JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы разработали гетерогенных груди Рак модель, состоящая из увековечен опухоли и фибробластов клетки, встроенный в bioprintable bioink Альгинатные/желатина. Эта модель резюмирует микроокружения опухоли в естественных условиях и облегчает формирование многоклеточного опухоли сфероидов, давая понять механизмы вождения tumorigenesis.

Аннотация

Сотовые, биохимические и биофизические неоднородность микроокружения опухоли родной не сведены воедино растущего увековечен рак клеточных линий, с помощью обычных двухмерных (2D) клеточной культуры. Эти проблемы могут быть преодолены с помощью методов подложке для построения моделей гетерогенных трехмерные (3D) опухоли, whereby внедряются различные типы клеток. Альгинат и желатин являются двумя наиболее распространенными биоматериалов, занятых в подложке из-за их биосовместимости, biomimicry и механических свойств. Путем объединения двух полимеров, мы достигли bioprintable композитный гидрогеля с сходства в микроскопических архитектуру родной опухоли стромы. Мы изучили печатными свойствами композиционных гидрогеля через реологии и получено оптимальное окно печати. Клеток рака молочной железы фибробластов встроенных в гидрогелей и были напечатаны для формирования 3D-модель имитирует микроокружения в естественных условиях . Bioprinted гетерогенных модель достигает высокой жизнеспособности для долгосрочного клеточной культуры (> 30 дней) и способствует самостоятельной сборки из клеток рака молочной железы в многоклеточных опухоли сфероидов (MCTS). Мы наблюдали, миграции и взаимодействия клеток рака связанные фибробластов (CAFs) с MCTS в этой модели. С помощью bioprinted клетки культуры платформ как сопредседатель культуры системы, он предлагает уникальный инструмент для изучения зависимости tumorigenesis состав стромы. Эта техника имеет высокой пропускной способностью, низкая стоимость и высокая воспроизводимость, и она может также предоставлять альтернативную модель для обычных клетки однослойная культур и животных опухоли модели для изучения биологии рака.

Введение

Хотя 2D клеточной культуры широко используется в исследовании рака, существуют ограничения, как клетки выращивают в формате монослой с единообразные концентрации питательных веществ и кислорода. Эти культуры не хватает важных клеток и клеток матрица взаимодействия в родной опухоли микроокружения (ТМЕ). Следовательно эти модели плохо пилки физиологических условиях, что приводит к аберрантных клеток поведения, включая неестественным морфологии, нерегулярные рецептор Организации, поляризацию мембраны и аномальный ген выражение, среди других условия1,2,3,4. С другой стороны 3D клеточной культуры, где клетки раскрываются в объемном пространстве, как агрегатов, сфероидов или organoids, предлагает альтернативный метод для создания более точной в vitro условий для изучения фундаментальных клеточной биологии и физиологии. Модели 3D клетки культуры может также стимулировать клетки ECM взаимодействий, которые являются критическим физиологические характеристики родной TME в пробирке1,4,5. Новые 3D подложке технология обеспечивает возможности для построения моделей, которые имитируют гетерогенных TME.

Является производным от быстрое прототипирование 3D подложке и позволяет изготовление 3D микроструктур, которые способны подражая некоторых сложностей живых тканей образцы6,7. Текущий подложке методы включают струйный, экструзии и при содействии лазерной печати8. Среди них метод экструзии позволяет неоднородность управляться в пределах печатной матрицы путем точного позиционирования различных видов материалов в разных местах первоначального. Таким образом он является наилучшим подходом для изготовления гетерогенных в vitro модели с участием нескольких типов клеток или матрицы. Экструзии подложке успешно используется для построения аурикулярных формы подмостей9, сосудистых структур10,11,12и кожные ткани13, что приводит к высокой печати верности и ячейки жизнеспособности. Технология также имеется универсальный материал выбора, возможность хранение материалов с клетками, внедренные с известным плотность и высокую воспроизводимость14,,1516,17 . Натуральные и синтетические гидрогели часто используются как bioinks для 3D подложке из-за их биосовместимости, биологическую и их гидрофильные сетей, которые могут быть спроектированы для структурно напоминают ECM7,18 ,19,-20,-21,-22,-23. Гидрогели также выгодно, так как они могут включать клей сайты для клетки, структурные элементы, проницаемость для питательных веществ и газов, и соответствующие механические свойства для поощрения развития24ячейки. Например коллагеновая гидрогели предлагают Интегрин узлами крепления клетки можно использовать для подключения к матрице. Желатин, денатурированные коллаген, сохраняет аналогичные сайты адгезии клеток. В противоположность этому альгинат биоинертный но обеспечивает механическую целостность путем формирования сшивки с ионов двухвалентной25,26,27,28.

В этой работе мы разработали композитный гидрогеля как bioink, состоящая из альгината и желатин, с сходства в микроскопических архитектуру родной опухоли стромы. Груди раковых клеток и фибробластов были внедрены в гидрогелей и напечатаны через bioprinter на основе экструзии для создания 3D-модель, которая имитирует микроокружения в естественных условиях . Инженерии 3D окружающей среды позволяет раковые клетки для формирования многоклеточного опухоли сфероидов (MCTS) с высокой жизнеспособности для длительных периодов клеточной культуры (> 30 дней). Этот протокол демонстрирует методики синтеза композиционных гидрогели, характеризующие микроструктуру и печатными свойствами, подложке сотовой разнородных моделей, материалов и наблюдения за формирование MCTS. Эти методы могут быть применены к другим bioinks в экструзии подложке, а также различных конструкций, моделей разнородных тканей с потенциального применения наркотиков скрининг, клетки миграции анализов и исследований, которые сосредоточены на основных клеток физиологические функции.

протокол

1. Подготовка материалов, гидрогеля и клетки культуры материалов

  1. Подготовка материалов и решения
    1. Вымойте и высушите 250 мл и 100 мл стеклянные стаканы, магнитные мешалки, шпатели, 10 мл картриджи, цилиндрические насадки 25 G (длиной 0,5 дюйма) и внутренний диаметр 250 мкм. Стерилизация автоклавированием материалы их на 121 ° C/15 мин/1 атм храните материалы в стерильных условиях до использования.
      Примечание: Обратитесь к Таблице материалы для поставщиков информации.
    2. Весят 3 g альгината (3% w/v) и 7 г желатина (7% w/v) (обозначается как A3G7 ниже).
    3. Стерилизуйте следующие пункты под УФ света для по крайней мере 4 h: альгината и желатин порошков, парафин пленки, алюминиевой фольги штук 5 см2и 1 мл и 5 мл-шприцы. Стерилизовать заглушки, кончик шапки и поршни, погружая их в 70% этанола для по крайней мере 4 h и мыть их 2 x стерилизованные ультра-чистой водой.
      Примечание: Обратитесь к Таблице материалы для поставщиков информации.
    4. Распустить 4 g агарозы ультра-чистой водой и стерилизации в автоклавах.
      Примечание: Агарозы полностью распущены после процесса автоклавированием.
    5. Приготовляют раствор 100 мм безводного хлористого кальция (2CaCl) в стерилизованные ультра-чистой воды и стерильным фильтром (с размером пор 0,22 мкм) перед использованием.
    6. Для агарозы покрытием 6-ну пластин расплава стерильных агарозы в микроволновую печь для получения жидкого раствора; Затем под кабинет биобезопасности (BSC) и с использованием 1 мл микропипеткой, добавить 2 мл на колодец и размешать осторожно, чтобы создать единый слой в нижней части скважины. Оставьте остыть и печатью хорошо с парафином фильм. Держите его при комнатной температуре (RT) до использования.
  2. Подготовка A3G7 гидрогеля прекурсоров
    1. Смешайте 3 g альгината и 7 г желатина порошков в 250 мл стакан в BSC. Добавление магнитную мешалку и 100 мл DPBS. Уплотнение стакан с стерильных парафин пленки и алюминиевой фольги (5 см2) чтобы избежать загрязнения.
    2. Растворите порошки под постоянным агитации в магнитных/горячая плита с 600 об/мин при 60 ° C для 1 h и в РТ за дополнительную 2 ч.
    3. Подогрева материала при 37 ° C, до тех пор, пока гель проходит фазовый переход в жидком состоянии (для 100 мл раствора запасов гель, это занимает около 45 минут). Передача решения в стерильных 50 мл конические пробирок, запечатать их и центрифуги трубы в 834 x g 5 мин для устранения любых газовых пузырей из материала.
    4. Аспирационная гидрогеля прекурсоров в 10 мл-шприцы. Уплотнение шприцов с шапки и парафин фильм. Храните при 4 ° C до использования.
  3. Культура клеток
    Примечание: В этом разделе должны выполняться в стерильных условиях.
    1. Подготовить базальной среде DMEM следующим (1 Л): в BSC, смешать 100 мл плода бычьим сывороточным (ФБС) плюс 10 мл раствора антибиотик/противогрибковое (100 x Стабилизированный раствор) в свежих стерильный контейнер. Добавить DMEM среднего для регулировки смесь до 1000 мл. Печать контейнер и держать его на 4 ° C.
    2. В ранее утепленные водяной бане (37 ° C) размораживание 1 флакон MDA-MB-231-GFP (линия клетки рака молочной железы человека GFP-меченых, ядерной локализации) и 1 флакон IMR-90-mCherry (рак связанные фибробластов клеточных линий mCherry маркировкой, с цитоплазматических локализации ) клетки от хранения жидкого азота, перемещая их нежно в воду. Как клеточных линий, так и плазмид GFP и mCherry маркировки, коммерчески доступны.
    3. Перевести 160 мкл/хорошо клеток раствора (3 х 106 клеток/мл) в 6-ну тарелку и добавьте 5 мл базальной DMEM среды утепленные (37 ° C). Инкубируйте пластину на 37 °C/5% CO2 для 24-48 ч до 80% слияния ячеек.
    4. После того, как клетки достичь слияния, отказаться от среднего и промойте клетки дважды с DPBS; инкубировать клетки с 500 мкл трипсина ЭДТА решения/скважины (0,25%, 1 x, ранее нагревается при 37 ° C) при 37 ° C за 6 мин. Затем, деактивируют трипсина, добавив 500 мкл FBS, восстановить клетки решение и перенести его на T-75 колбы. Инкубируйте их снова на 37 °C/5% CO2 клетки до 80% слияния.
      Примечание: Объем раствор трипсина ЭДТА может варьироваться в зависимости от роста клеток судна.
    5. Повторите предыдущий шаг, чтобы работать с клетки на проход 3-4, как это, когда клетки имеют больше метаболической активности и стабильности.
    6. Подсчет количества ячеек с помощью Трипановый синий пробирного (0,4%) для определения начальной концентрации клеток, чтобы смешивать с гидрогеля.

2. измерения реологических свойств гидрогели

  1. Подготовьте альгината/желатин гидрогеля прекурсоров, как описано в шаге 1.2.
    Примечание: Стерильные условия не являются обязательными для образцов, созданных для механических испытаний и анализа. Все реологических тесты выполняются в трех экземплярах.
  2. Возьмите шприц гидрогеля прекурсоров и разогреть на водяной бане 37 ° C за 1 ч.
  3. Включите Реометр и инициализировать систему согласно следующие шаги.
    1. Включите компрессор подключен к Реометр и пусть воздушный компрессор, запустить на 30 мин переключатель на поле контроля температуры для Реометр, включите Реометр сам и на компьютере подключен к Реометр.
    2. Откройте программное обеспечение Реометр, на панели управления нажмите кнопку инициализировать и пусть закончить процесс инициализации. Установите температуру платформы до 37 ° C на панели управления.
    3. Нажмите на вкладку измерения набор перейдите к Запустите функцию службы, в раскрывающемся меню выберите настройки драйвера инерции и Начало перестройки во всплывающем окне.
    4. Установите измерительный инструмент в Реометр параллель. Все эксперименты, проведенные здесь использовать тарелку диаметром 25 мм с 1 мм зазор между пластинами.
    5. На панели управления нажмите кнопку задать нулевой разрыв и ждать процедуры для завершения. Обратите внимание на обычных сил в ходе этого процесса.
      Примечание: После этой процедуры, нормальное усилие должно быть 0.
    6. Перейдите на вкладку измерения набор перейдите к Запустите функцию службы, выберите Регулировка верхней измерительной системы инерциии нажмите кнопку начать перестройки во всплывающем окне. После этого, нажмите треугольную кнопку на панели управления, чтобы позволить измерительный инструмент для перемещения вверх.
  4. Проведение размах амплитуды.
    1. Нажмите кнопку Пуск, а затем нажмите кнопку Вставить в верхнем меню, выберите ждать из раскрывающегося меню. Потяните вверх окна установки и задать время ожидания до 2 ч.
      Примечание: Это будет добавить шаг ожидания перед проведением испытаний.
    2. Нажмите кнопку Пуск, затем снова нажмите кнопку Вставить и из раскрывающегося меню, выберите устройство. Потяните вверх окна настройки, выберите температуруи задайте его равным 25 ° C. Снимите флажок ждать, пока не будет достигнуто значение.
    3. Щелкните шаг измерения, затем щелкните переменную колебание напряжения, потяните вверх окна установки, настроить профиль для рамп логарифми измените значение на 0,001% и 100% первоначальной деформации и окончательной деформации, соответственно. Установите частоту на 0,01 Гц.
    4. Нажмите кнопку Добавить для добавления переменной температуры . Щелкните переменной температуры и задайте его равным 25 ° C. В окне pull-up разверните Калькулятор, равным 10 очков/десятилетия плотность точек .
    5. Возьмите шприц из водяной бани и выдавить около 0,5 мл прекурсоров на платформу Реометр.
    6. Нажмите кнопку вниз на панели управления кнопку треугольник. Ждать для измерительного инструмента, чтобы двигаться вниз до обрезки позиции.
    7. Лопаточкой обрезать избыток прекурсоров, которые бежали на краю измерительного инструмента и отбросить лишние материал.
    8. Пипетка минерального масла на краю измерительный инструмент и подождите, пока полностью сальники границы.
    9. На панели управления нажмите кнопку продолжить . Нажмите кнопку Пуск (зеленый треугольник), а затем нажав кнопку продолжить на экране внизу.
    10. Когда тестирование делается, отпустите измерительный инструмент и затем нажмите кнопку вверх на панели управления кнопку треугольник. Удалите средство измерения и очистить его с 70% этиловом спирте. Очистите платформы с 70% этиловом спирте.
    11. В текущем проекте щелкните шаг измерения и потяните вверх окна установки. Теперь набор частоты до 100 Гц. Держите все другие параметры без изменений.
    12. Повторите шаги 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Щелкните диаграмму. Наблюдать за кривой G', G» против колебаний напряжения. Найти прогиб точки G' для обеих частотах (0,01 Гц и 100 Гц). Найти соответствующие колебания штаммов для обеих точек прогиб.
    14. Выберите меньше колебаний напряжения и использовать 1/10 этого штамма для всех колебаний тестов, проведенных после этого.
      Примечание: Начала G' отклонение считается конечной линейной упругой деформации (Условного), который не должен быть превышен в последующих тестах. Соотношение 1/10 обычно используется в машиностроении по соображениям безопасности. Это рассчитано, что штамм обозначается как gC.
    15. После того, как тест будет сделано, нажмите кнопку Таблица, скопировать все данные и вставьте его в текстовый файл.
  5. Провести температуры.
    1. Нажмите мои apps и выберите шаблон температура пандуса, колебательная сдвига: гелеобразования.
    2. Имя проекта.
    3. Щелкните шаг измерения в рабочем процессе. Затем щелкните переменную температуру, потяните вверх окна установки и начальной и конечной температуры составляет 37 ° C и 25 ° C, соответственно.
    4. В окне pull-up установите колебание напряжения 0,1%, частота колебаний до 1 Гц. Затем установите количество точек данных в 61. Установите частоту сбора данных на 1 очко/мин щелкните Калькулятор и задать точку плотности до 0,2 ° C/точки.
      Примечание: Это позволит температуру изменить в размере 0,2 ° C/мин.
    5. Загрузить образец на платформе Реометр и выполнить тест, выполните шаги 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Нажмите кнопку Диаграмма, наблюдать G', G» против температуры. Найти точку G кроссовер ' и G». Найти температуру в точке кроссовер.
      Примечание: Это температура перехода золь/гель гидрогеля прекурсоров.
    7. Повторите шаг 2.4.15.
  6. Проведение изотермической время развертки.
    1. Нажмите мои apps и найдите и выберите шаблон, изотермические время температура теста. Щелкните шаг измерения в рабочем процессе и затем щелкните переменную колебания напряжения, потяните вверх окна установки, равным 0,1% колебаний напряжения и частоты колебаний равным 1 Гц. В окне pull-up установите количество точек данных до 120. Задайте частоту сбора данных на 1 очко/мин.
      Примечание: Значение этого штамма основан на результатах размах амплитуды.
    2. Нажмите кнопку Добавить для добавления переменной температуры . Нажмите кнопку переменная температура в среднем окне и установите его в 25 ° C.
      1. Щелкните правой кнопкой мыши устройство перейти к точка измерения шаг в рабочем процессе, нажмите кнопку Удалить. Нажмите кнопку шаг, устройство установлено значение, снимите флажок ждать, пока не будет достигнуто значениеи установите значение равным 25 ° C. Щелкните Рисунок, капельку, кнопки внизу экрана, снимите флажок продолжить. Затем нажмите кнопку шаг, начать, имя проекта и сохраните его.
    3. Загрузить образец на платформу Реометр и начать тест, выполните шаги 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Наблюдать за G', G» против времени. Найти точку G кроссовер ' и G». Найти время в точке кроссовер. После того, как тест будет сделано, нажмите кнопку Таблица, скопировать все данные и вставьте его в текстовый файл.
      Примечание: Это время перехода золь/гель гидрогеля прекурсора при 25 ° C.
  7. Мера текучести гелеобразующего неоднократно.
    1. Нажмите мои apps и найти шаблон урожайность и потока стресс, гель как. Имя проекта. Нажмите кнопку шаг, начать в рабочем процессе. В верхнем меню нажмите кнопку Вставить и в раскрывающемся меню выберите подождать. Потяните вверх окна установки и задать время ожидания для 20 мин.
      Примечание: Это будет добавить шаг ожидания перед проведением испытаний.
    2. Нажмите кнопку Начало, затем снова нажмите кнопку Вставить и в раскрывающемся меню, выберите устройство. Потяните вверх окна установки, выбрал температуры и установите его в 25 ° C. Снимите флажок ждать, пока не будет достигнуто значение.
    3. Щелкните шаг измерения в рабочем процессе, выберите переменную касательное напряжение, потяните вверх окна установки и задать начальное и конечное касательное напряжение 0 и 10 000 Па, соответственно.  Щелкните Калькулятор, задать плотность точек 0.2 точки/Pa. На вкладке точки данных на левой стороне задайте 1 очко в секунду.
      Примечание: это приведет к стресс наращивает темпы 5 Pa/сек.
    4. Щелкните вкладку событие элемента управления в нижней части окна подтягивающий и задайте критерий остановки: остановить измерение Если сдвига > 100 s-1.
      Примечание: Это будет автоматически остановить измерение Если дали материал.
    5. Загрузить образец на платформу Реометр и начать тест, выполните шаги 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Щелкните диаграмму. Наблюдать за кривой деформации стресс. Найти точку отклонения напряжения и его соответствующий стресса. Повторите шаги 2.7.2 - 2.7.6, но изменить время ожидания на 30, 40 и 50 минут для каждой репликации; Это приведет к текучести в разные времена гелеобразующего.
      Примечание: Этот стресс рассматривается как явное текучести.
      Примечание: программное обеспечение кликов может отличаться Реометр моделей и версий программного обеспечения. Мы рекомендуем читателям принять ссылку параметров тестирования, мы предоставляем, время, обратитесь к руководству конкретного Реометр/программного обеспечения в практическом использовании.
       

3. эшафот дизайн, клетки Ладена гидрогеля и модели 3D печати

  1. Эшафот дизайн
    1. Нарисуйте модель пропеллер как на бумаге.
      Примечание: Пропеллер как модель разработана на основе следующих соображений: она имитирует сценарий в естественных условиях , где раковые клетки находятся в окружении CAFs; (b) он уменьшает концентрацию стресса через использование круговой геометрии; (c) он является гибким, так что больше секторов может быть добавлена в модель в будущем без изменения существующей геометрии; и (d) это квартира в своей вертикальной шкале для облегчения распространения питательных веществ.
    2. Пусть центр пропеллер быть происхождение и использование символов R0, R1и R2 представляют максимальный радиус внутренний круг, средней секторов и внешних секторов, соответственно. Используйте символы m и n представляет количество внутренней дуги и спицы внутри области сектора, соответственно.
    3. Вычислить координаты каждого узла на винт как модель и записать их в символические выражения R0, R1, R2, mи n.
    4. Запустите сценарий программы, установить R0, R1, R2, mи n в качестве переменных и ввода символическое выражение каждого ключа узла.
      Примечание: Обратитесь к Таблице материалов для любого программного обеспечения информацией.
    5. Организовать путь, который соединяет узлы и назначьте патрон для внутреннего круга, среднего секторов и внешнего сектора. Задайте толщину слоя 150 мкм и количество слоев для 4.
    6. Пусть программа вывода в текстовый файл в G-код формата, распознаваемые bioprinter.
    7. Установить Р0 = 3,85, R1 = 6.85, R2 = 8.65, m = 2 и n = 5. Запустите сценарий и извлекать созданный файл G-кода. Копировать и вставить в файл bioprinter в выделенную папку G-кода.
    8. Включите bioprinter и его программное обеспечение управления. Инициализация принтера. Откройте сценарий G-код только что создали и все давление равным нулю. Возвращение в программное обеспечение управления, перейдите на вкладку торговец генератори нажмите кнопку запустить , в правом нижнем углу. Наблюдать за движущейся путь принтера.
      Примечание: Это будет проверить точность созданного G-кода. Обратитесь к Таблице материалы для информации, связанной с bioprinter.
    9. Этот шаг является необязательным. Создание демонстрационной 3D-модель, на основе параметров выше через программное обеспечение автоматизированного проектирования (CAD).
      Примечание: Обратитесь к Таблице материалов для поставщиков программного обеспечения информации.
  2. Сделать предвестником клетки Ладена Гидрогель A3G7
    Примечание: В этом разделе должны выполняться в стерильных условиях. Держите bioprinter внутри BSC.
    1. Стерилизовать bioprinter путем распыления на 70% спирте тщательно и подвергая его УФ света на ночь.
    2. Возьмите шприц гидрогеля прекурсоров (при 4 ° C) и тепло его в водяной бане при 37 ° C в течение 1 ч.
    3. Возьмите T-колба с клеток (см. шаг 1.3) CO2 инкубатора и поместите его в BSC. Отказаться от питательной среды и промойте клетки с DPBS дважды. Добавьте решение утепленные трипсина ЭДТА (3,0 мл) и инкубации клеток при 37 ° C на 6 мин неактивным трипсина же объемом FBS. Подсчет количества ячеек, используя assay Трипановый синий.
    4. Возьмите шприц гидрогеля прекурсоров из водяной бани, чистить и стерилизовать его с 70% этанол. Поместите шприц в BSC.
    5. Выдавить около 3 мл гидрогеля прекурсоров в 10 мл печати картриджа. Смешайте прекурсоров с MDA-MB-231-GFP клеток в 1 x 106 клеток/мл, медленно закупорить, избегая производства пузырей. Обложка картридж с стерильным концом и верхней крышки и запечатать его с парафином фильм. Центрифуга в 834 x г за 1 мин для устранения любых газовых пузырьков производится.
    6. Повторите шаги 3.2.3 - 3.2.5 IMR-90-mCherry клеток Ладена прекурсоров и свободных клеток прекурсора.
    7. Простерилизуйте все 3 картриджи с 70% этанола и затем загрузить их в камеры bioprinter. В программное обеспечение управления принтера установите картридж температуру до 25 ° C. Подождите, 35 минут, чтобы позволить прекурсор для достижения условий печати.
      Примечание: На этот раз не влияет на жизнеспособность клеток, встроенные в гидрогеля.
  3. Модели 3D печати
    1. В программное обеспечение управления принтера разверните вкладку головка инструмента в программное обеспечение управления принтера, нажмите на 1 картридж на графический интерфейс на левой стороне и нажмите кнопку меру короткие измерить положение кончик насадки. Повторите эту процедуру для других 2 картриджи.
    2. Разместите ясно полистирола микроплиты, откройте файл G-кода и изменить давление до 200 кПа для всех картриджей. Возвращение в программное обеспечение управления, перейдите на вкладку торговец генератор, выберите точку для начала печати и нажмите кнопку запустить , в правом нижнем углу. Повторите этот шаг, чтобы получить 3 больше реплицирует.
    3. После печати всех реплицирует пропеллер моделей, добавить 100 мм2 решение CaCl перекрестные ссылки модели за 1 мин и промойте его 2 x с DPBS, чтобы удалить избыток ионов Ca++ .
    4. Тщательно передачи модели на агарозы покрытием 6-ну пластину с помощью шпателя. Добавьте 5 мл DMEM СМИ в каждой скважине. Инкубируйте пластины в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
      Примечание: Убедитесь, что модели являются плавающие в скважинах.
    5. Заменить средний культуры клеток свежим среднего каждые 3 дня, культура на 30 дней в общей сложности.

4. жизнеспособность и сфероида формирования эксперименты на дисках гидрогеля.

  1. Подготовка диска Гидрогель
    1. Повторите шаги 3.2.1 - 3.2.6.
      Примечание: Это возможно для замены картриджа с небольшой стерильный контейнер.
    2. Используйте стерильные закончил 1 мл шприц и вырезать насадку для создания большое отверстие в шприц (отверстие имеет тот же диаметр, как и остальная часть трубку от шприца). Очистить его с 70% этанола и оставить его до тех пор, пока он высохнет.
      Примечание: Для этого в стерильных BSC.
    3. Использование хорошо пластина крышки, добавить 100 мм CaCl2 до тех пор, пока поверхность покрыта; Затем возьмите клетки Ладена Гидрогель для заполнения шприц; выдавливание 100 мкл, используя висит падение метод. Оставьте гидрогеля за 1 мин и промойте его с чрезмерным DPBS. Передавать диски гидрогеля на пластину 6-ну агарозы-покрытием, добавить 5 мл базальной DMEM и инкубировать их в 37 ° C и 5% CO2 на срок до 30 дней. Обновите носитель каждые 3 дня.
  2. Жизнеспособность клеток и сфероида
    1. Для определения жизнеспособности клеток используйте МТС assay. Мыть каждый диск с DPBS и разрезать на 4 части с тонкой стерильные лезвия. Собирать части целого диска и передавать их на 96-луночных пластины. Затем добавить 100 мкл DMEM плюс 20 мкл Реагента МТС в каждой скважине и инкубировать смесь при 37 ° C на 2 ч.
    2. После реакции, МТС восстановить супернатант и перенести его на тарелку чистой 96-луночных. Измерение оптической плотности образцов 490 Нм.
  3. Формирование сфероида
    1. Вынуть инкубирован пропеллер или диск модель из инкубатора на 0, 7, 15, 21 и 30 дней культуры и передавать их на тарелку чистой 6-хорошо.
    2. Использование диска конфокальный спиннинг инвертированный микроскоп для визуализации сфероидов и получать изображения, используя несколько позиций и z стеки. Изображения каждого винта, или модель диска, вдоль его горизонтальный диаметр слева направо с разрывом 500 мкм и приобрести z стек от дна до верхней плоскости фокуса в каждом горизонтальном положении.
      Примечание: Обратитесь к Таблице материалов для поставщиков информации.
    3. Восстановите образ с помощью максимальный стека арифметические инструмент, предоставляемый программой ImageJ, для создания 2D изображения, используемые для анализа сфероида.

5. растровая электронная микроскопия (SEM)

  1. Приготовьте Гидрогель альгината/желатина, как описано в шаге 1.2.
    Примечание: Стерильные условия не являются обязательными.
    Предупреждение: Жидкий азот и параформальдегида являются опасными и должны быть обработаны с осторожностью.
  2. Положите 1 мл гидрогеля в ступке, добавить жидкого азота и растереть его с помощью пестика. Продолжайте добавлять жидкий азот, чтобы избежать гидрогеля от размораживания. Передача порошка в 1,5 мл пластиковых пробирок, запечатать его и хранить его на-80 ° C на 2 ч. Freeze-dry образец для 24 h.
  3. Для изображений сфероида, мыть гидрогеля нежно с DPBS 2 x, исправить клетки путем погружения в параформальдегида 4% для 30 минут при 37 ° C, а затем промойте их с DPBS и заморозить их жидким азотом. Наконец freeze-dry образец для 24 h.
  4. Анализировать гидрогеля/сфероида структура и морфология с сканирующего электронного микроскопа (SEM) в 25,0 кв, до 70 Па (давление в камере) с увеличением 40 X 5, 000 X.

Результаты

Температура развертки показывает четкое различие A3G7 прекурсоров при 25 ° C и 37 ° C. Предвестником жидкости при 37 ° C и имеет сложный вязкость 1938.1 МПа ± 84.0 x s, который подтверждается более G» над G'. Как при понижении температуры, предвестником претерпевает физическое гелеоб?...

Обсуждение

Ячейки Ладена структуры может быть нарушена, если загрязнение (биологическое или химическое) происходит в любой точке процесса. Обычно биологическое загрязнение рассматривается после двух или трех дней культуры как цвет изменения в культуре средств массовой информации или bioprinted стру...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Дао Цзян благодарит Китай Стипендиальный Совет (201403170354) и МакГилл инженерных докторской премии (90025) для финансирования их стипендию. Хосе G. Мунгиа-Лопес спасибо КОНАСИТ (250279, 290936 и 291168) и FRQNT (258421) для финансирования их стипендию. Сальвадор Флорес-Торрес спасибо КОНАСИТ за их стипендию финансирования (751540). Джозеф м. Kinsella благодаря национальной науки и инженерных исследований Совет, Канадский фонд для инноваций, Фонд семьи Таунсенд-Lamarre и Университет Макгилла для их финансирования. Мы хотели бы поблагодарить Аллен Ehrlicher за предоставленную нам возможность использовать его Реометр, Dan Николау за предоставленную нам возможность использовать его конфокального микроскопа и Мораг парк для предоставления нам доступа к дневно обозначенные клеточных линий.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium alginateFMC BioPolymerCAS-No: 9005-38-3Protanal LF 10/60 FT
GelatinSigma-AldrichG9391Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X)GibcoLS141901361×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplateCorning N/AStirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubesCorning352098Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
CentrifugeGMIN/ASorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrousSigma-AldrichC1016
MilliQ waterMilliporeN/A
Millipore 0.22 µm filtersMilliporeSLGS033SBMillex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302Anton PaarN/A
Rheometer measuring tool CP25Anton Paar79038Conical plate geometry for rheometer
RheoCompassAnton PaarN/ASoftware controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscopeHitachiN/ASEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pureAcros Organics416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM)Gibco11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilizedSigmaA5955
Fetal bovine serumWisent Bioproducts080-150
Cell culture T-75 flasksSigma-AldrichCLS43064175 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1GeSiMN/A
GeSim softwareGeSiMN/ASoftware controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resistEFD Nordson7012126
End capEFD Nordson7014472
Tip capEFD Nordson7014469
Piston EFD Nordson7012182
Stainless nozzle G25EFD Nordson7018345
Water bathVWRN/A
AgaroseSigma-AldrichA9539Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates Corning3516TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscopeOlympus Life ScienceN/AOlympus IX83
MTS assay kitPromegaG3582CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kitMolecular Probes,ThermoFisher ScientificL3224
Trypsin 0.25/EDTA 1XGibco25200-072
Corning 96-well plateCorning3595Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave TuttnauerHeidolph BrinkmannN/AHeidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blueInvitrogen T102820.4% solution
EthanolCommercial AlcoholsP016EA95Greenfield Speciality Alcohols
CO2 IncubatorPanasonicN/AMCO 19AIC-PA
Lyophilizer SP ScientificN/AVirtis Sentry 2.0
SolidWorksDassault SystemsN/AA CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLABThe MathWorksN/AA programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

Ссылки

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575 (2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1 (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. . Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020 (2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003 (2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. . Fluidity and plasticity. , (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1373D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены