효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가

요약

단백질 집계 세포 산화 스트레스 elicits. 이 프로토콜 amyloidogenic 단백질의 세포내 주와 관련 된, cytometry 사용 하 여 산화 스트레스 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 아 밀 로이드 β 펩 티 드의 가용성과 집계 경향이 이체의 동작을 연구 하는 데 사용 됩니다.

초록

단백질 misfolding 및 녹말 체 conformations로 집계 발병 및 여러 신경 퇴행 성 질환의 진행에 관련 되어있다. 그러나, 여전히 약간의 정보는 어떻게 불용 성 단백질에 대 한 집계는 그들의 독성 효과 비보를 발휘. 단순 간결한 및 진 핵 모형 유기 체, 박테리아와 효 모, 등 세포내 녹말 체 형성, 집계 전파 및 독성 뒤에 있는 메커니즘의 우리의 현재 이해에 크게 기여 했다. 이 프로토콜에서 효를 사용 하 여 단백질의 형성 및 세포질 산화 스트레스에 미치는 영향 관계를 해 부 모델로 설명 합니다. 메서드는 amyloidogenic 단백질의 세포내 수용 성/집계 상태 감지 세포 산화 손상 cytometry (FC)을 사용 하 여 식에서 결과의 정량화 결합 합니다. 이 방법은 간단 하 고 빠르며, 양적입니다. 연구는 그들의 각각 고유한 집계 경향으로 아 밀 로이드 β 펩 티 드 이체의 큰 세트에 기인한 세포질 산화 스트레스를 연관 하 여 기법을 보여 줍니다.

서문

Proteostasis 셀 체력과 노화 프로세스의 근본적인 결정 이다. 셀, 네트워크는 올바른 refolding misfolded 단백질 conformers의 보호자 또는 그들의 타겟된 베이스로 몇 가지 잘 보존 메커니즘^{1 보장 하기 위한 정교한 단백질 품질 관리에 의해 단백질 항상성 유지 ,2,3,,45}. 연구의 많은 발병과 인간의 질병의 광범위 한 범위와 proteostasis, 단백질 misfolding 및 집계의 실패의 진행 사이의 링크에 지원을 제공 합니다. 예를 들어, 단백질 예금의 존재는 많은 신경 퇴행 성 질환, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병, 등, 헌팅턴의 질병^6,7,8의 병 적인 특징을 간주 됩니다. prionogenic 질병, 고 퇴행 성 비 amyloidoses⁹. 그것은 집계 반응에서 초기 oligomeric 및 protofibrillar 어셈블리 붐비는 셀룰러 환경¹⁰다른 단백질 들과 탈 선 상호 작용을 설정 하는 세포 독성의 주요 elicitors는 건의 되었다. 또한, 전파 하는 그들의 독성 효과^11,12셀 사이의 단백질 포함 (PI)를 전송할 수 있습니다. 따라서, PI의 대형 셀, 어디 처리 될 수 있다 또는 주요 부작용 없이 축적에서 특정 위치에 위험한 집계 된 종의 존재를 제한 하는 해독 메커니즘 구성 실제로 수 있습니다. 수 있습니다. ^{13 , 14}.

표준 체 외에서 생 화 확 적인 접근 집계 반응와 그들의 속성^15,16종에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 했다. 그러나, 이러한 분석 실험에서 사용 하는 조건 셀 내에 발생 하는 명확 하 게 다른 있으며, 따라서 그들의 생리 적인 관련성 질문. 세포질 통로 단백질 품질 관리, autophagy, 진핵생물^{19,20,21 중 세포질 산화 환 원 상태17,18 의 규제 등의 주목할 만한 절약 때문에 ,,2223}, 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 단백질 집단의 분자 결정 요인 연구 특권 간단한 세포 모델 나왔다 그리고 생물학으로 관련 환경^24,,2526에 관련 된 세포 독성 영향.

단백질 집계 성향 본질적으로 기본 순서로 인코딩 기능입니다. 따라서, 아 밀 로이드 같은 구조의 형성 예측할 수 있습니다 식별 및 집계 추진의 힘의 평가에 따라 지역 polypeptides²⁷에. 그러나, 예측 단백질 시퀀스의 생체 외에서 집계 속성 bioinformatic 알고리즘의 성공에도 불구 하 고 그들은 여전히 이러한 경향 vivo에서 세포 독성 영향으로 번역 하는 어떻게 예측까지 있습니다. 체계적인 방식으로 주어진된 단백질의 집계 상태 및 그것의 관련 된 세포 손상을 사이 연결 하는 연구는 전산이 한계를 우회 하는 데 도움이 있습니다. 이 연결은 현재 연구, 아 밀 로이드 β 펩 티 드 Aβ42 단일 잔류물에만 서로 다른 하지만 집계 경향 vivo에서²⁸의 연속 범위 표시의 이체의 큰 세트의 활용에서 해결 됩니다. 특히, 구조적 종 효 모 세포에서 집계 하기 쉬운 단백질에 의해 elicited 산화 손상에 대 한 회계를 식별 하는 FC 기반 접근 방식을 설명 합니다. 방법론에는 단순, 높은 처리 능력, 그리고 정확한 양적 측정 등 많은 이점을 제공합니다. 이 방법은 PI 놀이 산화 스트레스에 대 한 보호 역할을 확인 가능 합니다.

프로토콜

1. S. cerevisiae 문화와 단백질 표정

참고: Aβ 변종 전시 Aβ42 펩 티 드 (그림 1A)의 위치 19 (Phe19)에서 단일 잔류물에 돌연변이 인해 다른 상대 집계 경향. 이 펩 티 드 이체는 녹색 형광 단백질 (GFP), 집계 기자 (그림 1)²⁹역할으로 태그 됩니다.

1. 플라스 미드 BY4741 부모의 배경 (타 그의3Δ1 레이2Δ0 만난15Δ0 ura3Δ0)³⁰효 모 세포로 20 Aβ42-GFP 변종에 대 한 인코딩 변환. 각 플라스 미드 GSSGSSG 링커에 의해 GFP를 융합 하는 Aβ42 돌연변이 인코딩합니다. 플라스 미드는 pESC(-URA) 이며 선택 가능한 마커 URA3²⁹를 포함.
   1. 다음 구성 요소와 uracil (사우스 캐롤라이나-우 라) 없이 합성 완전 한 매체 준비: 1.9 g/L 효 질소 uracil, 5 g/L 황산 암모늄과 900 mL ddH₂O의 기본 20% (w/v) 포도 당 100ml와 결합.
   2. 2% 포도 당을 포함 하는 SC-우 라 중간의 20 mL로 변형 된 효 모 세포에의 한 식민지를 넣고 하룻밤 동요 210 rpm에서 30 ° C에서 문화를 성장.
2. 다음 날, 신선한 SC-우 라 중간의 5 mL에 접종 100 µ L의 숙박 문화에 의해 새로운 효 모 세포 배양 성장.
3. 에는 OD₅₉₀ 0.5, 원심 4 분 3000 x g에서 문화, 상쾌한, 삭제 고 resuspend 동일한 양의 신선한 SC-우 라 중 2% 유를 포함 하는 셀.
4. 30 분 동안 210 rpm 동요에서 30 ° C에서 품 어. 그리고 4 분 3000 x g에서 세포를 원심는 상쾌한을 삭제 합니다. 재조합 형 단백질 표정 유도 2% 갈 락 토스를 포함 하는 신선한 SC-우 라 매체에 셀 resuspend
5. 단백질 표정 2% 갈 락 토스를 포함 하는 사우스 캐롤라이나-우 라 중간에 유도의 16 h 후 4 분 3000 x g에서 원심 분리 하 여 살 균 microcentrifuge 관에 유도 세포의 1 mL를 수확.
   참고: 가장 관련성이 높은 차이 발생 후 Aβ42 GFP 변종 표현 16 h. 유도 효 모 세포의 유도 기간 형광 현미경 검사 법 (그림 2B) 셀 안에 재조합 단백질 분포를 결정 하 여 구상 될 수 있다.

2. 세포 얼룩

참고: 신선한 비 유발 세포는 FC 분석 동안 형광 임계값을 설정 하는 부정적인 컨트롤으로 구성 해야 합니다.

1. 16 h 유발 효 모 세포를가지고 고 590에서 그들의 광학 밀도 결정 nm (OD₅₉₀)_. 0.1의 OD₅₉₀ 를 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 분 (PBS)에 그들을 희석.
   1. 버퍼링 인산 염 분 x 1을 다음과 같이 준비: NaCl, KCl, 나₂HPO₄, 1.44 g의 0.2 g의 8 g을 추가 하 고 KH₂포₄ ddH₂오의 800 mL의 0.24 g pH 7.4에 조정 후 1 L ddH₂O의 솔루션 작성 HCl. 버퍼 0.2 µ m 필터를 통해 필터링.
2. 레이블이 표시 된 튜브 (12 × 75 m m 라운드 하단 폴리스 티 렌)을 표현 하는 세포 정지를 전송 하 고 빛에서 그들을 보호. 그들은 비 유도 및 비-얼룩진 셀 함께 분석에 대 한 교류 cytometer에 로드할 준비가 다는 것을 확인 하십시오.
3. 5 µ M의 최종 농도에 각 샘플을 (예를 들어, CellROX 딥 레드) 산화 스트레스 프로브를 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 30 ° C에 세포를 품 어.
4. 부 화, 후 셀 1 x PBS로 3 회 세척 하 고 FC 그들의 분석 전에 버퍼의 동일한 볼륨에 그들을 resuspend.

3. 교류 Cytometry 분석

참고: 적절 한 레이저와 필터는 FC 설치를 사용 하 여 GFP와 산화 스트레스 프로브 형광 신호를 감지. 교류 cytometer GFP의 발견을 위한 488 nm 청색 레이저와 산화 스트레스 프로브 형광의 탐지를 위한 635 nm 빨간 레이저를 사용할 수 있습니다. GFP와 산화 스트레스 프로브 방출 형광의 인수는 각각 530/30 nm BP 필터와 660/20 BP 필터 수행 (표 1).

1. 새 워크시트 패널 열기 에 클릭 하 고 다음 인수 점 플롯을 만들.
   1. 도구 모음에서 분산형 플롯 도구 를 선택 하 고 A를 만들기 음모 쪽 분산형-지역 변수 (SSC-)는 y 축 대 앞으로 피해 지역에 (FSC-A)는 x 축에 선형 눈금에.
   2. 도구 모음에서 분산형 플롯 도구 를 클릭 하 고 x 축 대에 변수 FL1 지역 (FITC)와 음모를 만들. FL3 지역 (APC)는 y 축에 로그 눈금.
2. 악기 설정 아이콘을 클릭 합니다. 보상 탭을 클릭 하 고 모든 보상 수준을 설정 합니다. 인수 탭에서 클릭 하 고 기록 20000 이벤트의 총 수를 선택 합니다.
3. 유량 아이콘 낮은흐름 속도 전환 하려면 클릭 합니다.
4. 취득 탭 비 유도, 흠 없는 세포 실행 시작을 클릭 하 고 인구 중간 왼쪽 사분면에 배포 될 때까지 측면 분산형 및 앞으로의 악기 설정 에서 전압을 조정 합니다.
   1. 다각형 아이콘 세포 인구 세포 파편을 제외 하 고 주변 지역 R1 설정을 클릭 하 고이 문이 인구 p 1을 사용 하 여 모든 형광 점 플롯과 히스토그램 표시 (그림 3)에 대 한 R1 =.
5. 형광 신호의 PMT 전압을 조정 하려면 셀 낮은 왼쪽된 사분면에 배포 될 때까지 튜닝 악기 설정 탭에서 이득 FL1 FL3 점 플롯에 흠 없는 셀을 실행 합니다.
6. GFP 형광을 측정 하는 유도 셀에 샘플을 변경 합니다. 악기 설정 탭에서 인구 오른쪽 아래 사분면에 배포 될 때에는 FSC-A 대 FL1 (FITC) 이득을 설정 합니다. 게이트 (게이트 P2) 긍정적인 세포 인구를 정의 합니다.
7. 변경 샘플 비 유발 산화 스트레스는 FSC-A 대 FL3 (APC) 도트 음모에 형광으로 표시 하려면 셀 스테인드. 튜닝 이득 셀 인구는 왼쪽 위 사분면에서 배 부 될 때까지. P3에 긍정적인 세포 인구 게이트입니다.
8. 확인을 셀 형광을 나타내는 히스토그램 아이콘 두 히스토그램 플롯 합니다. 형광 강도 나타내는 FL1 (FITC) GFP 형광을 나타내는 x 축, 이며 FL3 (APC) 형광을 나타내는 y에 로그 눈금에 P2 및 P3 인구를 각각 적용 있는지 확인 합니다.
   참고: 막대 그래프 오버레이 다른 Aβ 이체를 표현 하는 셀의 형광 프로필 간의 차이 설명 하기 위해 좋은 방법입니다.

4. 재조합 단백질 Immunodetection

1. 단백질 표정 수준 결정, 16 h에 대 일 분, 4000 x g에서 원심 분리에 의해 유도 된 효 모 배양 수확을-80 ° c.에 셀 펠 릿 저장
   1. PBS에 16 h에 대 한 재조합 단백질을 표현 하는 수집 된 셀 resuspend 20의 OD₅₉₀ 를 각 Aβ42 GFP 돌연변이의 200 µ L 셀 정지를 준비 합니다.
2. 총 단백질 분수 분석에 대 일 분 14000 x g에서 원심 분리 하 여 각 돌연변이의 100 µ L를 수확 하 고 효 모 세포의 용 해 버퍼 Y의 동일한 볼륨에 셀 펠 릿 resuspend-(50 mM Tris HCl pH 8.0, 1 %DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA 10 mg/mL SB3-14 (myr 포함 된 당 istyl sulfobetaine) 보충 1 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF)).
   1. 온화한 동요에서 실 온에서 20 분에 대 한 샘플을 품 어.
3. Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 추출 농도 결정 합니다. 15% 아크릴 SDS 페이지 젤 전기 이동 법에 60 분 100 V에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 오 각 샘플의 단백질 추출의 최대 5 µ g를 로드 합니다.
   1. 브래드 퍼 드 Coomassie 화려한 블루 G-250의 100 밀리 그램으로 시 약 50ml 95% 에탄올에에서 용 해 하 고 85% (w/v) 인산의 100ml를 추가 준비. 다음, 염료 해산 완전히 ddH₂O 1 l 혼합물을 희석 하 고 그냥 사용 하기 전에 셀 루 로스 필터 종이 통해 필터링.
      참고: 브래드 퍼 드 시 해야 될 빛 갈색.
   2. 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 브래드포드 시 약 1000 µ L에서 단백질의 5-100 µ g에서 배열의 표준 준비.
   3. 1-10 µ L 단백질의 브래드포드 시의 1 mL에 추출 하 고 품 어 5 분 동안 실내 온도에 혼합물을 추가 합니다.
   4. 표준과 마약₅₉₅에서 단백질 추출 물 샘플의 흡 광도 측정 한다.
   5. 분석을 위해 표준 대에 대 한 얻은 흡 광도 값으로 음모를 확인 합니다. 단백질의 µ g입니다. 표준 곡선에 따라 달라 집니다, 있는 경우 볼륨 및 희석, 고려는 양의 단백질에서 원래 샘플의 농도 결정 합니다.
4. 린스 Tris 버퍼 염 분 (TBS), x 1 막 0.1% Tween 20 (TTBS), 1 x TTBS의 5% (w/v) 무 지방 건조 우유를 사용 하 여 차단 하 고.
   1. 10 x TBS의 1 리터를 준비 하려면 기본 트리 스의 24 g와 H₂O_dd 900 mL에 NaCl의 88 g을 녹이 고 pH 7.6 조정. DdH₂O l. 1의 최종 볼륨을 추가 10 x 재고 1 일부 ddH₂o.의 9 부분 혼합 1 x 솔루션에 대 한
5. 기본 β 아 밀 로이드 항 체 희석 6E10 1:1,000와 함께 1 시간에 대 한 막 품 어 그리고 이차 항 체 염소와 실 온에서 1 h에 대 한 반대로 마우스 IgG HRP 공액 희석 1:10, 000.
6. 막 Luminata 형광 시 약의 1 mL를 사용 하 여 개발 및 단계 5.2에서에서 설명한 densitometric 분석 하 여 밴드를 계량 합니다.

5. 데이터 분석

1. FC에서 얻은 데이터를 분석 하려면 표시 의미 형광 강도 (MFI) 테이블을 만듭니다와 그 해당 표준 오류 또는 GFP 형광 및 산화 스트레스 수준에 대 한 차이 (CV)의 계수 중간 형광.
   1. 관리자 탭 및 통계 아이콘 각 채널에 필요한 통계 데이터를 사용자 지정을 클릭 합니다.
      참고: 비교할 때 단백질 이체, 접이식 배경 또는 해상도 통계 (RD)에 형광 값 데이터 변환:
      
      이 통계에서 평균 샘플 문제 샘플의 평균 형광, 평균 컨트롤은 컨트롤을 사용 하는 셀의 평균 형광 이며 SD는 평균 형광의 표준 편차. RD 요소 MFI 값 보다 더 정확한 인덱스는 그것 뿐만 아니라 샘플 뿐만 아니라 데이터의 확산을 위한 계정 사이의 차이 계산 합니다. 이 계산은 시간이 지남에 수행 다른 실험 데이터를 비교 하는 때 특히 적합 합니다. 일단는 RDs를 계산 통계 시험의 사용은 단백질 이체의 관찰 된 차이점의 중요성을 확인 하는 것이 좋습니다.
2. 단백질 immunodetection에 대 한 재조합 단백질 수준 서쪽 오 점 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 계량.
   1. Densitometry 분석 하기 전에 개발 된 막의 원래 raw 이미지를 JPEG 파일 형식와 회색조 모드 변환.
   2. 회색값 의미 분석 메뉴의 설정 측정 섹션을 조정 합니다.
   3. ImageJ에서 사각형 도구를 클릭 하 고 밴드 densitometry 분석에 대 한 일관 된 크기와 관심 (ROI)의 영역을 정의. 만든된 사각형 프레임 안에 막 이미지에 각 밴드 센터 고 측정 Ctrl + M (측정 명령)를 사용 하 여 하나 하나를 기록 합니다.
   4. 동일한 투자 수익 영역을 적용 하는 각 밴드에 인접 한 로컬 백그라운드를 측정 합니다. 측정 후 각각의 개별 밴드에서 해당 로컬 백그라운드를 뺍니다.

결과

이 프로토콜 어디 Phe19은 모든 자연 proteinogenic 아미노산²⁸변경 되었습니다 Aβ42 펩 티 드의 20 이체의 컬렉션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 단백질의 이론적인 집계 경향 두 다른 bioinformatic 알고리즘 (AGGRESCAN와 탱고^31,32)를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 두 경우 모두에서이 분석 집계 추세, ascribing, 일반?...

토론

다양 한 질병 세포 예금^6,,78,33으로 misfolded 단백질의 축적에 연결 된다. 많은 노력 계정 단백질 농도를 고려 하지 않습니다, 계산 방법을 사용 하 여 이러한 질병의 발병을 트리거하는 분자 메커니즘을 해명 되었습니다 또는 생체 외에서 접근, 어떤 단백질 농도 반응 동안 상수 남아 있습니다. 그...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast cells BY4741	ATCC	201388	Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) plasmid	Agilent Genomics	217454	Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma	Y1501	Powder
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids	Sigma	Y0626	Powder
Raffinose	Sigma	R7630	Powder
Glucose	Sigma	G7021	Powder
Galactose	Sigma	G0750	Powder
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3991	Solution 10X
CellROX Deep Red Reagent	Life Technologies	C10422	Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.
Y-PER protein extraction reagent	Thermo Scientific	78990	Liquid cell lysis buffer
Acrylamide/Bis-acrylamide	Sigma	A6050	Solution
Bradford dye reagent	Bio-Rad	5000205	Dye reagent for one-step determination of protein concentration
β-amyloid antibody 6E10	BioLegend	803001	Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate	Bio-Rad	1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)	Sigma	93482	Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol
FACSCanto flow cytometer	BD Biosciences	657338	Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell	Bio-Rad	1703930	Protein transference system
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems	Bio-Rad	1658000FC	Electrophoresis system