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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous avons développé un modèle de cancer du sein hétérogènes constituées de cellules immortalisées de tumeur et fibroblastes incorporés dans un bioink d’alginate/gélatine bioprintable. Le modèle récapitule le microenvironnement de tumeurs in vivo et facilite la formation des sphéroïdes multicellulaires de tumeur, ce qui donne à comprendre les mécanismes conduisant la tumorigenèse.

Résumé

L’hétérogénéité cellulaire, biochimique et biophysique du microenvironnement tumeur native n'est pas récapitulée par croissant lignées de cellules cancéreuses immortalisé, à l’aide de culture cellulaire (2D) deux dimensions classiques. Ces problèmes peuvent être surmontés en utilisant des techniques bioprinting pour construire des modèles de tumeur (3D) en trois dimensions hétérogènes selon laquelle les différents types de cellules sont incorporés. Alginate et gélatine comptent parmi les plus courantes biomatériaux employés dans bioprinting en raison de leur biocompatibilité, "biomimétisme" et les propriétés mécaniques. En combinant les deux polymères, nous avons atteint un hydrogel composite de bioprintable avec des similitudes à l’architecture microscopique d’un stroma tumeur native. Nous avons étudié l’imprimabilité de l’hydrogel composite via rhéologie et obtenu la fenêtre d’impression optimale. Les fibroblastes et les cellules cancéreuses du sein ont été incorporés dans les hydrogels et imprimées pour former un modèle 3D imitant le microenvironnement in vivo . Le modèle hétérogène bioprinted réalise une grande viabilité pour la culture cellulaire à long terme (> 30 jours) et favorise l’auto-assemblage des cellules cancéreuses du sein en sphéroïdes multicellulaires tumeur (SCTM). Nous avons observé la migration et l’interaction des cellules fibroblastes associés au cancer (CAFs) avec le Centre des SCTM dans ce modèle. En utilisant les plates-formes de culture de cellules bioprinted comme des systèmes de co-culture, il offre un outil unique pour étudier la dépendance de la tumorigenèse sur la composition du stroma. Cette technique dispose d’un haut rendement, faible coût et haute reproductibilité, et il peut également fournir un modèle alternatif aux cultures monocouches de cellules classiques et des modèles animaux de tumeurs pour étudier la biologie du cancer.

Introduction

Bien que la culture de cellules 2D est largement utilisée dans la recherche sur le cancer, les limitations existent comme les cellules sont cultivées dans un format de monocouche avec une concentration uniforme de nutriments et d’oxygène. Ces cultures n’ont pas importante cellule-cellule et interactions cellule-matrice présent dans le micro-environnement de tumeur native (TME). Par conséquent, ces modèles mal récapitulent les conditions physiologiques, ce qui entraîne des comportements cellulaires aberrants, y compris les morphologies contre naturels, organisation de récepteurs irrégulière, polarisation de la membrane et l’expression des gènes anormaux, parmi d’autres conditions1,2,3,4. En revanche, la culture cellulaire 3D, où les cellules sont développées dans un espace volumétrique comme organoïdes, des agrégats ou des sphéroïdes, propose une autre technique pour créer des environnements in vitro plus précis afin d’étudier la physiologie et la biologie cellulaire fondamentale. Modèles de culture cellulaire 3D peuvent aussi encourager les interactions cellule-ECM qui sont critiques caractéristiques physiologiques de la native TME vitro1,4,5. La nouvelle technologie 3D bioprinting fournit des possibilités pour construire des modèles qui simulent la TME hétérogène.

Bioprinting 3D est dérivé de prototypage rapide et permet la fabrication de microstructures 3D qui sont capables d’imiter certaines des complexités de la vie des échantillons de tissus6,7. Les méthodes actuelles de bioprinting comprennent jet d’encre, d’extrusion et impression assistée par laser8. Parmi eux, la méthode d’extrusion permet l’hétérogénéité à être commandée dans les matrices imprimées en positionnant précisément des types distincts de matières à différents endroits initiales. Par conséquent, c’est la meilleure approche pour fabriquer hétérogènes en vitro modèles impliquant plusieurs types de cellules ou de matrices. Bioprinting extrusion a été utilisée avec succès pour construire les échafaudages en forme auriculaire9, structures vasculaires10,11,12et tissus13, résultant dans la cellule et de la haute fidélité d’impression de la peau viabilité. La technologie comporte également des sélections de matériel polyvalentes, la possibilité de déposer des matériaux avec des cellules intégrées avec une densité connue et une reproductibilité élevée14,15,16,17 . Les hydrogels naturels et synthétiques sont fréquemment utilisés comme bioinks pour 3D bioprinting en raison de leur biocompatibilité, bioactivité et leurs réseaux hydrophile qui peut être conçue pour ressemblent structurellement à l’ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Les hydrogels sont également avantageux puisqu’ils peuvent inclure des sites adhésifs pour les cellules, éléments structuraux, perméabilité d’éléments nutritifs et des gaz, et les propriétés mécaniques appropriées pour encourager les cellule développement24. Par exemple, hydrogels de collagène offre intégrine sites d’ancrage que les cellules peuvent utiliser pour attacher à la matrice. Gélatine, collagène dénaturé, conserve des sites similaires d’adhérence cellulaire. En revanche, l’alginate est bioinert mais fournit l’intégrité mécanique en formant des liaisons transversales avec les ions divalents25,26,27,28.

Dans ce travail, nous avons développé un hydrogel composite comme un bioink, composé d’alginate et de gélatine, avec des similitudes à l’architecture microscopique d’un stroma tumeur native. Les fibroblastes et les cellules cancéreuses du sein ont été incorporés dans les hydrogels et imprimé via un bioprinter axée sur l’extrusion pour créer un modèle 3D qui imite le microenvironnement in vivo . L’ingénierie environnement 3D permet de cellules cancéreuses former des sphéroïdes multicellulaires tumeur (SCTM) avec une grande viabilité pendant de longues périodes de culture cellulaire (> 30 jours). Ce protocole illustre les méthodes de synthèse composites hydrogels, qui caractérisent la microstructure des matériaux et une imprimabilité, bioprinting cellulaires modèles hétérogènes et observer la formation des SCTM. Ces méthodes peuvent s’appliquer à autre bioinks en extrusion bioprinting aussi bien quant aux desseins de différents modèles de tissus hétérogènes avec des applications potentielles dans le dépistage des drogues, essais de migration des cellules et des études qui mettent l’accent sur la cellule fondamentale fonctions physiologiques.

Protocole

1. préparation des matériaux, Hydrogel et matériaux de Culture cellulaire

  1. Préparation de matériel et solution
    1. Lavez et séchez les 250 mL et béchers en verre 100 mL, agitateurs magnétiques, spatules, cartouches de 10 mL, buses cylindriques de 25 G avec (une longueur de 0,5 po) et 250 µm de diamètre intérieur. Stériliser le matériel à l’autoclave eux à 121 ° C/15 min/1 ATM conserver les matériaux dans des conditions stériles jusqu'à utilisation.
      Remarque : Reportez-vous à la Table des matières pour les informations sur le fournisseur.
    2. Environ 3 g d’alginate (3 % p/v) et 7 g de gélatine (7 % p/v) (désigné ci-après comme A3G7).
    3. Stériliser les éléments suivants sous ultraviolets au moins 4 h : alginate et gélatine poudres, film de paraffine, morceaux de feuille d’aluminium de 5 cm2et 1 mL et seringues 5 mL. Stériliser les couvercles d’extrémité, pointe caps et pistons en immergeant dans l’éthanol à 70 % pendant au moins 4 h et les laver 2 x avec de l’eau ultra pure stérile.
      Remarque : Reportez-vous à la Table des matières pour les informations sur le fournisseur.
    4. Dissoudre 4 g d’agarose avec de l’eau ultra pure et stériliser à l’autoclave.
      Remarque : L’agarose est complètement dissous après le processus d’autoclavage.
    5. Préparer une solution de 100 mM de chlorure de calcium anhydre (CaCl2) dans l’eau ultra pure stérile et un filtre stérile (avec une taille de pore de 0,22 µm) avant utilisation.
    6. Pour les plaques de 6 puits recouvert d’agarose, faire fondre l’agarose stérile dans un four à micro-ondes pour obtenir une solution liquide ; puis, sous une armoire de biosécurité (BSC) et à l’aide d’une micropipette de 1 mL, ajouter 2 mL par puits et mélanger doucement afin de créer une couche uniforme dans le fond du puits. Laisser refroidir et de sceller le puits avec le film de paraffine. Gardez-le à température ambiante (RT) jusqu'à utilisation.
  2. Préparation du précurseur A3G7 hydrogel
    1. Mélanger 3 g d’alginate et 7 g de poudre de gélatine dans un bécher de 250 mL dans un BSC. Ajouter un agitateur magnétique et 100 mL de SPD. Sceller le bécher en paraffine stérile film et l’aluminium en feuille métallique (2de 5 cm) pour éviter la contamination.
    2. Dissoudre les poudres sous une agitation constante dans une plaque magnétique/chaud avec 600 tr/min à 60 ° C pendant 1 h et au RT pour un supplément de 2 h.
    3. Faire chauffer le matériau à 37 ° C jusqu'à ce que le gel subit une transition de phase à l’état liquide (pour 100 mL de solution de gel stock, cela prend environ 45 min). Transvaser la solution dans les tubes à centrifuger conique stérile de 50 mL, sceller et centrifuger les tubes à 834 x g pendant 5 min éliminer les bulles de gaz dans le matériau.
    4. Aspirer le précurseur de l’hydrogel en seringues de 10 mL. Les seringues avec capuchons d’étanchéité et film de paraffine. Stocker à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
  3. Culture cellulaire
    Remarque : Les étapes de cette section doivent être exécutés dans des conditions stériles.
    1. Préparer le milieu DMEM comme suit (pour 1 L) : dans une GCS, mélanger 100 mL de sérum fœtal (SVF) plus 10 mL d’une solution antibiotique/Antimycosique (un 100 x solution stabilisée) dans un récipient stérile fraîche. Ajouter milieu DMEM pour ajuster le mélange à 1 000 mL. Sceller le contenant et le conserver à 4 ° C.
    2. Dans un bain d’eau préalablement chauffée (37 ° C), décongélation 1 flacon de MDA-MB-231-GFP (lignée de cellules cancéreuses du sein humain localisation GFP-étiqueté, nucléaire) et 1 flacon de TMI-90-mCherry (fibroblastes associés au cancer de lignées cellulaires mCherry marquée, avec localisation cytoplasmique ) des cellules du stockage d’azote liquide en les déplaçant doucement dans l’eau. Les deux lignées cellulaires et les plasmides pour GFP et le marquage de mCherry, sont disponibles dans le commerce.
    3. Transférer 160 µL/puits de la solution de cellules (3 x 106 cellules/mL) dans une plaque 6 puits et ajouter 5 mL de milieu DMEM chauffée (37 ° C). Incuber la plaque à 37 °C/5% CO2 pendant 24 à 48 heures, jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence de 80 %.
    4. Lorsque les cellules atteignent la confluence, jetez le milieu et rincez les cellules deux fois avec SPD ; Incuber les cellules avec 500 µL de solution de trypsine-EDTA/puits (0,25 %, 1 x, préalablement chauffé à 37 ° C) à 37 ° C pendant 6 min. Puis, inactiver la trypsine en ajoutant 500 µL de FBS, récupérer la solution portable et transférer dans des flacons de T-75. Les incuber à nouveau à 37 °C/5% CO2 jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence de 80 %.
      Remarque : Le volume de solution de trypsine-EDTA peut varier selon le navire la croissance des cellules.
    5. Répétez l’étape précédente pour travailler avec des cellules sur passage 3-4 car c’est lorsque les cellules ont une activité métabolique et la stabilité.
    6. Compter les cellules à un dosage de bleu trypan (0,4 %) pour déterminer la concentration initiale de cellules à mélanger avec l’hydrogel.

2. les mesures des propriétés rhéologiques des Hydrogels

  1. Préparer le précurseur d’hydrogel alginate/gélatine comme indiqué au point 1.2.
    Remarque : Les conditions stériles ne sont pas nécessaires pour les échantillons générés pour les essais mécaniques et de l’analyse. Tous les tests rhéologiques sont effectués en trois exemplaires.
  2. Prenez une seringue du précurseur hydrogel et réchauffer dans un bain-marie à 37 ° C pendant 1 h.
  3. Allumez le rhéomètre et initialisez le système conformément aux étapes suivantes.
    1. Allumez le compresseur d’air lié au rhéomètre et laissez le compresseur fonctionner pendant 30 min. interrupteur sur le boîtier de commande de température pour le rhéomètre, allumez le rhéomètre lui-même et mettre en marche l’ordinateur relié au rhéomètre.
    2. Ouvrez le logiciel rheometer, cliquez sur initialiser sur le panneau de configuration et laisser le processus d’initialisation terminer. Régler la température de la plate-forme à 37 ° C sur le panneau de configuration.
    3. Cliquez sur l’onglet de l’ensemble des instruments de mesure et accédez à la fonction de service de démarrage, sélectionnez inertie conducteur réglage dans le menu déroulant et cliquez sur Démarrer l’ajustement dans la fenêtre pop-up.
    4. Monter un parallèle à l’outil dans le rhéomètre de mesure. Toutes les expériences effectuées ici utilisent une plaque de diamètre 25 mm avec un écart de 1 mm entre les plaques.
    5. Cliquez sur définir le zéro-gap dans le panneau de commande et attendre que la procédure se termine. Faites attention à la force normale au cours de ce processus.
      Remarque : Après cette procédure, la force normale doit être 0.
    6. Cliquez sur l’onglet de l’ensemble des instruments de mesure et accédez à la fonction de service de démarrage, sélectionnez ajuster haute inertie mesure de systèmeet cliquez sur Démarrer l’ajustement dans la fenêtre pop-up. Une fois fait, cliquez sur le bouton triangle sur le panneau de commande pour permettre à l’appareil de mesure remonter.
  4. Procéder à un balayage de l’amplitude.
    1. Cliquez sur Démarrer, puis cliquez sur Insérer dans le menu principal, sélectionnez attendre dans le menu déroulant. Tirez vers le haut de la fenêtre Paramètres et définissez le temps d’attente à 2 h.
      Remarque : Cela va ajouter une étape d’attente avant les épreuves.
    2. Cliquez sur Démarrer, puis cliquez de nouveau sur le bouton Insérer et dans le menu déroulant, sélectionnez le périphérique. Tirez vers le haut de la fenêtre Paramètres, choisissez la températureet qu’il est de 25 ° C. Décochez la case d’attendre jusqu'à ce que la valeur soit atteinte.
    3. Cliquez sur l’étape de mesure, puis cliquez sur la variable de souche de l’Oscillation, tirer vers le haut de la fenêtre Paramètres, définissez le Profil pour être le logarithme de la rampeet modifiez la valeur à 0,001 % et 100 % comme la souche initiale et de la déformation finale, respectivement. Définit la fréquence à 0,01 Hz.
    4. Cliquez sur le bouton Ajouter pour ajouter la variable de la température . Cliquez sur la variable température et réglez-le à 25 ° c. Dans la fenêtre de pull-up, développez calculatrice, la valeur de densité de points à 10 points par décennie.
    5. Prendre la seringue hors de l’eau du bain et expulser environ 0,5 mL du précurseur sur la plateforme de rhéomètre.
    6. Cliquez sur le bas triangle bouton sur le panneau de configuration. Attendez que l’appareil de mesure descendre jusqu'à la position de coupe.
    7. Utilisez une spatule pour couper n’importe quel excès précurseurs ayant échappé au bord de l’appareil de mesure et de jeter le matériel superflu.
    8. Pipette d’huile minérale sur le bord de l’appareil de mesure et attendez que l’huile scelle complètement la frontière.
    9. Cliquez sur Continuer sur le panneau de configuration. Puis cliquez sur le bouton Démarrer (triangle vert), puis en cliquant sur le bouton Continuer sur l’écran du bas.
    10. Lorsque le test est terminé, l’outil de mesure de la sortie et puis cliquez sur le triangle vers le haut le bouton sur le panneau de configuration. Retirez l’appareil de mesure et nettoyez-le avec l’éthanol à 70 %. Nettoyer la plate-forme avec l’éthanol à 70 %.
    11. Dans le projet actuel, cliquez sur l’étape mesure et tirer vers le haut de la fenêtre de configuration. Maintenant, ensemble la fréquence de 100 Hz. garder tous les autres paramètres inchangés.
    12. Répétez les étapes 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Cliquez sur schéma. Observer la courbe de G', G » par rapport à la souche de l’oscillation. Trouver les points de flexion de G' pour les deux fréquences (0,01 Hz et 100 Hz). Trouver les souches d’oscillation correspondantes pour les deux points de flexion.
    14. Choisissez la plus petite souche d’oscillation et utilisez 1/10 de cette souche pour tous les tests d’oscillation effectués par la suite.
      Remarque : L’apparition de G' déflexion est considéré comme l’ultime déformation élastique linéaire (ULES) qui ne doit pas être dépassée dans les tests de suivi. Le ratio 1/10 est généralement utilisé en ingénierie pour des raisons de sécurité. Cette calculée souche est dénotée comme gC.
    15. Une fois l’épreuve terminée, cliquez sur Table, copiez toutes les données et collez-le dans un fichier texte.
  5. Procéder à un balayage de la température.
    1. Cliquez sur mes applications , puis sélectionnez le modèle rampe de température, de cisaillement oscillatoire : gélification.
    2. Nommez le projet.
    3. Cliquez sur l’étape de mesure du flux de travail. Puis cliquez sur la variable température, tirer vers le haut de la fenêtre Paramètres et régler la température initiale et finale à 37 ° C et 25 ° C, respectivement.
    4. Dans la fenêtre de pull-up, affectez souche d’oscillation à 0,1 %, fréquence d’oscillation de 1Hz. Puis définissez le nombre de points de données à 61. La fréquence de collecte de données à 1 point/min. cliquez sur calculatrice et valeur Point densité 0,2 ° C/point de.
      Remarque : Ceci permettra à la température de changer à un rythme de 0,2 ° C/min.
    5. Charger l’échantillon sur la plate-forme de rhéomètre et effectuer le test en suivant les étapes 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Cliquez sur un diagramme, observer le G', G » par rapport à la température. Trouver le point de croisement de G' et G ». Trouver la température au point de croisement.
      Note : Ceci est la température de transition de sol/gel du précurseur hydrogel.
    7. Répétez l’étape 2.4.15.
  6. Procéder à un balayage de temps isotherme.
    1. Cliquez sur mes apps et trouvez et cliquez sur le modèle isotherme de température-temps de test. Cliquez sur l’étape de mesure du flux de travail et puis cliquez sur la variable de souche de l’Oscillation, tirer vers le haut de la fenêtre de paramètres, la valeur de la souche d’oscillation à 0,1 % et définir la fréquence d’oscillation de 1 Hz. Dans la fenêtre de pull-up, définissez le nombre de points de données à 120. Réglez la fréquence de collecte de données sur 1 point/mn.
      Remarque : La valeur de cette souche est basée sur les résultats du balayage de l’amplitude.
    2. Cliquez sur le bouton Ajouter pour ajouter la variable de la température . Cliquez sur la variable température dans la fenêtre du milieu et définissez-la à 25 ° C.
      1. Cliquez avec le bouton droit sur l’étape dispositif passer au point de mesure du flux de travail, cliquez sur supprimer. Puis cliquez sur l’étape Qu'appareil valeur, décochez la case attendre jusqu'à ce que la valeur est atteinteet définissez la valeur à 25 ° C. Cliquez sur la photo, tittle, boutons à l’écran du bas, décochez la case Continuer. Ensuite, cliquez sur l’étape de démarrage, nommez le projet et enregistrez-le.
    3. Charger l’échantillon sur la plate-forme de rhéomètre et démarrez le test en suivant les étapes 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Observer le G', G » par rapport à la fois. Trouver le point de croisement de G' et G ». Trouver le temps au point de croisement. Une fois l’épreuve terminée, cliquez sur Table, copiez toutes les données et collez-le dans un fichier texte.
      Note : Ceci est la période de transition de sol/gel du précurseur hydrogel à 25 ° C.
  7. Mesurer la limite d’élasticité à divers moments de gélifiants.
    1. Cliquez sur mes apps et trouvez et cliquez sur le modèle stress rendement et flux, gélatineuse. Nommez le projet. Cliquez sur l’étape de démarrage du flux de travail. Cliquez sur Insérer dans le menu du haut et, dans le menu déroulant, sélectionnez attendre. Tirez vers le haut de la fenêtre Paramètres et définissez le temps d’attente à 20 min.
      Remarque : Cela va ajouter une étape d’attente avant les épreuves.
    2. Cliquez sur Démarrer, puis cliquez sur Insérer à nouveau et, dans le menu déroulant, sélectionnez périphérique. Tirez vers le haut de la fenêtre Paramètres, a choisi la température et réglez-le à 25 ° C. Décochez la case attendre jusqu'à ce que la valeur soit atteinte.
    3. Cliquez sur l’étape de mesure du flux de travail, sélectionnez la variable de la contrainte de cisaillement, tirer vers le haut de la fenêtre Paramètres et définir la contrainte de cisaillement initiale et finale à 0 et 10 000 Pa, respectivement.  Cliquez sur calculatrice, réglez la densité de Point à 0,2 point/PA. Dans l’onglet points de données sur la gauche, la valeur 1 point/seconde.
      Remarque : cela donne un taux de stress rampe de 5 Pa/s.
    4. Cliquez sur l’onglet contrôle de l’événement au bas de la fenêtre de pull-up et de définir le critère de l’arrêt : arrêter la mesure si le cisaillement taux > 100 s-1.
      Remarque : Cela s’arrêtera automatiquement la mesure si le matériel est fourni.
    5. Charger l’échantillon sur la plate-forme de rhéomètre et démarrez le test en suivant les étapes 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Cliquez sur schéma. Observer la courbe contrainte-déformation. Trouver le point de flexion de la souche et de son stress correspondant. Répétez les étapes 2.7.2 - 2.7.6, mais changer le temps d’attente à 30, 40 et 50 min pour chaque répétition ; Cela se traduira par la limite d’élasticité à différents moments de gélifiants.
      Remarque : Ce stress est considéré comme la limite apparente d’élasticité.
      Remarque : le logiciel clics peuvent différer par rhéomètre modèles et des versions des logiciels. Nous vous recommandons les lecteurs à prendre référence des paramètres du tests que nous fournissons, certain temps consulter le manuel d’un rhéomètre/logiciel spécifique dans l’utilisation pratique.
       

3. conception, chargés de cellule Hydrogel et impression 3D modèles d’échafaudage

  1. Conception de l’échafaudage
    1. Dessiner un modèle de type hélice sur papier.
      Remarque : Le modèle de type hélice ont basé sur les considérations suivantes : (a) il simule le scénario en vivo où les cellules cancéreuses sont entourés de CAFs ; (b) il réduit la concentration de contraintes via l’utilisation de géométries circulaires ; (c) il est flexible afin que les secteurs plus peuvent être ajoutés dans le modèle à l’avenir sans changer les géométries existantes ; et (d) il est plat dans son échelle verticale pour faciliter la diffusion des éléments nutritifs.
    2. Que le centre de l’hélice soit l’origine et utilisent les symboles R,0, R1et R2 pour représenter le rayon maximal du cercle intérieur, secteurs moyens et les secteurs extérieurs, respectivement. Utilisez les symboles m et n pour représenter le nombre d’arcs internes et de rayons à l’intérieur du secteur, respectivement.
    3. Calculer les coordonnées de chaque nœud sur le modèle de type hélice et écrivez-les dans les expressions symboliques de R0, R1, R2, met n.
    4. Démarrer un programme script, la valeur R0, R1, R2, met n comme variables et l’expression symbolique de chaque nœud de clé d’entrée.
      Remarque : Reportez-vous à la Table des matières pour toute information de logiciel.
    5. Organiser un chemin qui relie les nœuds et assignez une cartouche pour le cercle, les secteurs central et les secteurs extérieurs. Définir l’épaisseur de la couche à 150 µm et le nombre de couches à 4.
    6. Laisser le programme à un fichier texte au format de G-code qui est reconnaissable par la bioprinter.
    7. La valeur R0 = 3,85, R1 = 6.85, R2 = 8.65, m = 2 et n = 5. Exécutez le script et récupérer le fichier G-code généré. Copiez et collez le fichier dans le dossier dédié de G-code de la bioprinter.
    8. Allumez le bioprinter et son logiciel de contrôle. Initialisation de l’imprimante. Ouvrez le script de G-code juste créé et toutes les pressions à zéro. Retournez dans le logiciel de contrôle, cliquez sur l’onglet Générateur de Scaffolderet puis cliquez sur le bouton Run dans le coin en bas à droite. Observer le chemin de déplacement de l’imprimante.
      Remarque : Cela permettra de tester la précision du G-code généré. Se référer à la Table des matières pour plus d’informations liées à la bioprinter.
    9. Cette étape est facultative. Construire un modèle 3D démonstratif basé sur les paramètres ci-dessus via le logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO).
      Remarque : Reportez-vous à la Table des matières pour les informations sur les logiciels du vendeur.
  2. Faire un précurseur d’hydrogel A3G7 chargés de cellule
    Remarque : Les étapes de cette section doivent être exécutés dans des conditions stériles. Gardez le bioprinter à l’intérieur d’un BSC.
    1. Stériliser le bioprinter en pulvérisant de l’éthanol à 70 % soigneusement et exposer à la lumière UV pendant la nuit.
    2. Prenez une seringue du précurseur hydrogel (à 4 ° C) et le réchauffer au bain-marie à 37 ° C pendant 1 h.
    3. Prendre la fiole-T avec les cellules (Voir l’étape 1.3) de la CO2 incubateur et placez-la à l’intérieur d’un BSC. Jeter le milieu de culture et rincez deux fois les cellules avec le SPD. Ajouter une solution de trypsine chauffée-EDTA (3,0 mL) et incuber les cellules à 37 ° C pendant 6 min. désactiver la trypsine avec un même volume de FBS. Compter les cellules en utilisant le bleu trypan test.
    4. Prendre la seringue du précurseur hydrogel du bain-marie, nettoyer et stériliser avec l’éthanol à 70 %. Mettre la seringue dans la GCS.
    5. Extruder environ 3 mL d’hydrogel précurseur dans une cartouche d’impression de 10 mL. Mélanger le précurseur avec les cellules MDA-MB-231-GFP à 1 x 106 cellules/mL de pipetage-lentement, en évitant la production de bulles. Couvrir la cartouche avec l’extrémité stérile et les bouchons supérieurs et scellez-la avec film de paraffine. Il centrifuger à 834 g pendant 1 min éliminer les bulles de gaz produites.
    6. Répétez les étapes 3.2.3 - 3.2.5 pour le précurseur de cellules chargées de TMI-90-mCherry et le précurseur acellulaire.
    7. Stériliser tous les 3 cartouches avec l’éthanol à 70 % et puis chargez-les dans les chambres de le bioprinter. Dans le logiciel de contrôle de l’imprimante, régler la température de la cartouche à 25 ° C. Attendez 35 min pour permettre le précurseur d’atteindre des conditions imprimables.
      Remarque : Cette fois n’affecte pas la viabilité des cellules intégrées dans l’hydrogel.
  3. Modèles d’impression 3D
    1. Dans le logiciel de contrôle de l’imprimante, développez l’onglet bras articulé dans le logiciel de contrôle de l’imprimante, cliquez sur 1 cartouche à l’interface graphique à gauche et puis cliquez sur le bouton de mesure court pour mesurer la position de l’extrémité de la buse. Répétez cette opération pour les 2 autres cartouches.
    2. Placer une microplaque polystyrène clair, ouvrez le fichier G-code et changer la pression à 200 kPa pour toutes les cartouches. Retournez dans le logiciel de contrôle, cliquez sur l’onglet Générateur de Scaffolder, sélectionnez un point pour lancer l’impression et puis cliquez sur le bouton Run dans le coin en bas à droite. Répétez cette étape pour obtenir 3 répétitions de plus.
    3. Après l’impression de répétitions tous les modèles d’hélice, ajouter un 100 mM CaCl2 solution pour réticuler les modèles pendant 1 min et rincer 2 x avec le SPD pour enlever l’excès d’ions Ca++ .
    4. Transvaser avec soin les modèles sur un plat de 6 puits d’agarose-enduit à l’aide d’une spatule. Ajouter 5 mL de médias DMEM dans chaque puits. Incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
      Remarque : Veillez à ce que les modèles flottent dans les puits.
    5. Remplacer le milieu de culture cellulaire avec un milieu frais tous les 3 jours, il culture pendant 30 jours au total.

4. viabilité et expériences de Formation sphéroïde sur les disques d’Hydrogel.

  1. Préparation du disque hydrogel
    1. Répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.6.
      Remarque : Il est possible de remplacer la cartouche avec un petit récipient stérile.
    2. Utiliser une seringue stérile de 1 mL graduée et coupez la buse pour créer un grand trou dans la seringue (le trou a le même diamètre que le reste du tube de la seringue). Nettoyer avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le jusqu'à ce qu’il soit sec.
      Remarque : Pour ce faire dans une GCS stérile.
    3. Utiliser un couvercle de puits-plaque, ajouter 100 mM CaCl2 , jusqu'à ce que la surface est couverte ; Ensuite, prenez l’hydrogel de cellules chargées de remplir la seringue ; Extruder 100 µL en utilisant la pendaison drop méthode. Laisser l’hydrogel pendant 1 min et rincez-la avec SPD excessive. Transférer les disques d’hydrogel sur un plat de 6 puits d’agarose-enduit, ajouter 5 mL de DMEM basale et les incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 30 jours. Actualiser le support tous les 3 jours.
  2. Viabilité cellulaire et sphéroïde
    1. Un test MTS permet de déterminer la viabilité des cellules. Lavez chaque disque avec SPD et coupez-le en 4 parties avec une fine lame stérile. Collecter les pièces de l’intégralité du disque et de les transférer sur une plaque à 96 puits. Puis, ajouter 100 μL de DMEM plus 20 μl de réactif MTS dans chaque puits et incuber le mélange à 37 ° C pendant 2 h.
    2. Après la réaction de MTS, récupérer le surnageant et la transférer sur une plaque à 96 puits propre. Mesurer l’absorbance des échantillons à 490 nm.
  3. Formation de sphéroïde
    1. Retirez le modèle hélice ou disque couvé de l’incubateur aux jours 0, 7, 15, 21 et 30 de la culture et les transférer sur une plaque propre 6 puits.
    2. Utiliser un disque de rotation confocal de microscope pour visualiser les sphéroïdes et acquérir les images à l’aide de multiples positions et z-piles inversé. Image de chaque hélice, ou modèle de disque, le long de son diamètre horizontal de gauche à droite avec un écart de 500 µm et acquérir une z-pile du bas au haut de la page plan focal à chaque position horizontale.
      Remarque : Reportez-vous à la Table des matières pour les informations sur le fournisseur.
    3. Reconstruire l’image en utilisant un outil arithmétique de pile maximale, fourni par le programme ImageJ, pour créer les images 2D utilisés pour une analyse de sphéroïde.

5. microscopie électronique par balayage (SEM)

  1. Préparer l’hydrogel alginate/gélatine comme indiqué au point 1.2.
    Remarque : Les conditions stériles ne sont pas requises.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde et azote liquide sont dangereux et doivent être manipulés avec soin.
  2. Mettre 1 mL d’hydrogel dans un mortier, ajouter de l’azote liquide et broyer à l’aide d’un pilon. Continuez à ajouter de l’azote liquide pour éviter l’hydrogel du dégivrage. Transférer la poudre dans un tube à centrifuger 1,5 mL, fermez-le hermétiquement et conserver à-80 ° C pour 2 h. Freeze-Dry de l’échantillon pendant 24 h.
  3. Pour l’imagerie sphéroïde, laver l’hydrogel doucement avec SPD 2 x, fixer les cellules par immersion dans de paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min à 37 ° C, puis rincez-les avec SPD et congelez-les à l’azote liquide. Enfin, Freeze-Dry de l’échantillon pendant 24 h.
  4. Analyser la structure de l’hydrogel/sphéroïde et la morphologie avec un microscope électronique à balayage (MEB) à 25,0 kV, moins de 70 Pa (pression de la chambre) avec un grossissement de 40 X 5, 000 X.

Résultats

Le balayage de température montre une nette différence du précurseur A3G7 à 25 ° C et 37 ° C. Le précurseur est liquid à 37 ° C et possède une viscosité complexe de 1938.1 mPa ± 84,0 x s, ce qui est validé par un supérieur G » sur G'. Quand la température baisse, le précurseur subit une gélification physique en raison de l’enchevêtrement physique spontanée des molécules de gélatine dans un tri-hélice formation29,

Discussion

Les structures chargées de cellule peuvent être compromises en cas de contamination (biologique ou chimique) à tout moment dans le processus. Habituellement, la contamination biologique est vu après deux ou trois jours de la culture comme une couleur changer dans les milieux de culture ou de la structure bioprinted. La stérilisation (physique et chimique de désinfection) est donc une étape clé pour tous les processus liés à la cellule. Remarquable, gélatine d’autoclavage modifie ses propriétés gélifiantes...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Tao Jiang Merci le China Scholarship Council (201403170354) et la bourse doctorale ingénierie de McGill (90025) pour leur financement de bourses d’études. Jose G. Munguia-Lopez Merci CONACYT (250279, 290936 et 291168) et FRQNT (258421) pour leur financement de bourses d’études. Salvador Flores-Torres Merci CONACYT pour leur bourse financement (751540). Joseph M. Kinsella Merci le National Science and Engineering Research Council, la Fondation canadienne pour l’Innovation, Townshend-Lamarre Family Foundation et l’Université McGill pour leur financement. Nous tenons à remercier Allen Ehrlicher de nous permettre d’utiliser son rhéomètre, Dan Nicolau de nous permettre d’utiliser son microscope confocal et Morag Park pour nous accorder l’accès aux lignées cellulaires fluorescent étiquetés.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium alginateFMC BioPolymerCAS-No: 9005-38-3Protanal LF 10/60 FT
GelatinSigma-AldrichG9391Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X)GibcoLS141901361×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplateCorning N/AStirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubesCorning352098Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
CentrifugeGMIN/ASorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrousSigma-AldrichC1016
MilliQ waterMilliporeN/A
Millipore 0.22 µm filtersMilliporeSLGS033SBMillex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302Anton PaarN/A
Rheometer measuring tool CP25Anton Paar79038Conical plate geometry for rheometer
RheoCompassAnton PaarN/ASoftware controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscopeHitachiN/ASEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pureAcros Organics416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM)Gibco11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilizedSigmaA5955
Fetal bovine serumWisent Bioproducts080-150
Cell culture T-75 flasksSigma-AldrichCLS43064175 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1GeSiMN/A
GeSim softwareGeSiMN/ASoftware controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resistEFD Nordson7012126
End capEFD Nordson7014472
Tip capEFD Nordson7014469
Piston EFD Nordson7012182
Stainless nozzle G25EFD Nordson7018345
Water bathVWRN/A
AgaroseSigma-AldrichA9539Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates Corning3516TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscopeOlympus Life ScienceN/AOlympus IX83
MTS assay kitPromegaG3582CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kitMolecular Probes,ThermoFisher ScientificL3224
Trypsin 0.25/EDTA 1XGibco25200-072
Corning 96-well plateCorning3595Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave TuttnauerHeidolph BrinkmannN/AHeidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blueInvitrogen T102820.4% solution
EthanolCommercial AlcoholsP016EA95Greenfield Speciality Alcohols
CO2 IncubatorPanasonicN/AMCO 19AIC-PA
Lyophilizer SP ScientificN/AVirtis Sentry 2.0
SolidWorksDassault SystemsN/AA CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLABThe MathWorksN/AA programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

Références

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