddH₂O. remplir la solution jusqu'à 1 L de ddH₂O après ajustement du pH à 7.4 avec HCl filtrer le tampon à travers un filtre de 0,2 µm.
2. Transférer les suspensions cellulaires exprimant à tubes correctement identifiés (polystyrène de mm fond rond de 12 x 75) et de les protéger de la lumière. Assurez-vous qu’ils sont prêts à être chargés sur le cytomètre en flux pour l’analyse, ainsi que de cellules non induite et non colorés.
3. Ajouter la sonde du stress oxydatif (p. ex., CellROX rouge foncé) pour chaque échantillon à une concentration finale de 5 µM et incuber les cellules à 30 ° C pendant 30 min à l’obscurité.
4. Après incubation, laver les cellules 3 fois avec 1 x PBS et les remettre en suspension dans le même volume de tampon avant leur analyse par le FC.

3. analyse en cytométrie en flux

Remarque : Utilisez une configuration FC avec des lasers appropriés et de filtres pour détecter GFP et le signal de fluorescence de sonde le stress oxydatif. Un cytomètre en flux équipé d’un laser à 488 nm bleu pour la détection des GFP et un laser de 635 nm rouge pour la détection de la fluorescence de sonde de stress oxydatif peut être utilisé. Acquisition de fluorescence d’émission de GFP et sonde le stress oxydatif est exécutée avec un filtre de nm BP 530/30 et un filtre de BP 660/20, respectivement (tableau 1).

1. Cliquez sur le Nouveau panneau de feuille de calcul ouverte et créer les parcelles de dot acquisition suivants.
   1. Sélectionnez Scatter Plot outil dans la barre d’outils et de créer un terrain avec les variables secondaires Scatter-zone (SSC-A) sur l’axe des ordonnées vs Forward Scatter-zone (FSC-A) à une échelle linéaire sur l’axe des abscisses.
   2. Cliquez sur l' Outil de traçage Scatter de la barre d’outils et de créer un terrain avec les variables FL1-zone (FITC) sur l' axe des abscisses vs. LV3-zone (APC) dans une échelle logarithmique sur l’axe y.
2. Cliquez sur l’icône Paramètres Instruments . Cliquez sur l’onglet de Compensation et de définir tous les niveaux de rémunération. Cliquez sur l’onglet Acquisition et sélectionnez un nombre total de 20 000 événements à enregistrer.
3. Cliquez sur l’icône de Débit pour passer le débit d’eau faible.
4. Cliquez sur l’onglet Acquire pour commencer à courir les cellules non induite, colorées ou non et d’ajuster la tension dans les Paramètres de l’Instrument de l’attaquant et la diffusion latérale jusqu'à ce que la population se répartit dans le quadrant de centre-gauche.
   1. Cliquez sur l’icône de polygone pour définir une zone R1 autour de la population de cellules à l’exclusion des débris cellulaires et utilisez cette population fermée P1 = R1 pour toutes les parcelles dot fluorescent et représentations de l’histogramme (Figure 3).
5. Pour ajuster la tension de la PMT du signal de fluorescence, exécuter les cellules non colorés dans la parcelle de dot FL1-LV3, réglage du gain dans l’onglet Configuration de l’Instrument , jusqu'à ce que les cellules sont distribués dans le quadrant inférieur gauche.
6. Remplacez l’exemple les cellules induites pour mesurer la fluorescence GFP. Dans l’onglet Configuration de l’Instrument , réglez le gain à la FSC-A vs FL1 (FITC) lorsque la population est répartie dans le quadrant inférieur droit. Définir la population de cellules positives avec une porte (Gate P2).
7. L’échantillon à la non induite par le changement colorées des cellules pour afficher le stress oxydatif de la fluorescence sur une parcelle de dot FSC-A vs LV3 (APC). Accordez le gain jusqu'à ce que la population cellulaire est distribuée dans le quadrant supérieur gauche. Porte la population de cellules positives en P3.
8. Faire deux parcelles d’histogramme avec l’icône histogramme pour représenter la fluorescence de la cellule. Pour représenter l’intensité de la fluorescence, assurez-vous que FL1 (FITC) représentant la fluorescence GFP est dans l’axe des abscisses, et LV3 (APC) représentant la fluorescence est dans l’axe des ordonnées, appliquant les populations P2 et P3 sur une échelle logarithmique, respectivement.
   NOTE : Superpositions histogramme sont une bonne façon d’illustrer les différences entre les profils de fluorescence des cellules exprimant les différentes variantes de bêta-amyloïdes.

4. recombinant Protein immunodétection

1. Pour déterminer les niveaux d’expression de protéine, récolter les cultures de levures induites pour 16 h par centrifugation à 4 000 x g pendant 6 min et stocker les pellets de cellule à-80 ° C.
   1. Remettre en suspension les cellules recueillies exprimant la protéine recombinante pendant 16 h dans du PBS. Préparer des suspensions de cellules 200 µL de chaque mutant Aβ42-GFP à une OD₅₉₀ de 20.
2. Pour l’analyse de fraction de protéine totale, récolter 100 µL de chaque mutant par centrifugation à 14 000 x g pendant 20 min et remettre en suspension les granules cellulaires dans le même volume de tampon de lyse levure Y-par (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 % DMSO, 200 mM NaCl, EDTA 1 mM contenant 10 mg/mL SB3-14 (myr istyl sulfobétaïne) complétée avec le fluorure phénylméthylsulfonyle (PMSF) de 1 mM).
   1. Incuber les échantillons pendant 20 min à température ambiante sous agitation légère.
3. Déterminer la concentration d’extrait de protéine à l’aide de l’analyse de Bradford. Charger jusqu'à 5 µg d’extrait de protéines de l’échantillon sur un gel de l’électrophorèse SDS-PAGE 15 % d’acrylamide et tache sur une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane à 100 V pour 60 min.
   1. Préparer un Bradford réactif avec 100 mg de bleu de Coomassie brillant bleu G-250 dissoute dans 50 mL d’éthanol à 95 % et ajouter 100 mL d’acide phosphorique à 85 % (p/v). Puis, lorsque la teinture est complètement dissous, diluer le mélange avec les ddH₂O à 1 L et filtrer sur papier filtre cellulose juste avant utilisation.
      Remarque : Le réactif de Bradford devrait être brun clair.
   2. Préparer un étalon d’albumine sérique bovine (BSA) allant de 5 à 100 µg de protéine pour 1 000 µL de réactif de Bradford.
   3. Ajoutez 1-10 µL de protéine extrait à 1 mL de réactif de Bradford et incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
   4. Mesurer l’absorbance des normes et les échantillons d’extrait de protéine à OD₅₉₅.
   5. Pour l’analyse, faire un complot avec les valeurs d’absorbance obtenues pour les normes vs. µg de protéines. D’après la courbe d’étalonnage, déterminer les concentrations des échantillons originaux de la quantité de protéines, compte tenu du volume et la dilution, le cas échéant.
4. Rincer la membrane avec 1 x Tris salin (SCT), 0,1 % Tween 20 (TTBS) et la bloquer à l’aide de 5 % (p/v) de lait sec dans 1 x TTBS.
   1. Pour préparer 1 L de 10 x TBS, dissoudre 24 g de base Tris et 88 g de NaCl dans 900 mL d’H₂O_JJ et ajuster le pH à 7,6. Ajouter ddH₂O pour un volume final de 1 L. Pour une solution de 1 x, mélanger 1 partie de stock de x 10 en 9 parties de ddH₂O.
5. Incuber la membrane pendant 1 h avec un 6E10 dilué 1 : 1 000 anticorps primaire de β-amyloïde et pendant 1 h à température ambiante avec une chèvre de l’anticorps secondaire Conjugué IgG-HRP anti-souris dilué 01:10, 000.
6. Développer des membranes en utilisant 1 mL de réactif fluorescent Luminata et quantifier des bandes par densitométrie, comme indiqué au point 5.2.

5. analyse

1. Pour analyser les données obtenues par FC, créer une table affichant la moyenne intensité de fluorescence (IFM) et la fluorescence médian avec son écart-type correspondant et/ou le coefficient de variation (CV) pour fluorescence GFP et les niveaux de stress oxydatif.
   1. Cliquez sur l’onglet de l’inspecteur et l’icône de statistiques pour personnaliser les données statistiques qui sont requises pour chaque canal.
      Remarque : Lorsque l'on compare les variants protéiques, convertir les données de valeurs de fluorescence un fond pliable ou la résolution métriques (RD) :
      
      Dans cette mesure, l’échantillon moyen est la fluorescence moyenne des échantillons de problème, le contrôle de la moyens est la moyenne fluorescence des cellules utilisé comme témoin et le SD est l’écart type de la fluorescence de moyenne. Facteur de RD est un indice plus précis que le valeur MFI il calcule non seulement la différence entre les échantillons, mais aussi comptes visant la diffusion des données. Ce calcul est particulièrement pertinent lorsqu’en comparant les données provenant des différentes expériences effectuées au fil du temps. Une fois que les RDs ont été calculées, l’utilisation d’un test statistique est conseillée de confirmer l’importance des différences observées entre les variantes de la protéine.
2. Pour les protéines immunodétection, quantifier les niveaux de la protéine recombinante par Western blot à l’aide de logiciels ImageJ.
   1. Avant l’analyse de la densitométrie, convertir les images raw originales de la membrane développée en fichier format et niveaux de gris en mode JPEG.
   2. Ajuster la section Mesures de la valeur du menu Analyze pour Signifier la valeur de gris.
   3. Cliquez sur l’outil Rectangle de ImageJ et définir une région d’intérêt (ROI) avec une taille uniforme pour l’analyse de la densitométrie de bande. Centre de chaque bande sur l’image de la membrane à l’intérieur de l’encadrement rectangulaire créée et enregistrer la mesure un par un en utilisant Ctrl + M (la commande de mesure).
   4. Mesurer le contexte local adjacent à chaque bande, en appliquant la même zone ROI. Après la mesure, soustraire le fond correspondant local de chaque bande.

Résultats

Ce protocole décrit comment employer une collection de 20 variantes du peptide Aβ42 où Phe19 a été muté à tous les protéinogéniques naturels acides aminés²⁸. Les propensions théorique de l’agrégation de ces protéines peuvent être analysées en utilisant deux algorithmes de bioinformatic différentes (AGGRESCAN et TANGO^31,32). Dans les deux cas, cette analyse rend une gradation progressive de...

Discussion

Un large éventail de maladies est lié à l’accumulation de protéines mal repliées en dépôts cellulaire^6,7,8,33. De nombreux efforts ont été faits à élucider les mécanismes moléculaires qui déclenchent l’apparition de ces maladies en utilisant des approches informatiques, qui ne tiennent pas les concentrations de protéine compte, ou in vitro s’approche, où la concen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast cells BY4741	ATCC	201388	Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) plasmid	Agilent Genomics	217454	Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma	Y1501	Powder
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids	Sigma	Y0626	Powder
Raffinose	Sigma	R7630	Powder
Glucose	Sigma	G7021	Powder
Galactose	Sigma	G0750	Powder
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3991	Solution 10X
CellROX Deep Red Reagent	Life Technologies	C10422	Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.
Y-PER protein extraction reagent	Thermo Scientific	78990	Liquid cell lysis buffer
Acrylamide/Bis-acrylamide	Sigma	A6050	Solution
Bradford dye reagent	Bio-Rad	5000205	Dye reagent for one-step determination of protein concentration
β-amyloid antibody 6E10	BioLegend	803001	Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate	Bio-Rad	1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)	Sigma	93482	Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol
FACSCanto flow cytometer	BD Biosciences	657338	Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell	Bio-Rad	1703930	Protein transference system
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems	Bio-Rad	1658000FC	Electrophoresis system