Оценка влияния агрегации белков на сотовой окислительный стресс в дрожжи

Резюме

Агрегации белков вызывает сотовой оксидативного стресса. Этот протокол описывает метод для контроля внутриклеточных государства amyloidogenic белков и окислительного стресса, связанного с ними, используя проточной цитометрии. Этот подход используется для изучения поведения растворимых и подверженных агрегации вариантов пептида амилоид β.

Аннотация

Сворачиванию белков и агрегация в амилоида конформации связаны с появления и прогрессирования ряд нейродегенеративных заболеваний. Однако, есть еще немного информации о как нерастворимых белков агрегатов приложить их токсические эффекты в естественных условиях. Простая модель прокариот и эукариот организмов, таких как бактерии и дрожжи, значительно способствовали нашего нынешнего понимания механизмов за внутриклеточные амилоида формирования, распространения агрегатов и токсичности. В этом протоколе использование дрожжей описан как модель анализировать взаимосвязь между формирования белков агрегатов и их влияние на сотовой оксидативного стресса. Метод объединяет обнаружения внутриклеточных растворимый/агрегированы состояния amyloidogenic белка с количественная оценка сотовой оксидативного повреждения, вызванные его выражения, с помощью проточной цитометрии (FC). Этот подход является простым, быстрым и количественные. Исследование демонстрирует технику, корреляция сотовой окислительный стресс, вызванный большой набор вариантов амилоид β пептид с их соответствующих внутренних агрегации наклонности.

Введение

Proteostasis является основополагающим фактором, определяющим процессы фитнес и старение клеток. В клетках белок гомеостаз поддерживается контроль качества сложных белков, которые сетей, направленных на обеспечение правильного складывая смятых протеинов конформеров сопровождающих и/или их целенаправленных протеолиза с несколько хорошо сохранившихся механизмов^{1 ,}-^2,-^3,-^4,-⁵. Большое количество исследований поддерживать связь между наступлением и прогрессирование широкий спектр заболеваний человека и неудачи proteostasis, приводит к сворачиванию белков и агрегации. К примеру наличие белка месторождений считается патологическим отличительной чертой многих нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона заболеваний^6,7,8, prionogenic заболевания и не дегенеративные amyloidoses⁹. Было высказано предположение о том, что раннего олигомерных и protofibrillar сборки в агрегации реакции являются основными elicitors цитотоксичность, установление аберрантных взаимодействиями с другими белками в переполненном клеточного окружения¹⁰. Кроме того белковых включений (PI) может передаваться между ячейками, пропагандирующих их токсический эффект^11,12. Таким образом может быть, что формирование PI может действительно представляют собой механизм детоксикации, который ограничивает наличие опасных видов агрегированные в определенных местах в камере, где они могут быть обработаны или накопленные без серьезных побочных эффектов ^{13 , 14}.

Стандарт в vitro биохимических подходов оказали важное понимание различных видов, которые заполняют агрегации реакций и их свойства^,1516. Однако условия, используемые в этих анализов явно отличаются от тех, которые происходят в пределах ячейки и, таким образом, вопрос их физиологической значимости. Из-за заметным сохранение клеточных пути контроля качества белка, autophagy или регулирование сотовой окислительно-восстановительного состояния^17,18 среди эукариот^{19,20,21 ,22,23}, многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) стала привилегированных простой сотовая модель для изучения молекулярных детерминант агрегации белков и его связанные цитотоксическое влияние в биологически соответствующих средах^24,25,26.

Склонность агрегации белков — это функция, по своей сути закодированы в первичной последовательности. Таким образом, формирование амилоид подобных структур можно предсказать на основе идентификации и оценки потенции агрегации содействия регионам в полипептиды²⁷. Однако несмотря на успех bioinformatic алгоритмов предсказать свойства агрегации в vitro последовательностей белков, они все еще далеки от прогнозирования, как эти склонности перевести в vivo цитотоксическое влияние. Чтобы обойти это ограничение вычислительной может помочь исследования, которые касаются связи между агрегированных состояние данного белка и его связанные клеточных повреждений на систематической основе. Эта связь рассматривается в настоящем исследовании, воспользовавшись большой набор вариантов амилоид β пептида Aβ42 отличаются только в одном остатки, но отображение непрерывный спектр агрегации склонности в vivo²⁸. В частности описывается FC-основанный подход к идентификации конформационные видов учета оксидативное повреждение, вызвал, подверженных агрегации белков в клетках дрожжей. Методология дает множество преимуществ, таких, как простота, высокой пропускная способность и точное количественное измерение. Этот подход позволил подтвердить, что PI играют защитную роль против окислительного стресса.

протокол

1. S. cerevisiae культур и выражения протеина

Примечание: Значения вариантов демонстрируют разные относительные агрегации наклонности из-за мутации в один остаток в позиции 19 (Phe19) Aβ42 пептид (рис. 1A). Эти пептиды варианты помечены Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), который действует как агрегирование репортер (рис. 1)²⁹.

1. Трансформировать плазмид кодирования для 20 вариантов Aβ42-ГФП в дрожжевых клеток с BY4741 родительский фон (Мата его3Δ1 леи2Δ0 встретился с15Δ0 ura3Δ0)³⁰. Каждый плазмида кодирует Aβ42 мутант, сливается с GFP компоновщиком GSSGSSG. Плазмиды pESC(-URA) и включают в себя маркер выбора URA3²⁹.
   1. Подготовить синтетических полного среднего без урацилом (SC-Ура) со следующими компонентами: 1,9 г/Л дрожжи азота базы без урацил, 5 г/Л сульфата аммония и 900 мл ddH₂O в сочетании с 100 мл 20% (w/v) глюкозы.
   2. Положите один колонии преобразованные дрожжевых клеток в 20 мл среды SC-Ура, содержащий 2% глюкозы и расти культур на ночь на 30 ° C при агитации на 210 об/мин.
2. Следующий день, растут новые культуры клеток дрожжей пересевать 100 мкл ночь культуры в 5 мл свежего SC-Ура среды.
3. В ОД₅₉₀ 0.5 центрифуга культур на 3000 x g 4 мин, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в том же объеме свежих средних SC-Ура, содержащий 2% Рафиноза.
4. Инкубируйте на 30 ° C при агитации на 210 об/мин за 30 мин. Центрифуга клетки на 3000 x g 4 мин затем удалить супернатант. Ресуспензируйте клетки в свежих SC-Ура носитель, содержащий 2% галактозы побудить рекомбинантных белков.
5. После 16 h побуждать выражение протеина в среде SC-Ура, содержащий 2% галактозы урожай 1 мл индуцированных клеток в стерильных microcentrifuge трубы центрифугированием в 3000 x g на 4 мин.
   Примечание: Наиболее важные различия возникают после индукции период 16 h. индуцированные дрожжевых клеток выразить Aβ42-GFP варианты могут быть визуализированы путем микроскопии флуоресцирования для определения распределения рекомбинантных белков внутри клетки (рис. 2B).

2. ячейки пятнать

Примечание: Свежие-индуцированной клетки необходимы как отрицательный контроль учредить флуоресцентные порог во время анализа ФК.

1. Возьмите 16 h индуцированной дрожжевых клеток и определить их оптической плотности на 590 Нм (₅₉₀OD)_. Развести их в стерильных фосфатный буфер (PBS) OD₅₉₀ 0.1.
   1. Приготовляют следующим образом 1 x фосфатный буфер: добавить 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, и 0,24 г х₂PO₄ до 800 мл ddH₂O. заполнить решение до 1 Л ddH₂O после корректировки рН 7,4 с HCl. фильтр буфер через фильтр 0.2 мкм.
2. Передать соответствующим образом помечены трубы (12 × 75 мм раунд дно полистирол) выражая клеточных суспензий и защищать их от света. Убедитесь, что они готовы быть загружены на проточный цитометр для анализа, вместе с-индуцированной и -окрашенных клеток.
3. Добавьте зонд окислительного стресса (например, CellROX глубокий красный цвет) для каждого образца в конечной концентрации 5 мкм и инкубировать клетки на 30 ° C в течение 30 мин в темноте.
4. После инкубации вымыть клетки 3 раза с ПБС и Ресуспензируйте их в такой же объем буфера перед их анализ по ФК.

3. поток Cytometry анализ

Примечание: Используйте ФК установки с соответствующим лазеры и фильтры для обнаружения GFP и сигнал флуоресценции зонда оксидативного стресса. Проточный цитометр оснащены 488 нм синий лазер для обнаружения GFP и 635 нм красный лазер для обнаружения флуоресценции зонда Оксидативный стресс может быть использован. Приобретение выбросов флуоресценции GFP и окислительного стресса зонд выполняется с 530/30 Нм ВР фильтр и фильтр 660/20 BP, соответственно (Таблица 1).

1. Нажмите на Открыть новый лист панель и создать следующие участки точка приобретение.
   1. Выберите Точечная участок инструмент из панели инструментов и создать участок с переменными Scatter-Сиде (SSC-A) на оси y против вперед Scatter-области (FSC-A) в линейной шкалы на оси x.
   2. Нажмите кнопку Точечная участок инструмент из панели инструментов и создать участок с переменными значения параметров FL1-области (FITC) на оси против. FL3-области (APC) в логарифмическом масштабе шкалы по оси y.
2. Щелкните значок Параметры инструментов . Перейдите на вкладку компенсации и задать все уровни компенсации. Нажмите на вкладку приобретения и выберите общее количество 20000 событий для записи.
3. Щелкните значок Скорость потока , чтобы переключить скорость потока до минимума.
4. Щелкните вкладку приобретать для запуска-индуцированной, безупречная клетки и отрегулировать напряжение в Инструмент настройки вперед и разброс стороне до тех пор, пока население распределяется в середине левый квадрант.
   1. Нажмите на значок многоугольник установить регион R1 вокруг популяции клеток, исключая ячейки мусор и использовать этот закрытый населения P1 = R1 для всех участков флуоресцентные точка и гистограмма представления (рис. 3).
5. Чтобы настроить ПЛТ напряжение сигнала флуоресценции, запустите неокрашенных клетки в значения параметров FL1-FL3 точка сюжет, тюнинг выигрыш в вкладке Параметры инструмента до тех пор, пока клетки распространяются в нижнем левом квадранте.
6. Измените образец индуцированных клетки для измерения флуоресценции GFP. На вкладке Настройка инструмента установите выигрыш в FSC-A против значения параметров FL1 (FITC) когда населения распространяется в правом нижнем квадранте. Определите положительный клеточный населения с ворот (ворота P2).
7. Изменение образца для не индуцированной витражи ячейки для отображения оксидативного стресса, флуоресценции на участке FSC-A против FL3 (APC) точка. Настройка усиления до тех пор, пока популяции клеток распространяется в левом верхнем квадранте. Ворота положительный клеточный населения в P3.
8. Сделайте две гистограммы участки с значок гистограммы представляют флуоресценции клеток. Представлять интенсивности флуоресценции, убедитесь, что значения параметров FL1 (FITC) представляющие GFP флуоресценции находится в оси x, и FL3 (APC) представляющие флюоресценция по оси y, применяя P2 и P3 населения в логарифмическом масштабе, соответственно.
   Примечание: Гистограмма накладки являются хорошим способом для иллюстрации различий между профилями флуоресценции клеток, выражая различные варианты значения.

4. Рекомбинантный белок Immunodetection

1. Чтобы определить уровнях выражения протеина, урожай культур дрожжей, индуцированной для 16 h центрифугированием в 4000 x g 6 мин и хранить клетки окатышей на-80 ° C.
   1. Ресуспензируйте собранных клетки, выражая рекомбинантных белков для 16 h в PBS. Подготовка 200 мкл клеточных суспензий каждого Aβ42-GFP мутант ОД₅₉₀ 20.
2. Для анализа доли общего белка, урожай 100 мкл каждого мутант центрифугированием в 14.000 x g 20 мин и Ресуспензируйте гранулы клетки в том же объеме буфера lysis дрожжей Y-за (50 мм трис-HCl рН 8,0, 1% ДМСО, 200 мм NaCl, ЭДТА 1 мм, содержащие 10 мг/мл SB3-14 (myr istyl sulfobetaine) дополнены 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF)).
   1. Проинкубируйте образцы для 20 мин при комнатной температуре под мягким агитации.
3. Определите концентрацию белка экстракт, используя assay Брадфорд. Загрузка до 5 мкг белка экстракта каждого образца на электрофорез геля акриламида 15% SDS-PAGE и пятно на мембрану винилидена фторид (PVDF) на 100 V 60 мин.
   1. Подготовьте Брэдфорд реагента с 100 мг Кумасси синим G-250 растворяют в 50 мл 95% этиловом спирте и добавить 100 мл 85% (w/v) фосфорной кислоты. Затем когда краситель полностью не растворится, разбавьте смесь с ddH₂O до 1 Л и процеживают через фильтр целлюлозная непосредственно перед использованием.
      Примечание: Брэдфорд Реагент должен быть светло-коричневый.
   2. Подготовка стандарта бычьим сывороточным альбумином (БСА), начиная от 5-100 мкг белка в 1000 мкл Реагента Брэдфорд.
   3. Добавление 1-10 мкл белка экстракт 1 мл реагента Брэдфорд и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 5 мин.
   4. Измерьте absorbance стандартов и экстракт образцы протеина в ОД₅₉₅.
   5. Для анализа сделайте сюжет с оптической плотности значения, полученные для стандартов против. мкг белка. На основе стандартной кривой, определите концентрации оригинальные образцы от количество белка, учитывая объем и разрежения, если таковые имеются.
4. Промойте мембрану с 1 x трис амортизированное saline (TBS), 0,1% 20 анимации (TTBS) и заблокировать его с помощью обезжиренное сухое молоко 5% (w/v) в 1 x TTBS.
   1. Для приготовления 1 Л 10 x TBS, распустить 24 g Tris база и 88 г NaCl в 900 мл H₂O_dd и отрегулировать pH 7.6. Добавить ddH₂O окончательный объемом 1 л. 1 x решения смешайте 1 часть акций 10 x с 9 частей ddH₂O.
5. Проинкубируйте мембрану за 1 час с 1:1,000 6E10 разбавленный основное антитело β-амилоида и за 1 ч при комнатной температуре с козлом вторичное антитело конъюгат анти мыши IgG-ПХ разводят 1:10 000.
6. Разработка мембраны с использованием 1 мл Luminata флуоресцентных реагентов и количественно полос денситометрических анализом, как описано в пункте 5.2.

5. анализ данных

1. Чтобы проанализировать данные, полученные ФК, создайте таблицу отображение средней интенсивности флуоресценции (MFI) и средний флуоресценции с его соответствующей стандартной ошибки и/или коэффициент дисперсии (CV) для флуоресценции GFP и окислительного стресса.
   1. Нажмите на вкладку инспектора и статистики значок, чтобы настроить статистические данные, которые необходимы для каждого канала.
      Примечание: При сравнении вариантов белка, преобразуйте флуоресценции значения данных в диван за фона или резолюции метрику (РР):
      
      В этой метрике средний образец является среднее флуоресценции проблема образцов, средняя управления является среднее флуоресценции клеток, используемого как элемент управления, и SD — стандартное отклонение средней флуоресценции. RD фактором является более точный индекс, чем значение МФО, как он не только вычисляет разницу между образцами, но и счета для распространения данных. Этот расчет специально уместно при сравнении данных, поступающих из различных экспериментов со временем. После того, как были рассчитаны RDs, использование статистического теста рекомендуется подтвердить значимость наблюдаемых различий между вариантами белка.
2. Для белка immunodetection количественную оценку уровней рекомбинантных белков, Западная помарка, используя ImageJ программного обеспечения.
   1. Перед анализ денситометрии конвертировать в JPEG файла формата и серого режим оригинальных изображений raw развитых мембраны.
   2. Настройте Набор измерений раздел меню Analyze означаетзначение серый.
   3. Нажмите на инструмент прямоугольник с ImageJ и определить область интереса (ROI) с размером последовательного анализа денситометрия группы. Центр каждой полосы на изображении мембрана внутри созданного прямоугольную рамку и записывать измерения по одному с помощью Ctrl + M (команда измерения).
   4. Измеряют местные фон рядом с каждой группы, применение одной и той же области ROI. После измерения вычитайте соответствующие местные фон от каждой индивидуальной группы.

Результаты

Этот протокол описывает, как использовать коллекцию 20 вариантов Aβ42 пептид, где был мутировал Phe19 чтобы все аминокислоты природного proteinogenic²⁸. Теоретические агрегации склонности этих белков могут быть проанализированы с использованием двух различных bioinfor...

Обсуждение

Широкий спектр заболеваний связано с накоплением смятых протеинов в клеточных вкладов^6,,78,33. Многие усилия были сделаны разгадать молекулярные механизмы, которые вызывают наступления этих болезней с использованием ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast cells BY4741	ATCC	201388	Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) plasmid	Agilent Genomics	217454	Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma	Y1501	Powder
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids	Sigma	Y0626	Powder
Raffinose	Sigma	R7630	Powder
Glucose	Sigma	G7021	Powder
Galactose	Sigma	G0750	Powder
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3991	Solution 10X
CellROX Deep Red Reagent	Life Technologies	C10422	Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.
Y-PER protein extraction reagent	Thermo Scientific	78990	Liquid cell lysis buffer
Acrylamide/Bis-acrylamide	Sigma	A6050	Solution
Bradford dye reagent	Bio-Rad	5000205	Dye reagent for one-step determination of protein concentration
β-amyloid antibody 6E10	BioLegend	803001	Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate	Bio-Rad	1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)	Sigma	93482	Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol
FACSCanto flow cytometer	BD Biosciences	657338	Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell	Bio-Rad	1703930	Protein transference system
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems	Bio-Rad	1658000FC	Electrophoresis system