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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un modello di cancro al seno eterogeneo costituito da cellule del tumore e del fibroblasto immortalate incorporate in un bioink di alginato/gelatina bioprintable. Il modello ricapitola il microambiente tumorale in vivo e facilita la formazione di sferoidi multicellulari tumore, producendo la comprensione dei meccanismi di tumorigenesi di guida.

Abstract

L'eterogeneità di cellulare, biochimico e biofisico del microambiente tumorale nativo non è ricapitolata dalla crescente linee cellulari di cancro immortalizzate mediante coltura convenzionale cellulare bidimensionale (2D). Queste sfide possono essere superate utilizzando tecniche multimateriali per costruire modelli eterogenei tridimensionale (3D) del tumore per cui sono incorporati diversi tipi di cellule. Alginato e gelatina sono due dei più comuni biomateriali impiegati in multimateriali dovuto la loro biocompatibilità, biomimicry e proprietà meccaniche. Combinando i due polimeri, abbiamo raggiunto un idrogel composito bioprintable con analogie con l'architettura microscopica di stroma del tumore nativo. Abbiamo studiato la stampabilità di idrogel composito tramite reologia ed abbiamo ottenuto la finestra di stampa ottima. Fibroblasti e cellule di cancro al seno sono stati incorporati nel caso degli idrogeli e stampati per formare un modello 3D che imita il microambiente in vivo . Il modello eterogeneo di bioprinted raggiunge un'alta redditività per colture cellulari a lungo termine (> 30 giorni) e promuove l'auto-assemblaggio delle cellule di cancro al seno in sferoidi multicellulari tumore (MCTS). Abbiamo osservato la migrazione e l'interazione delle cellule del cancro-collegata del fibroblasto (CAFs) con il MCTS in questo modello. Utilizzando piattaforme di cultura cellulare bioprinted come sistemi di co-coltura, offre uno strumento unico per studiare la dipendenza della tumorigenesi sulla composizione dello stroma. Questa tecnica presenta un alto-rendimento, basso costo e alta riproducibilità, e può anche fornire un modello alternativo per colture monostrato cellulare convenzionale e modelli animali del tumore per lo studio di biologia del cancro.

Introduzione

Anche se la coltura delle cellule 2D è ampiamente usato nella ricerca sul cancro, esistono limitazioni come le cellule sono coltivate in un formato monostrato con una concentrazione uniforme di nutrienti e ossigeno. Queste culture mancano importante cellula-cellula e delle interazioni cellula-matrice presentano nel microambiente tumorale nativo (TME). Di conseguenza, questi modelli ricapitolano mal condizioni fisiologiche, conseguente a comportamenti aberrante delle cellule, tra cui morfologie innaturale, recettore irregolare organizzazione, polarizzazione di membrana ed espressione genica anormale, tra l'altro condizioni1,2,3,4. D'altra parte, coltura cellulare 3D, dove le cellule vengono espansi in uno spazio volumetrico come aggregati, sferoidi o organoids, offre una tecnica alternativa per creare ambienti più accurati in vitro per studiare la fisiologia e biologia delle cellule fondamentali. Modelli di coltura cellulare 3D possono anche incoraggiare interazioni cellula-ECM che sono critiche caratteristiche fisiologiche del nativo TME in vitro1,4,5. L'emergente tecnologia 3D multimateriali fornisce possibilità per costruire modelli che simulano la TME eterogenei.

3D multimateriali deriva dalla prototipazione rapida e consente la fabbricazione di microstrutture 3D che sono in grado di alcune delle complessità della vita che imita tessuto campioni6,7. Gli attuali metodi di multimateriali includono estrusione, inkjet e laser-assistita stampa8. Fra loro, il metodo di estrusione consente l'eterogeneità essere controllata all'interno delle matrici stampate posizionando precisamente distinti tipi di materiali in diverse posizioni iniziali. Pertanto, è l'approccio migliore per fabbricare modelli eterogenei in vitro che coinvolgono più tipi di cellule o matrici. Multimateriali di estrusione sono stato utilizzato con successo per costruire auricolari sagomati ponteggi9, strutture vascolari10,11,12e della pelle tessuti13, risultante nella cella e stampa ad alta fedeltà vitalità. La tecnologia dispone anche di selezioni di materiali versatili, la possibilità di depositare materiali con cellule incorporate con una densità nota e alta riproducibilità14,15,16,17 . Idrogeli naturali e sintetici vengono spesso utilizzati come bioinks per 3D multimateriali dovuto la loro biocompatibilità, bioattività e loro reti idrofili che possono essere progettati per assomigliare strutturalmente l'ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Idrogeli sono inoltre vantaggiosi poiché possono includere siti adesivi per cellule, elementi strutturali, permeabilità per le sostanze nutrienti e gas, e le proprietà meccaniche appropriate per incoraggiare lo sviluppo24di cella. Per esempio, collagene idrogel offrono integrina siti di ancoraggio che le cellule possono utilizzare per collegare alla matrice. Gelatina, collagene denaturato, mantiene simili siti di adesione cellulare. Al contrario, alginato è bioinerte ma fornisce integrità meccanica formando legami incrociati con gli ioni bivalenti25,26,27,28.

In questo lavoro, abbiamo sviluppato un composito idrogel come un bioink, composto di alginato e gelatina, con analogie con l'architettura microscopica di stroma del tumore nativo. Fibroblasti e cellule di cancro al seno sono stati incorporati nel caso degli idrogeli e stampato tramite un bioprinter basato su estrusione per creare un modello 3D che imita il microambiente in vivo . L'ambiente 3D derivati dal permette alle cellule tumorali di formare sferoidi multicellulari tumore (MCTS) con un alta attuabilità per lunghi periodi di coltura delle cellule (> 30 giorni). Questo protocollo viene illustrato le metodologie di sintesi di idrogeli compositi, che caratterizzano la microstruttura dei materiali e la stampabilità, modelli eterogenei cellulari multimateriali e osservare la formazione di MCTS. Queste metodologie possono essere applicate ad altri bioinks in estrusione multimateriali pure per quanto riguarda diversi disegni di modelli di tessuto eterogeneo con potenziali applicazioni in screening di farmaci, analisi di migrazione delle cellule e gli studi che si concentrano sulla cellula fondamentale funzioni fisiologiche.

Protocollo

1. preparazione dei materiali, idrogel e Cell Culture materiali

  1. Preparazione materiale e soluzione
    1. Lavate e asciugate 250 mL e Coppe di vetro 100ml, agitatori magnetici, spatole, cartucce da 10 mL, 25 G ugelli cilindrici con (una lunghezza di 0,5 in) e un diametro interno di 250 µm. Sterilizzare in autoclave i materiali li a 121 ° C/15 min/1 ATM conservare il materiale in condizioni sterili fino all'utilizzo.
      Nota: Fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni sul fornitore.
    2. Pesare 3G di alginato (3% p/v) e 7 g di gelatina (7% w/v) (indicato come A3G7 qui di seguito).
    3. Sterilizzare i seguenti elementi sotto luce UV per almeno 4 h: alginato e gelatina polveri, pellicola di paraffina, pezzi di lamina di alluminio di 5 cm2e 1 mL e 5 mL siringhe. Sterilizzare i cappucci, tappi e i pistoni di immergendole in etanolo al 70% per almeno 4 h e lavarli 2 volte con acqua ultrapura sterilizzata.
      Nota: Fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni sul fornitore.
    4. Sciogliere 4 g di agarosio con acqua ultra-pura e sterilizzare in autoclave.
      Nota: L'agarosio è completamente sciolto dopo il processo di sterilizzazione in autoclave.
    5. Preparare una soluzione di 100 mM di cloruro di calcio anidro (CaCl2) in acqua ultra-pura sterilizzata e un filtro sterile (con un diametro dei pori di 0.22 µm) prima dell'uso.
    6. Per piastre da 6 pozzetti rivestite su agarosio, sciogliere l'agarosio sterile in un forno a microonde per ottenere una soluzione liquida; poi, sotto un armadietto di biosicurezza (BSC) e utilizzando una micropipetta da 1 mL, aggiungere 2 mL per pozzetto e mescolare delicatamente per creare uno strato uniforme sul fondo del pozzo. Lasciare raffreddare e sigillare bene con la pellicola di paraffina. Tenerlo a temperatura ambiente (TA) fino all'utilizzo.
  2. Preparazione del precursore A3G7 idrogel
    1. Mescolare 3 g di alginato e 7 g di polveri di gelatina in un becher da 250 mL entro un BSC. Aggiungere un agitatore magnetico e 100 mL di DPBS. Sigillare il becher con paraffina sterile pellicola e foglio di alluminio (5 cm2) per evitare la contaminazione.
    2. Sciogliere le polveri sotto una costante agitazione in una piastra magnetica/calda con 600 giri/min a 60 ° C per 1 h a RT per un extra 2 h.
    3. Riscaldare il materiale a 37 ° C fino a quando il gel viene sottoposto a una fase di transizione allo stato liquido (per 100 mL di soluzione di gel stock, impiega circa 45 min). Trasferire la soluzione in provette da centrifuga coniche sterili 50ml, sigillarli e centrifugare le provette a 834 x g per 5 min eliminare eventuali bolle di gas dal materiale.
    4. Aspirare il precursore di idrogel in siringhe da 10 mL. Sigillare le siringhe con tappi e pellicola di paraffina. Conservarli a 4 ° C fino all'utilizzo.
  3. Coltura cellulare
    Nota: La procedura in questa sezione deve essere eseguita in condizioni sterili.
    1. Preparare il supporto di DMEM basale come segue (per 1 L): in un BSC, miscelare 100 mL di siero bovino fetale (FBS) plus 10 mL di una soluzione di antibiotico/antimicotico (un 100 x soluzione stabilizzata) in un contenitore sterile fresco. Aggiungere il terreno DMEM per regolare la miscela fino a 1.000 mL. Sigillare il contenitore e conservarlo a 4 ° C.
    2. In un bagno di acqua precedentemente riscaldata (37 ° C), sbrinamento 1 flaconcino di MDA-MB-231-GFP (linea cellulare del cancro al seno umano localizzazione GFP-etichettato, nucleare) e 1 flacone di IMR-90-mCherry (linee cellulari del cancro-collegata del fibroblasto mCherry-etichettati, con localizzazione citoplasmatica ) le cellule dallo stoccaggio di azoto liquido spostandoli delicatamente in acqua. Linee cellulari sia i plasmidi per GFP e mCherry etichettatura, sono disponibili in commercio.
    3. Trasferire 160 µ l/pozzetto di soluzione di cella (3 x 106 cellule/mL) in una piastra a 6 pozzetti e aggiungere 5 mL di sostanza basale di DMEM riscaldata (37 ° C). Incubare la piastra a 37 °C/5% CO2 per 24-48 h fino a quando le cellule raggiungono la confluenza di 80%.
    4. Dopo che le cellule raggiungono la confluenza, eliminare il terreno e sciacquare le cellule due volte con DPBS; Incubare le cellule con 500 µ l di soluzione di tripsina-EDTA/pozzetto (0,25%, 1x, precedentemente riscaldato a 37 ° C) a 37 ° C per 6 min. Quindi, inattivare la tripsina aggiungendo 500 µ l di FBS, recuperare la soluzione di cella e trasferirlo in boccette di T-75. Li incubare nuovamente a 37 °C/5% CO2 fino a quando le cellule raggiungono la confluenza di 80%.
      Nota: Il volume della soluzione di tripsina-EDTA può variare a seconda della nave di crescita delle cellule.
    5. Ripetere il passaggio precedente per lavorare con le cellule il passaggio 3-4 come questo è quando le cellule hanno maggiore attività metabolica e stabilità.
    6. Contare le celle usando un'analisi trypan blu (0,4%) per determinare la concentrazione iniziale di cellule per essere miscelato con l'idrogel.

2. misurazioni delle proprietà reologiche di idrogeli

  1. Preparare il precursore di idrogel di alginato/gelatina come descritto al punto 1.2.
    Nota: Condizioni di sterilità non sono necessari per campioni generati per analisi e prove meccaniche. Tutte le prove reologiche vengono eseguite in triplice copia.
  2. Prendere una siringa del precursore idrogel e riscaldarlo a bagnomaria a 37 ° C per 1 h.
  3. Accendere il reometro e inizializzare il sistema attenendosi alla procedura seguente.
    1. Accendere il compressore d'aria collegato al reometro e lasciare che il compressore d'aria eseguire per 30 min. Accendere la casella di controllo di temperatura per il reometro, accendere il reometro stessa e accendere il computer collegato al reometro.
    2. Aprire il software del reometro, fare clic su inizializzare il pannello di controllo e consentire il processo di inizializzazione di fine. Impostare la temperatura di piattaforma a 37 ° C sul pannello di controllo.
    3. Fare clic sulla scheda set di misura per la funzione di servizio di avvio, selezionare inerzia driver regolare nel menu a discesa e fare clic su Avvia registrazione nella finestra a comparsa.
    4. Montare un parallelo attrezzo in reometro di misurazione. Tutti gli esperimenti condotti qui utilizzano un piatto di diametro 25 mm con una distanza di 1 mm tra le piastre.
    5. Fare clic su imposta zero-gap sul pannello di controllo e attendere la procedura alla fine. Prestare attenzione alla forza normale durante questo processo.
      Nota: Dopo questa procedura, la forza normale deve essere 0.
    6. Fare clic sulla scheda set di misura per la funzione di servizio di avvio, selezionare inerzia del sistema di misura superiore regolaree fare clic su Avvia registrazione nella finestra a comparsa. Una volta fatto, fare clic sul pulsante triangolo sul pannello di controllo per consentire lo strumento di misura per spostarsi verso l'alto.
  4. Condurre uno sweep di ampiezza.
    1. Fare clic su avviare, quindi fare clic su Inserisci nel menu principale, selezionare l'ora dal menu a discesa. Tirare sulla finestra di installazione e impostare il tempo di attesa di 2 h.
      Nota: Questo aggiungerà un passaggio di attesa prima delle prove.
    2. Fare clic su avviare, quindi fare nuovamente clic sul pulsante Inserisci e dal menu a discesa, selezionare il dispositivo. Tirare sulla finestra di installazione, scegliere la temperaturae impostarlo per essere di 25 ° C. Deselezionare la casella di attendere fino a quando viene raggiunto il valore.
    3. Fare clic sul passaggio di misurazione, quindi fare clic sulla variabile ceppo di oscillazione, tirare verso l'alto la finestra di configurazione, impostare il profilo come logaritmo di rampae modificare il valore di 0,001% e 100% come il ceppo iniziale e finale ceppo, rispettivamente. Impostare la frequenza a 0,01 Hz.
    4. Fare clic sul pulsante Aggiungi per aggiungere la variabile di temperatura . Scegliere la variabile temperatura e impostarlo per essere di 25 ° C. Nella finestra di pull-up, espandere calcolatrice, impostare densità di punti per 10 punti/decennio.
    5. Prendere la siringa dal bagno di acqua ed estrudere circa 0,5 mL del precursore sulla piattaforma reometro.
    6. Scegliere il verso il basso triangolo pulsante sul pannello di controllo. Attendere che lo strumento di misura spostare verso il basso fino alla posizione di taglio.
    7. Utilizzare una spatola per tagliare qualsiasi eccesso precursori che sfuggito al bordo dello strumento di misura e scartare il materiale superfluo.
    8. Pipettare olio minerale sul bordo dello strumento di misura e attendere che l'olio sigilla completamente il confine.
    9. Sul pannello di controllo, fare clic su continua . Quindi fare clic sul pulsante Start (triangolo verde), seguito facendo clic sul pulsante continua nella schermata inferiore.
    10. Quando il test è fatto, rilasciare lo strumento di misura e quindi scegliere il verso l'alto il triangolo pulsante sul pannello di controllo. Rimuovere lo strumento di misura e pulirlo con etanolo al 70%. Pulire la piattaforma con etanolo al 70%.
    11. Nel progetto corrente, fare clic sul passaggio di misurazione e tirare sulla finestra di installazione. Ora, impostare la frequenza di 100 Hz. tenere tutti gli altri parametri invariati.
    12. Ripetere i passaggi 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Fare clic sul diagramma. Osservare la curva di G', G " contro il ceppo di oscillazione. Trovare i punti di deflessione di G' per entrambe le frequenze (0,01 Hz e 100 Hz). Trovare i ceppi di oscillazione corrispondente per entrambi i punti di flessione.
    14. Scegliere il più piccolo ceppo di oscillazione e utilizzare 1/10 di questo ceppo per tutti i test di oscillazione condotti in seguito.
      Nota: L'insorgenza di G' deflessione è considerato l'ultimo deformazione elastica lineare (moduli) che non deve essere superata nei test di follow-up. Il rapporto 1/10 viene solitamente utilizzato in ingegneria per motivi di sicurezza. Questo calcolato ceppo è indicato come g.C.
    15. Dopo il test è fatto, fare clic su tabella, copiare tutti i dati e incollarlo in un file di testo.
  5. Condurre una spazzata di temperatura.
    1. Fare clic su miei apps e selezionare il modello rampa di temperatura, shear oscillatorio: gelificazione.
    2. Denominare il progetto.
    3. Fare clic sul passaggio di misurazione del flusso di lavoro. Scegliere la variabile temperatura, tirare verso l'alto la finestra setup e impostare la temperatura iniziale e finale a 37 ° C e 25 ° C, rispettivamente.
    4. Nella finestra di pull-up, è possibile impostare ceppo di oscillazione allo 0,1%, frequenza di oscillazione di 1Hz. Quindi impostare il numero di punti dati per essere 61. Impostare la frequenza di raccolta di dati a 1 punto/min clic calcolatrice e impostato 0,2 ° C densità di punto/punto.
      Nota: Questo permetterà la temperatura a cambiare a una velocità di 0,2 ° C/min.
    5. Caricare l'esempio sulla piattaforma reometro ed eseguire la prova eseguendo i passaggi 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Fare clic sul diagramma, osservare il G', G " contro la temperatura. Trovare il punto di crossover di G' e G ". Trovare la temperatura al punto di crossover.
      Nota: Questa è la temperatura di transizione sol/gel del precursore idrogel.
    7. Ripetere il passaggio 2.4.15.
  6. Condurre una spazzata di tempo isotermica.
    1. Fare clic su miei apps e trovare e scegliere il modello isotermico tempo-temperatura di prova. Fare clic sul passaggio di misurazione del flusso di lavoro e quindi fare clic sulla variabile ceppo di oscillazione, tirare verso l'alto la finestra di setup, impostare il ceppo di oscillazione allo 0,1% e impostare la frequenza di oscillazione di 1 Hz. Nella finestra di pull-up, è possibile impostare il numero di punti dati a 120. Impostare la frequenza di raccolta di dati a 1 punto/min.
      Nota: Il valore di questo ceppo si basa sui risultati dallo sweep di ampiezza.
    2. Fare clic sul pulsante Aggiungi per aggiungere la variabile di temperatura . Fare clic su variabile temperatura nella finestra centrale e impostarlo a 25 ° C.
      1. Fare clic destro il passo dispositivo spostare al punto di misurazione del flusso di lavoro, fare clic su Elimina. Scegliere il che dispositivo impostata valoredi passo, deselezionare la casella di attendere fino a quando viene raggiunto il valoree impostare il valore di 25 ° C. Fare clic su immagine, tittle, bottoni al fondo dello schermo, deselezionare la casella continua. Quindi fare clic sul passaggio avviare, nome del progetto e salvarlo.
    3. Caricare l'esempio sulla piattaforma reometro e avviare il test eseguendo i passaggi 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Osservare il G', G " contro il tempo. Trovare il punto di crossover di G' e G ". Trovare il tempo presso il punto di crossover. Dopo il test è fatto, fare clic su tabella, copiare tutti i dati e incollarlo in un file di testo.
      Nota: Questo è il tempo di transizione sol/gel del precursore idrogel a 25 ° C.
  7. Misurare la resistenza allo snervamento ai vari tempi di gelificazione.
    1. Fare clic su miei apps e trovare e scegliere il modello stress resa e flusso, Gel-like. Denominare il progetto. Scegliere il passo per avviare il flusso di lavoro. Fare clic su Inserisci nel menu in alto e, nel menu a discesa, selezionare l'ora. Tirare sulla finestra di installazione e impostare il tempo di attesa per essere 20 min.
      Nota: Questo aggiungerà un passaggio di attesa prima delle prove.
    2. Fare clic su Start, quindi fare clic su Inserisci nuovamente e, nel menu a discesa, selezionare il dispositivo. Tirare verso l'alto la finestra setup, ha scelto di temperatura e impostarlo a 25 ° C. Deselezionare la casella di attendere fino a quando viene raggiunto il valore.
    3. Fare clic sul passaggio di misurazione del flusso di lavoro, selezionare la variabile Shear stress, tirare verso l'alto la finestra setup e impostato la sollecitazione di taglio iniziale e finale 0 e 10.000 Pa, rispettivamente.  Fare clic su Calcolatrice, impostare la densità di punti a 0,2 punto/PA. Nella scheda dati punti a sinistra, impostare 1 punto al secondo.
      Nota: questo si tradurrà in un tasso di stress in rampa di 5 Pa/s.
    4. Fare clic sulla scheda evento controllo nella parte inferiore della finestra di pull-up e impostare il criterio di arresto: interrompere la misurazione se il taglio tasso > 100 s-1.
      Nota: Questo si fermerà automaticamente la misurazione se il materiale viene prodotto.
    5. Caricare l'esempio sulla piattaforma reometro e avviare il test eseguendo i passaggi 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Fare clic sul diagramma. Osservare la curva di tensioni. Trovare il punto di deflessione dello sforzo e relativo sforzo corrispondente. Ripetere i passaggi 2.7.2 - 2.7.6, ma modificare il tempo di attesa di 30, 40 e 50 min per ogni replica; Questo comporterà la resistenza allo snervamento gelificante in momenti diversi.
      Nota: Questo stress è considerato come il limite di snervamento apparente.
      Nota: software click possono differire dai modelli reometro e versioni del software. Si consiglia ai lettori di prendere a riferimento i parametri di prova forniamo, mentre fare riferimento al manuale del reometro/software specifico nell'uso pratico.
       

3. ponteggio Design, carichi di cella idrogel e modelli di stampa 3D

  1. Progettazione di ponteggio
    1. Disegnare un modello di elica-come su carta.
      Nota: Il modello ad elica è progettato ha basato sulle seguenti considerazioni: (a) si simula lo scenario di in vivo dove le cellule tumorali sono circondate da CAFs; (b) riduce al minimo la concentrazione di stress tramite l'utilizzo di geometrie circolari; (c) è flessibile in modo che altri settori possono essere aggiunti nel modello in futuro senza modificare le geometrie esistenti; e (d) è piatto nella sua scala verticale per facilitare la diffusione dei nutrienti.
    2. Sia il centro dell'elica l'origine e utilizzare i simboli R0e R1 R2 per rappresentare il massimo raggio del cerchio interno, settori medie e settori esterni, rispettivamente. Utilizzare i simboli m e n per rappresentare il numero di interni archi e raggi all'interno dell'area di settore, rispettivamente.
    3. Calcolare le coordinate di ciascun nodo sul modello ad elica e riportarli nelle espressioni simboliche di R0, R1, R2, me n.
    4. Avviare un programma script, impostare R0, R1, R2, me n come variabili e immettere l'espressione simbolica di ciascun nodo chiave.
      Nota: Fare riferimento alla Tabella materiali per qualsiasi informazioni sul software.
    5. Organizzare un percorso che collega i nodi e assegnare una cartuccia per il cerchio interno, i settori centrali e i settori esterni. Impostare lo spessore di strato per essere 150 µm e il numero di strati per essere 4.
    6. Lasciate che il programma di output un file di testo in formato G-code che è riconoscibile per il bioprinter.
    7. Impostare R0 = 3,85, R1 = 6,85, R2 = 8.65, m = 2 e n = 5. Eseguire lo script e recuperare il file G-code generato. Copiare e incollare il file alla cartella dedicata di G-codice di bioprinter.
    8. Accendere il bioprinter e il relativo software di controllo. Inizializzare la stampante. Aprire lo script di G-codice appena creato e impostare tutte le pressioni a zero. Tornare al software di controllo, fare clic sulla scheda Generatore di muratoree quindi fare clic sul pulsante Esegui nell'angolo in basso a destra. Osservare il movimento percorso della stampante.
      Nota: Questo metterà alla prova la precisione del G-codice generato. Fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni relazionati al bioprinter.
    9. Questo passaggio è facoltativo. Costruire un modello 3D dimostrativo sulla base dei parametri via software (CAD) computer-aided design di cui sopra.
      Nota: Fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni sul software vendor.
  2. Fanno un precursore di idrogel A3G7 carichi di cella
    Nota: La procedura in questa sezione deve essere eseguita in condizioni sterili. Mantenere il bioprinter all'interno di un BSC.
    1. Sterilizzare il bioprinter spruzzando abbondantemente etanolo al 70% ed esporla ai raggi UV durante la notte.
    2. Prendete una siringa del precursore idrogel (a 4 ° C) e scaldarlo a bagnomaria a 37 ° C per 1 h.
    3. Prendere il T-matraccio con cellule (Vedi punto 1.3) dal CO2 incubator e posizionarlo all'interno di un BSC. Scartare il terreno di coltura e sciacquare le cellule con DPBS due volte. Aggiungere una soluzione di tripsina-EDTA riscaldato (3,0 mL) e incubare le cellule a 37 ° C per un minimo di 6 Inactivate la tripsina con uno stesso volume di FBS. Contare le celle usando analisi trypan blu.
    4. Prendere la siringa del precursore idrogel dal bagnomaria, pulirlo e sterilizzarlo con etanolo al 70%. Inserire la siringa in BSC.
    5. Estrudere circa 3 mL di idrogel precursore in una cartuccia di stampa di 10 mL. Miscelare il precursore con cellule MDA-MB-231-GFP a 1 x 106 cellule/mL pipettando lentamente, evitando la produzione di bolle. Coprire la cartuccia con la fine sterile e tappi superiori e sigillare con la pellicola di paraffina. E centrifugare a 834 x g per 1 min eliminare eventuali bolle di gas prodotte.
    6. Ripetere i passaggi 3.2.3 - 3.2.5 per il precursore di cella-carichi di IMR-90-mCherry e il precursore senza cellula.
    7. Sterilizzare tutti i 3 cartucce con etanolo al 70% e poi caricarli nelle cavità della bioprinter. Nel software di controllo della stampante, impostare la temperatura di cartuccia a 25 ° C. Attendere 35 min per consentire il precursore raggiungere condizioni stampabile.
      Nota: Questa volta non influisce la vitalità delle cellule incorporati nell'idrogel.
  3. Stampa di modelli 3D
    1. Nel software di controllo della stampante, espandere la scheda di testa utensile nel software di controllo della stampante, fare clic su 1 cartuccia presso l'interfaccia grafica sul lato sinistro e quindi fare clic su pulsante di misura breve per misurare la posizione della punta dell'ugello. Ripetere questa operazione per le altre 2 cartucce.
    2. Inserire una micropiastra chiaro polistirolo, aprire il file G-code e modificare la pressione a 200 kPa per tutte le cartucce. Tornare al software di controllo, fare clic sulla scheda Generatore ponteggiatore, selezionare un punto per avviare la stampa e quindi fare clic sul pulsante Esegui nell'angolo in basso a destra. Ripetere questo passaggio per ottenere 3 ulteriori repliche.
    3. Dopo la stampa di tutte le repliche dei modelli dell'elica, aggiungere un 100 mM CaCl2 soluzione a legame incrociato i modelli per 1 min e risciacquare 2x con DPBS per rimuovere l'eccesso di ioni Ca ++ .
    4. Trasferire con cautela i modelli su un piatto di 6 pozzetti rivestite su agarosio utilizzando una spatola. Aggiungere 5 mL di terreno DMEM in ciascun pozzetto. Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
      Nota: assicurarsi che i modelli sono galleggianti nei pozzetti.
    5. Sostituire il mezzo di coltura cellulare con medium fresco ogni 3 giorni, la cultura e per 30 giorni in totale.

4. vitalità e sferoide formazione esperimenti sui dischi di idrogel.

  1. Preparazione del disco di idrogel
    1. Ripetere i passaggi 3.2.1 - 3.2.6.
      Nota: È possibile sostituire la cartuccia con un piccolo contenitore sterile.
    2. Utilizzare una siringa sterile graduata 1 mL e tagliare l'ugello per creare un grande buco nella siringa (il foro ha lo stesso diametro come il resto del tubo siringa). Pulire con etanolo al 70% e lasciarlo fino a quando è asciutto.
      Nota: Eseguire questa operazione in un BSC sterile.
    3. Usare un coperchio piastra, aggiungere 100 mM CaCl2 fino a quando la superficie è ricoperta; poi, prendere la cella-carichi idrogel per riempire la siringa; estrudere 100 µ l utilizzando l'impiccagione metodo drop. Lasciare l'idrogel per 1 min e risciacquare con DPBS eccessivo. Trasferire i dischi di idrogel su un piatto di 6 pozzetti di agarosio-rivestito, aggiungere 5 mL di DMEM basale e li Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per fino a 30 giorni. Aggiornare il mezzo ogni 3 giorni.
  2. Vitalità cellulare e sferoide
    1. Utilizzare un test MTS per determinare l'attuabilità delle cellule. Lavare ogni disco con DPBS e tagliarlo in 4 parti con una lama sterile fine. Raccogliere le parti del disco intero e trasferirli su una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 μL di DMEM plus 20 μL di reagente MTS ad ogni pozzetto e incubare la miscela a 37 ° C per 2 h.
    2. Dopo la reazione di MTS, recuperare il supernatante e trasferirlo in una piastra a 96 pozzetti pulita. Misurare l'assorbanza dei campioni a 490 nm.
  3. Formazione della sferoide
    1. Estrarre il modello incubato a elica o disco dall'incubatrice ai giorni 0, 7, 15, 21 e 30 della cultura e trasferirli su un piatto pulito 6-pozzetti.
    2. Uso un disco rotante confocale invertito microscopio per visualizzare sferoidi e acquisire le immagini utilizzando più posizioni e z-stack. Immagine ogni elica, o modello di disco, lungo il suo diametro orizzontale da sinistra a destra con un gap di 500 µm e acquisire un z-stack dal basso per il piano focale superiore a ogni posizione orizzontale.
      Nota: Fare riferimento alla Tabella materiali per le informazioni sul fornitore.
    3. Ricostruire l'immagine utilizzando uno strumento aritmetico di massima dello stack, fornito dal programma ImageJ, per creare le immagini 2D utilizzate per un'analisi di sferoide.

5. microscopia elettronica (SEM)

  1. Preparare l'idrogel di alginato/gelatina come descritto al punto 1.2.
    Nota: Condizioni di sterilità non sono necessari.
    Attenzione: Paraformaldeide e azoto liquido sono pericolosi e devono essere maneggiati con cura.
  2. Mettere 1 mL di idrogel in un mortaio, aggiungere azoto liquido e macinare con un pestello. Continuare ad aggiungere azoto liquido per evitare l'idrogel da scongelare. Trasferire la polvere in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, sigillarlo e conservare a-80 ° C per 2 h. liofilizzare il campione per 24 h.
  3. Per l'imaging della sferoide, lavare l'idrogel delicatamente con DPBS 2 x fissare le cellule mediante immersione in paraformaldeide al 4% per 30 min a 37 ° C e poi sciacquare con DPBS e congelarli con azoto liquido. Infine, liofilizzare il campione per 24 h.
  4. Analizzare la struttura di idrogel/sferoide e morfologia con un microscopio elettronico a scansione (SEM) a 25.0 kV, sotto 70 Pa (pressione dell'alloggiamento) con un ingrandimento di 40x fino a 5, 000 X.

Risultati

Lo sweep di temperatura Mostra una netta differenza del precursore A3G7 a 25 ° C e 37 ° C. Il precursore è liquido a 37 ° C ed ha una viscosità complessa di 1938.1 ± 84,0 mPa x s, che viene convalidato da un G maggiore "sopra G'. Come la temperatura diminuisce, il precursore subisce gelificazione fisica dall'impigliamento fisica spontanea delle molecole gelatina in un tri-elica formazione29,30. Entrambi i G' e G "aumentare e...

Discussione

Cella-carichi strutture possono essere compromessa in caso di contaminazione (biologico o chimico) in qualsiasi punto nel processo. Di solito, contaminazione biologica è visto dopo due o tre giorni di cultura come un colore cambiare in terreni di coltura o la struttura di bioprinted. Di conseguenza, la sterilizzazione (disinfezione chimica e fisica) è un passo fondamentale per tutti i processi di cella. Degno di nota, gelatina di sterilizzazione in autoclave cambia le proprietà gelificanti, che ha reso più lento del ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Tao Jiang grazie la Cina Scholarship Council (201403170354) e McGill Engineering Award dottorato (90025) per il loro finanziamento di borse di studio. Jose G. Munguia-Lopez grazie CONACYT (250279, 290936 e 291168) e FRQNT (258421) per il loro finanziamento di borse di studio. Salvador Flores-Torres grazie CONACYT per loro borsa di studio (751540) di finanziamento. Joseph M. Kinsella grazie della National Science ed Engineering Research Council, la Fondazione canadese per l'innovazione, Townshend-Lamarre Family Foundation e McGill University per il loro finanziamento. Vorremmo ringraziare Allen Ehrlicher per averci permesso di utilizzare il suo reometro, Dan Nicolau per averci permesso di usare il suo microscopio confocale e Morag Park noi dell'accesso alle linee cellulari fluorescente contrassegnati.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium alginateFMC BioPolymerCAS-No: 9005-38-3Protanal LF 10/60 FT
GelatinSigma-AldrichG9391Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X)GibcoLS141901361×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplateCorning N/AStirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubesCorning352098Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
CentrifugeGMIN/ASorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrousSigma-AldrichC1016
MilliQ waterMilliporeN/A
Millipore 0.22 µm filtersMilliporeSLGS033SBMillex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302Anton PaarN/A
Rheometer measuring tool CP25Anton Paar79038Conical plate geometry for rheometer
RheoCompassAnton PaarN/ASoftware controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscopeHitachiN/ASEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pureAcros Organics416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM)Gibco11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilizedSigmaA5955
Fetal bovine serumWisent Bioproducts080-150
Cell culture T-75 flasksSigma-AldrichCLS43064175 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1GeSiMN/A
GeSim softwareGeSiMN/ASoftware controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resistEFD Nordson7012126
End capEFD Nordson7014472
Tip capEFD Nordson7014469
Piston EFD Nordson7012182
Stainless nozzle G25EFD Nordson7018345
Water bathVWRN/A
AgaroseSigma-AldrichA9539Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates Corning3516TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscopeOlympus Life ScienceN/AOlympus IX83
MTS assay kitPromegaG3582CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kitMolecular Probes,ThermoFisher ScientificL3224
Trypsin 0.25/EDTA 1XGibco25200-072
Corning 96-well plateCorning3595Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave TuttnauerHeidolph BrinkmannN/AHeidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blueInvitrogen T102820.4% solution
EthanolCommercial AlcoholsP016EA95Greenfield Speciality Alcohols
CO2 IncubatorPanasonicN/AMCO 19AIC-PA
Lyophilizer SP ScientificN/AVirtis Sentry 2.0
SolidWorksDassault SystemsN/AA CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLABThe MathWorksN/AA programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

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