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Method Article
* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다
우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.
기본 종양 microenvironment의, 생화학, 세포 및 생물이 하지 성장 불멸 하 게 암 세포 선을 사용 하 여 기존의 2 차원 (2D) 세포 배양 하 여 지는. 다른 종류의 세포에 의하여 포함 된 다른 유형의 3 차원 (3D) 종양 모델을 만들 bioprinting 기술을 사용 하 여 이러한 문제를 극복할 수 있습니다. Alginate와 젤라틴은 bioprinting 그들의 생체 적합성, biomimicry, 및 기계적 특성 때문에 가장 일반적인 생체 재료의 두. 두 고분자를 결합해 서, 우리는 네이티브 종양 stroma의 미세한 구조 유사성과 bioprintable 복합 하이드로 겔을 달성. 우리는 유동성을 통해 복합 하이드로 겔의 전이성 공부 하 고 얻은 최적의 인쇄 창. 유방암 세포 및 섬유 아 세포는 hydrogels에 포함 되었고 vivo에서 microenvironment를 흉내 낸 3D 모델을 형성 하. Bioprinted 이종 모델 장기 세포 배양 (> 30 일)에 대 한 높은 생존 능력을 달성 하 고 추진 하 고 있는 다세포 종양 spheroids (MCTS)으로 유방암 세포의 자기 조립. 마이그레이션 및 암 관련 fibroblast 세포 (CAFs)의이 모델에는 MCTS 상호 작용 관찰합니다. Bioprinted 셀 문화 플랫폼, 공동 문화 시스템을 사용 하 여 기질 구성 tumorigenesis의 의존도 공부 하는 독특한 도구를 제공 합니다. 이 기술은 높은 처리량, 저렴 한 비용, 및 높은 재현성, 기능 그리고 그것은 또한 기존의 세포 단층 배양을 다른 모델 및 암 생물학 연구를 동물 종양 모델을 제공할 수 있습니다.
2 차원 세포 배양은 암 연구에서 널리 이용 된다, 비록 제한 영양분과 산소의 동일한 농도로 단층 형태로 재배 되 고 세포 존재 합니다. 이러한 문화는 중요 한 셀 부족과 상호 작용 세포-매트릭스 네이티브 종양 microenvironment (TME)에 제시. 따라서, 이러한 모델 제대로 탈 셀 동작, 등 부자연 스러운 형태학, 불규칙 한 수용 체 조직, 막 분극, 다른 비정상적인 유전자 발현의 결과로 생리 조건 정리 조건1,2,,34. 다른 한편으로, 3 차원 세포 배양, 어디 집계, spheroids, 또는 organoids로 체적 공간에서 세포를 확장 수 더 정확한 생체 외에서 근본적인 세포 생물학과 생리학을 공부 하는 대안 기술을 제공 합니다. 3D 세포 배양 모델 수 또한 네이티브 TME 생체 외에서1,,45의 중요 한 생리 적 특성은 세포-ECM 상호 작용을 격려 한다. 신흥 3D bioprinting 기술은 이기종 TME를 모방 하는 모델을 만들 가능성을 제공 합니다.
3D bioprinting 신속한 프로토 타입에서 파생 되 고 생활의 복잡 한의 일부를 흉내 낸 수 있는 3 차원 마이크로 구조 제조 조직 샘플6,7. 현재 bioprinting 방법 등 잉크젯, 압출 성형, 레이저를 이용한 인쇄8. 그 중, 압출 메서드는 정확 하 게 다른 초기 위치에서 다른 유형의 자료를 배치 하 여 인쇄 된 매트릭스 내에서 제어 하려면이 수 있습니다. 따라서, 모델 유형이 다른 시험관에 관련 된 여러 종류의 셀 이나 행렬 조작 하 가장 좋은 접근 이다. 압출 bioprinting는 성공적으로 구축 하는 귀의 모양된 건설 기계9, 혈관 구조10,,1112, 및 조직13, 높은 인쇄 충실도 셀에 결과 피부 사용 되었습니다. 생존 능력입니다. 기술 또한 다양 한 소재 선택, 알려진된 밀도와 높은 재현성14,,1516,17 포함 하는 셀 자료를 예금 하는 능력을 갖추고 . 천연 및 합성 hydrogels 자주 그들의 생체 적합성, bioactivity, 및 그들의 친수성 네트워크 ECM7,18 를 구조적으로 설계 될 수 있다 3D bioprinting bioinks로 사용 된다 19,20,21,,2223. 이후 그들은 셀, 구조 요소, 영양소 및 가스, 침투성 접착 사이트를 포함할 수 있습니다 및 장려 하기 위해 적절 한 기계적 속성 셀 개발24Hydrogels 유리한도 있습니다. 예를 들어, 콜라겐 hydrogels 세포를 연결 하는 데 사용할 수 있는 앵커리지 사이트 integrin를 제공 합니다. 젤라틴, 변성된 콜라겐, 유사한 세포 접착 사이트를 유지합니다. 반면, alginate bioinert 이지만 divalent 이온25,26,,2728와 crosslinks를 형성 하 여 기계적 무결성을 제공 합니다.
이 작품에서는, 우리는 bioink, alginate과 젤라틴, 네이티브 종양 stroma의 미세한 구조 유사성으로 이루어진 복합 하이드로 겔 개발. 유방암 세포 및 섬유 아 세포는 hydrogels에 포함 했다 그리고 vivo에서 microenvironment을 모방 하는 3D 모델을 만드는 입체 기반 bioprinter 통해 인쇄. 설계 된 3D 환경 세포 배양 (> 30 일)의 오랜 기간 동안 높은 생존 능력으로 다세포 종양 spheroids (MCTS)를 암 세포 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 복합 hydrogels 합성, 재료의 미세 및 전이성, bioprinting 세포 유형이 다른 모델, 특성화 고 MCTS 형성 관찰의 방법론을 보여 줍니다. 이러한 방법론은 약물 검사, 셀 마이그레이션 분석 실험, 및 기본적인 셀에 집중 하는 연구에서 잠재적인 응용 프로그램 뿐만 아니라 다른 유형의 조직 모델의 다른 디자인으로 압출 bioprinting에 다른 bioinks에 적용 될 수 있습니다. 생리 적 기능입니다.
1. 재료, 하이드로 겔, 셀 문화 자료의 준비
2입니다. Hydrogels의 유 변 학적 특성의 측정
3. 발판 디자인, 셀-라덴 하이드로 겔 및 3D 인쇄 모델
4. 생존 그리고 히드로 디스크에 회전 타원 체 형성 실험.
5. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)
온도 스윕 25 ° C와 37 ° C에서 A3G7 전조의 뚜렷한 차이 보여줍니다. 전조는 37 ° C에 액체 있으며 1938.1 ± 84.0 mPa의 복잡 한 점도 큰 G에 의해 유효성이 검사 되는 s, x "G 이상 '. 으로 온도 감소, 전조 트라이-나선 형성29,30에 젤라틴 분자의 자발적인 물리적 녹 채 인해 실제 겔 화를 겪 습. 모두 G'는 g "증가 하 고 솔-젤 전환을 나타내는...
셀-라덴 구조 오염 (생물학 또는 화학) 과정에서 어느 시점에 발생 하는 경우 손상 될 수 있습니다. 일반적으로, 생물 학적 오염 2 후 본 또는 색 문화의 3 일 문화 미디어 또는 bioprinted 구조 변경. 따라서, 살 균 (물리적, 화학적 소독) 모든 셀 관련 프로세스에 대 한 중요 한 단계 이다. 주목할 만한, 압력가 마로 소독 젤라틴 우리가 실시 하는 시험에서 느리게 젤 만든 고 속성을 변경 합니다. 따라서, ...
저자는 공개 없다.
타오 장 그들의 장학금 지원에 대 한 중국 장학금 위원회 (201403170354)와 맥 길 엔지니어링 박사 수상 (90025) 감사합니다. 호세 G. Munguia-로페즈 CONACYT (250279와 290936 291168) 및 FRQNT (258421) 그들의 장학금 지원에 대 한 감사. 살바도르 플로레스-토레스 CONACYT을 자금 (751540) 그들의 장학금 감사 합니다. 조셉 M. Kinsella 주셔서 국가 과학 및 공학 연구 위원회, 캐나다 재단 혁신, 타운센드 Lamarre 가족 재단, 그리고 맥 길 대학에 대 한 자신의 자금. 우리는 Allen Ehrlicher 그의 고분자, 우리 우리에 게 붙일 레이블된 셀 라인에 대 한 액세스를 부여에 대 한 그의 confocal 현미경, Morag 공원 사용 하 수 있도록 댄 Nicolau 사용 하 수 있도록 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
MilliQ water | Millipore | N/A | |
Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
Water bath | VWR | N/A | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
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