Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

Resumo

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Resumo

A heterogeneidade celular, bioquímica e biofísica do microambiente do tumor nativo não é recapitulada por linhas de células de câncer imortalizado crescente usando a cultura convencional bidimensional (2D) celular. Esses desafios podem ser superados por meio de técnicas bioprinting para construir modelos heterogêneos tridimensional (3D) tumor, segundo o qual diferentes tipos de células são incorporados. Alginato e gelatina são dois dos biomateriais mais comuns empregados em bioprinting devido à sua biocompatibilidade, biomimetismo e propriedades mecânicas. Combinando os dois polímeros, atingimos um hidrogel composto bioprintable com semelhanças com a arquitetura microscópica de uma estroma do tumor nativo. Estudamos a qualidade de impressão de hidrogel composto através de reologia e obtidos da janela de impressão ideal. Fibroblastos e células de câncer de mama foram incorporados no hidrogel e impressos para formar um modelo 3D, imitando o microambiente no vivo . O modelo heterogêneo bioprinted alcança uma alta viabilidade para cultura de células a longo prazo (> 30 dias) e promove a auto-montagem de células de câncer de mama em esferoides tumor multicelulares (MCTS). Observamos a migração e a interação das células de câncer-associado do fibroblasto (CAFs) com o MCTS neste modelo. Usando plataformas de cultura de células bioprinted como sistemas de co-cultura, dispõe de uma exclusiva ferramenta para estudar a dependência da tumorigênese sobre a composição do estroma. Esta técnica apresenta uma alta produtividade, baixo custo e alta reprodutibilidade, e também pode fornecer um modelo alternativo para culturas convencionais monocamada e modelos de tumor animal para estudar a biologia do câncer.

Introdução

Embora a cultura de pilha 2D é amplamente utilizada na pesquisa do câncer, existem limitações como as células são cultivadas em um formato de monocamada com uma concentração uniforme de nutrientes e oxigênio. Essas culturas faltam importante célula-célula e interações célula-matriz presentes no microambiente do tumor nativo (TME). Consequentemente, estes modelos mal recapitular condições fisiológicas, resultando em comportamentos aberrantes de células, incluindo morfologias antinaturais, organização irregular do receptor, polarização de membrana e expressão do gene anormal, entre outros condições^1,2,3,4. Por outro lado, a cultura de células 3D, onde as células são expandidas em um espaço volumétrico como agregados, esferoides ou organoids, oferece uma técnica alternativa para criar ambientes em vitro mais precisos para estudar a fisiologia e biologia celular fundamentais. Modelos de cultura de células 3D também podem incentivar interações célula-ECM que são críticas características fisiológicas do nativo TME em vitro^1,4,5. A tecnologia emergente de bioprinting 3D fornece possibilidades para construir modelos que imitam o TME heterogêneo.

Bioprinting 3D é derivado de prototipagem rápida e permite a fabricação de microestruturas 3D que são capazes de imitar as complexidades da vida^6,7amostras de tecido. Os atuais métodos de bioprinting incluem jato de tinta, extrusão e assistida por laser impressão⁸. Entre eles, o método de extrusão permite a heterogeneidade ser controlado dentro de matrizes de impressos por precisamente posicionamento distintos tipos de materiais em locais diferentes do iniciais. Portanto, é a melhor abordagem para fabricar modelos heterogêneos em vitro envolvendo vários tipos de células ou matrizes. Bioprinting de extrusão tem sido usada com sucesso para construir andaimes de forma auricular⁹, estruturas vasculares de^11,10,12e tecidos¹³, resultando em células e alta fidelidade de impressão de pele viabilidade. A tecnologia também possui seleções materiais versátil, a capacidade de depositar materiais com células incorporado com um conhecido de densidade e alta reprodutibilidade^14,15,16,17 . Hidrogel natural e sintética é usadas frequentemente como bioinks para bioprinting 3D, devido à sua biocompatibilidade, Bioatividade e suas redes hidrofílicos que podem ser projetados para assemelhar-se estruturalmente o ECM^{7,18 ,19,20,21,22,23}. Hidrogel também é vantajosos, já que podem incluir sites adesivos para células, elementos estruturais, permeabilidade de nutrientes e gases, e as propriedades mecânicas adequadas para incentivar desenvolvimento²⁴da pilha. Por exemplo, o colágeno hidrogel oferece integrina locais de ancoragem que células podem usar para conectar para a matriz. Gelatina, colágeno desnaturado, mantém sites semelhantes de adesão celular. Em contraste, o alginato é bioinert mas fornece integridade mecânica, formando ligações cruzadas com íons divalentes^25,26,,^27,28.

Neste trabalho, desenvolvemos um hidrogel composto como um bioink, composto de alginato e gelatina, com semelhanças com a arquitetura microscópica de uma estroma do tumor nativo. Fibroblastos e células de câncer de mama foram incorporados o hidrogel e impresso através de uma bioprinter baseada em extrusão para criar um modelo 3D que imita o microambiente no vivo . O ambiente 3D projetado permite que as células cancerosas formar esferoides tumor multicelulares (MCTS) com uma alta viabilidade por longos períodos de cultura celular (> 30 dias). Este protocolo demonstra as metodologias de sintetizar compostos hidrogel, caracterizando a microestrutura dos materiais e qualidade de impressão, bioprinting celular modelos heterogêneos e observar a formação de MCTS. Essas metodologias podem ser aplicadas a outros bioinks em extrusão bioprinting, bem como para diferentes projetos de modelos de tecidos heterogêneos com aplicações potenciais na despistagem de drogas, ensaios de migração celular e estudos que se concentram em célula fundamental funções fisiológicas.

Protocolo

1. preparação dos materiais, hidrogel e materiais de cultura celular

1. Preparação de material e solução
   1. Lave e seque a 250 mL e copos de vidro de 100 mL, Agitadores magnéticos, espátulas, cartuchos 10ml, bocais cilíndricos de 25g com (um comprimento de 0,5 na) e um diâmetro interno de 250 µm. Esterilizar os materiais em autoclave-los em 121 ° C/15 min/1 ATM. manter os materiais em condições estéreis até o uso.
      Nota: Consulte a Tabela de materiais , para obter informações do fornecedor.
   2. Pese 3 g de alginato (3% p/v) e 7 gramas de gelatina (7% w/v) (denotado como A3G7 agora em diante).
   3. Esterilize os seguintes itens à luz pelo menos 4 h: alginato e gelatina pós, película de parafina, pedaços de folha de alumínio de 5 cm²e 1 mL e seringas de 5ml UV. Esterilizar as tampas, tampões de ponta e pistões imergindo-os em etanol a 70% pelo menos 4 h e lavá-los 2 x com água ultra-pura esterilizada.
      Nota: Consulte a Tabela de materiais , para obter informações do fornecedor.
   4. Dissolver 4 g de agarose com água ultra pura e esterilize em autoclave.
      Nota: A agarose é completamente dissolvido após o processo de esterilização em autoclave.
   5. Prepare uma solução de 100 mM de cloreto de cálcio anidro (CaCl₂) em água ultra pura esterilizada e um filtro estéril (com um tamanho de poros de 0,22 µm) antes da sua utilização.
   6. Para placas com revestimento em agarose 6-poço, derreter o agarose estéril no microondas para obter uma solução líquida; Então, sob um armário de biossegurança (BSC) e usando uma micropipeta de 1 mL, adicionar 2 mL por bem e misture delicadamente para criar uma camada uniforme no fundo do poço. Deixe arrefecer e selar o poço com película de parafina. Mantê-lo em temperatura ambiente (RT) até o uso.
2. Preparação do hidrogel A3G7 precursor
   1. Misture 3 g de alginato e 7 g de pó de gelatina em um copo de 250 mL, dentro de um BSC. Adicione um agitador magnético e 100 mL de DPBS. Sele o recipiente com papel filme e alumínio parafina estéril (²de 5 cm) para evitar a contaminação.
   2. Dissolva o pó sob uma agitação constante em uma placa magnética/quente com 600 rpm a 60 ° C, durante 1 h e no RT por mais 2 h.
   3. Aquecer o material a 37 ° C, até que o gel passa por uma fase de transição para o estado líquido (para 100 mL de solução de gel de estoque, isto leva aproximadamente 45 min). Transferir a solução para tubos de centrifuga conico de estéril 50ml, selá-los e centrifugar os tubos a 834 x g por 5 min eliminar as bolhas de gás com o material.
   4. Aspire o precursor de hidrogel para seringas de 10 mL. Selar as seringas com os tampões e película de parafina. Armazená-los em 4 ° C até o uso.
3. Cultura celular
   Nota: As etapas nesta seção devem ser realizadas sob condições estéreis.
   1. Preparar o meio DMEM basal como segue (1 L): em um BSC, misture 100 mL de soro fetal bovino (FBS) e mais 10 mL de uma solução de antibiótico/antimicótico (100 x solução estabilizada) em um recipiente estéril fresco. Adicionar meio DMEM para ajustar a mistura até 1.000 mL. Feche o recipiente e mantê-lo em 4 ° C.
   2. Em um banho de água previamente aquecida (37 ° C), descongelar 1 frasco de MDA-MB-231-GFP (linhagem de células de câncer materno localização nuclear, GFP-etiquetado) e 1 frasco de IMR-90-mCherry (associada a câncer fibroblasto célula linhas mCherry-rotulados, com localização citoplasmática ) as células de armazenamento de nitrogênio líquido, movendo-os suavemente na água. As linhas de célula e os plasmídeos de GFP e mCherry de rotulagem, estão disponíveis comercialmente.
   3. Transferir 160 µ l/poço de solução de célula (3 x 10⁶ células/mL) em uma placa de 6 e adicionar 5 mL de meio DMEM base aquecida (37 ° C). Incube a placa em 37 °C/5% CO₂ por 24-48 h até as células alcançar 80% de confluência.
   4. Depois que as células alcançar confluência, descartar o meio e enxágue as células duas vezes com DPBS; Incube as celulas com 500 µ l de solução de tripsina-EDTA/poço (0,25%, 1 x, previamente aquecido a 37 ° C) a 37 ° C por 6min. Em seguida, desativar a tripsina adicionando 500 µ l de FBS, recuperar a solução de célula e transferi-lo para frascos de T-75. Incube-los novamente a 37 °C/5% CO₂ até as células alcançar 80% de confluência.
      Nota: O volume de solução de tripsina-EDTA pode variar dependendo do navio do crescimento celular.
   5. Repita a etapa anterior para trabalhar com células em passagem 3-4 como é quando as células têm mais estabilidade e atividade metabólica.
   6. Conte as células usando um ensaio de azul de trypan (0,4%) para determinar a concentração inicial de células a ser misturado com o hidrogel.

2. medições das propriedades reológicas de hidrogel

1. Prepare o precursor de hidrogel de alginato/gelatina conforme descrito na etapa 1.2.
   Nota: Condições estéreis não são necessárias para gerado para ensaios mecânicos e análise de amostras. Todos os testes reológicos são executados em triplicado.
2. Pegue uma seringa de hidrogel precursor e aquecer em banho-maria 37 ° C por 1h.
3. Ligue o rheometer e inicializar o sistema de acordo com as etapas a seguir.
   1. Liga o compressor de ar ligado ao rheometer e deixe o compressor de ar, correr por 30 min. Switch na caixa de controle de temperatura para o rheometer, ligue o rheometer em si e ligue o computador ligado para o rheometer.
   2. Abra o software rheometer, clique em inicializar no painel de controle e deixa o processo de inicialização terminar. Defina a temperatura de plataforma a 37 ° C no painel de controle.
   3. Clique na guia do conjunto de medição e navegue até a função de serviço de início, selecione Adjust inércia de motorista no menu drop-down e clique em Iniciar ajuste na janela pop-up.
   4. Monte um paralelo ferramenta no rheometer de medição. Todos os experimentos realizados aqui usam um prato de diâmetro de 25 mm com uma abertura de 1 mm entre as placas.
   5. Clique em ajustar zero-distância do painel de controle e aguardar o processo terminar. Preste atenção para a força normal durante este processo.
      Nota: Após este procedimento, a força normal deve ser 0.
   6. Clique na guia do conjunto de medição e navegue até a função de serviço de início, selecione Adjust inércia de sistema medição superiore clique em Iniciar ajuste na janela pop-up. Uma vez feito, clique no botão do triângulo no painel de controle para permitir que o instrumento de medição mover para cima.
4. Realizar uma varredura de amplitude.
   1. Clique em Iniciar, em seguida, clique em Inserir no menu superior, selecione a espera do menu drop-down. Puxe a janela de configuração e definir o tempo de espera de 2 h.
      Nota: Isto irá adicionar uma etapa de espera antes dos testes.
   2. Clique em Iniciar, em seguida clique novamente no botão Inserir e no menu suspenso, selecione o dispositivo. Puxe a janela de configuração, escolha a temperaturae configurá-lo para ser 25 ° C. Desmarque a caixa de espera até que valor é atingido.
   3. Clique a etapa de medição, então clique a variável tensão de oscilação, puxe a janela de configuração, defina o perfil para ser o logaritmo de rampae altere o valor para 0,001% e 100% como a tensão inicial e final, tensão, respectivamente. Defina a frequência a 0,01 Hz.
   4. Clique no botão Adicionar para adicionar a variável de temperatura . Clique a variável temperatura e configurá-lo para ser 25 ° C. Na janela de pull-up, expanda calculadora, defina o ponto de densidade para 10 pontos/década.
   5. Pegue a seringa fora o banho de água e extrude aproximadamente 0,5 mL do precursor na plataforma rheometer.
   6. Clique no triângulo para baixo botão painel de controle. Espere que o instrumento de medição mover para baixo para a posição de corte.
   7. Use uma espátula para aparar qualquer excesso precursores que escaparam à beira do instrumento de medição e descartar o material supérfluo.
   8. Pipetar óleo mineral sobre o canto do instrumento de medição e esperar até que o óleo totalmente lacra o limite.
   9. Clique em continuar no painel de controle. Clique no botão Iniciar (triângulo verde), seguido por clicar botão continuar na tela de fundo.
   10. Quando o teste é feito, liberar o instrumento de medição e então clique na para cima Triângulo botão no painel de controle. Retire o instrumento de medição e limpe-o com etanol a 70%. Limpe a plataforma com etanol a 70%.
   11. No projeto atual, clique em etapa de medição e puxe a janela de configuração. Agora, o conjunto a frequência de 100 Hz. manter todos os outros parâmetros inalterados.
   12. Repita as etapas 2.4.5 - 2.4.10.
   13. Clique em diagrama. Observar a curva de G', G " contra a estirpe de oscilação. Encontrar os pontos de deflexão de G' para ambas as frequências (0,01 Hz e 100 Hz). Encontre as estirpes de oscilação correspondente para ambos os pontos de deflexão.
   14. Escolher a menor tensão de oscilação e usar 1/10 desta variedade para todos os testes de oscilação realizados posteriormente.
       Nota: O aparecimento de G' desvio é considerado o ultimo linear elástica tensão (ULES) que não deve ser excedida em testes de acompanhamento. A proporção de 1/10 é geralmente usada em engenharia por razões de segurança. Este calculado estirpe é denotado como g_C.
   15. Depois que o teste é concluído, clique em tabela, copiar todos os dados e colá-lo em um arquivo de texto.
5. Realizar uma varredura de temperatura.
   1. Clique em meus aplicativos e selecione o modelo rampa de temperatura, oscilatória: gelificação.
   2. Nome do projeto.
   3. Clique a etapa de medição do fluxo de trabalho. Clique na variável temperatura, puxe a janela de configuração e definir a temperatura inicial e final para ser a 37 ° C e 25 ° C, respectivamente.
   4. Na janela de pull-up, defina estirpe de oscilação para 0,1%, frequência de oscilação de 1Hz. Em seguida, defina o número de pontos de dados para ser 61. Definir a frequência de coleta de dados de ponto 1/min. clique em calculadora e definir o ponto de densidade de 0,2 ° C/ponto.
      Nota: Isto permitirá que a temperatura mudar a uma velocidade de 0,2 ° C/min.
   5. Carregar a amostra na plataforma rheometer e realize o teste seguindo as etapas 2.4.5 - 2.4.10.
   6. Clique em diagrama, observar o G', G " contra a temperatura. Encontrar o ponto de cruzamento de G' e G ". Encontre a temperatura no ponto de cruzamento.
      Nota: Esta é a temperatura de transição do sol/gel do precursor hidrogel.
   7. Repita a etapa 2.4.15.
6. Realizar uma varredura de tempo isotérmico.
   1. Clique em meus apps e encontrar e clique no modelo isotérmica tempo-temperatura de teste. Clique a etapa de medição do fluxo de trabalho e, em seguida, clique a variável tensão de oscilação, puxe a janela de configuração, defina a estirpe de oscilação para 0,1% e definir a frequência de oscilação de 1 Hz. Na janela de pull-up, defina o número de pontos de dados para 120. Defina a frequência de coleta de dados de ponto 1/min.
      Nota: O valor desta estirpe é baseado nos resultados da varredura da amplitude.
   2. Clique o botão Adicionar para adicionar a variável de temperatura . Clique em variáveis de temperatura na janela do meio e defina-a 25 ° C.
      1. Botão direito do mouse o passo dispositivo mover-se para o ponto de medição do fluxo de trabalho, clique em excluir. Clique em etapa que dispositivo definir valor, desmarque a caixa de espera até que seja atingido valore defina o valor para 25 ° C. Clique em imagens, tittle, botões na tela inferior, desmarque a caixa de continuar. Em seguida, clique em Iniciar, nome do projeto da etapa e salvá-lo.
   3. Carregar a amostra para a plataforma rheometer e iniciar o teste seguindo as etapas 2.4.5 - 2.4.10.
   4. Observar o G', G " contra o tempo. Encontrar o ponto de cruzamento de G' e G ". Encontre o tempo no ponto de cruzamento. Depois que o teste é concluído, clique em tabela, copiar todos os dados e colá-lo em um arquivo de texto.
      Nota: Este é o tempo de transição do sol/gel do hydrogel precursor a 25 ° C.
7. Medir a força de rendimento em vários tempos de coagulação.
   1. Clique em meus apps e encontrar e clique no modelo stress de rendimento e fluxo, Gel-like. Nome do projeto. Clique o passo Iniciar o fluxo de trabalho. Clique em Inserir no menu superior e, no menu drop-down, selecione esperar. Puxe a janela de configuração e definir o tempo de espera para ser 20 min.
      Nota: Isto irá adicionar uma etapa de espera antes dos testes.
   2. Clique em Iniciar, em seguida, clique em Inserir novamente e, no menu drop-down, selecione o dispositivo. Puxe a janela de configuração, escolheu a temperatura e configurá-lo para 25 ° C. Desmarque a caixa de espera até que valor é atingido.
   3. Clique a etapa de medição do fluxo de trabalho, selecione a variável tensão de cisalhamento, puxe a janela de configuração e definir a tensão de cisalhamento inicial e final para 0 e 10.000 Pa, respectivamente.  Clique em calculadora, defina o ponto de densidade para 0,2 ponto/PA. Na aba de pontos de dados no lado esquerdo, conjunto 1 ponto por segundo.
      Nota: isto irá resultar em uma taxa de subida de estresse de 5 Pa/s.
   4. Clique na guia controle de evento na parte inferior da janela do pull-up e definir o critério de parada: parar a medição se o cisalhamento taxa > 100 s^-1.
      Nota: Isto irá automaticamente parar a medição se o material é gerou.
   5. Carregar a amostra para a plataforma rheometer e iniciar o teste seguindo as etapas 2.4.5 - 2.4.10.
   6. Clique em diagrama. Observe a curva de tensão-estresse. Encontre o ponto de deflexão de seu correspondente estresse e a tensão. Repita as etapas 2.7.2 - 2.7.6, mas altere o tempo de espera para 30, 40 e 50 min para cada replicação; Isso resultará na força de rendimento em momentos diferentes de coagulação.
      Nota: Esta tensão é considerada como a força de rendimento aparente.
      Nota: o software cliques podem diferir por rheometer modelos e versões de software. Recomendamos que os leitores a tomar referência dos parâmetros de teste, nós fornecemos, tempo consulte o manual do rheometer/software específico no uso prático.
       

3. modelos de impressão 3D, hidrogel célula-carregado e Design do andaime

1. Projeto de andaime
   1. Desenhe um modelo de hélice, como no papel.
      Nota: O modelo de hélice, como é projetado com base nas seguintes considerações: (a) que simula o cenário na vivo onde as células cancerosas estão rodeadas por CAFs; (b) minimiza a concentração de estresse através do uso de geometrias circulares; (c) é flexível para que setores mais podem ser adicionados para o modelo no futuro sem alterar as geometrias existentes; e (d) é plana na sua escala vertical para facilitar a difusão de nutrientes.
   2. Deixe o centro da hélice são a origem e usar os símbolos R₀ R₁e R₂ para representar o raio máximo do círculo interno, sectores médios e sectores exteriores, respectivamente. Use os símbolos m e n para representar o número de arcos internos e raios dentro da área do setor, respectivamente.
   3. Calcular as coordenadas de cada nó do modelo hélice-como e escrevê-los em expressões simbólicas de R₀ R₁, R₂, me n.
   4. Iniciar um script de programa conjunto R₀ R₁, R₂, me n como variáveis e a expressão simbólica de cada nó chave de entrada.
      Nota: Consulte a Tabela de materiais para qualquer informações de software.
   5. Organizar um caminho que conecta os nós e atribuir um cartucho para o círculo interno, os setores médios e dos sectores exteriores. Defina a espessura de camada a ser 150 µm e o número de camadas para ser 4.
   6. Deixe o programa um arquivo de texto no formato de código G que é reconhecível pelo bioprinter de saída.
   7. Conjunto R₀ = 3,85, R₁ = 6.85, R₂ = 8,65, m = 2 e n = 5. Execute o script e recuperar o arquivo de G-código gerado. Copie e cole o arquivo para a pasta de código G dedicada a bioprinter.
   8. Ative o bioprinter e seu software de controle. Inicialize a impressora. Abra o script de código G acabou de criar e definir todas as pressões para zero. Retornar para o software de controle, clique na guia gerador de andaimese, em seguida, clique no botão executar no canto inferior direito. Observe o movimento caminho da impressora.
      Nota: Isto irá testar a precisão do G-código gerado. Consulte a Tabela de materiais , para obter informações relacionadas com a bioprinter.
   9. Esta etapa é opcional. Construa um modelo 3D demonstrativo baseado nos parâmetros acima através do software de desenho assistido por computador (CAD).
      Nota: Consulte a Tabela de materiais para as informações de fornecedores de software.
2. Fazer um precursor de hidrogel de A3G7 célula-carregado
   Nota: As etapas nesta seção devem ser realizadas sob condições estéreis. Mantenha o bioprinter dentro de um BSC.
   1. Esterilizar o bioprinter em etanol a 70% de pulverização completamente e expô-lo à luz UV durante a noite.
   2. Pegue uma seringa de precursor hidrogel (a 4 ° C) e aquecê-lo em banho-maria a 37 ° C por 1h.
   3. Pegue o T-balão com células (consulte a etapa 1.3) da CO₂ incubadora e coloque-a dentro de um BSC. Descartar o meio de cultura e enxagúe as células com DPBS duas vezes. Adicionar uma solução de aquecida do trypsin-EDTA (3,0 mL) e incubar as células a 37 ° C por 6 min. inativar a tripsina com um mesmo volume de FBS. Conte as células usando trypan azul ensaio.
   4. Pegue a seringa do hydrogel precursor do banho, limpe-o e sterilize com etanol a 70%. Colocar a seringa para o BSC.
   5. EXTRUDE aproximadamente 3 mL de hidrogel precursor em um cartucho de impressão de 10 mL. Misture o precursor com células MDA-MB-231-GFP a 1 x 10⁶ células/mL pipetando lentamente, evitando a produção de bolhas. Cubra o cartucho com o fim de estéril e parte superior e selá-lo com a película de parafina. -Centrifugar a 834 x g por 1 min eliminar as bolhas de gás produzidas.
   6. Repita as etapas 3.2.3 - 3.2.5 para o precursor de célula-carregado do IMR-90-mCherry e o precursor de célula livre.
   7. Esterilizar todos os 3 cartuchos com etanol a 70% e depois carregá-los para as câmaras do bioprinter. No software de controle da impressora, definir a temperatura de cartucho a 25 ° C. Espere 35 minutos para permitir que o precursor alcançar condições para impressão.
      Nota: Desta vez não afeta a viabilidade das células incorporado no hidrogel.
3. Modelos de impressão 3D
   1. No software de controle da impressora, expanda a guia de cabeça da ferramenta em software de controle da impressora, clique em 1 cartucho na interface gráfica do lado esquerdo e, em seguida, clique no botão de medida curta para medir a posição da ponta do bico. Repita isto para os outros 2 cartuchos.
   2. Coloque uma microplaca de poliestireno clara, abra o arquivo de código G e mudar a pressão de 200 kPa para todos os cartuchos. Retornar para o software de controle, clique na guia gerador de andaimes, selecione um ponto para iniciar a impressão e, em seguida, clique no botão executar no canto inferior direito. Repita esta etapa para obter 3 repetições mais.
   3. Depois de imprimir todas as réplicas dos modelos de hélice, adicionar um 100 mM CaCl₂ solução cross-link os modelos por 1 min e enxaguá-lo 2x com DPBS para remover o excesso de íons Ca +⁺ .
   4. Transferi com cuidado, os modelos em uma placa de 6-Poços revestidos agarose usando uma espátula. Adicione 5 mL de mídia DMEM a cada poço. Incube as placas em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂.
      Nota: Certifique-se que os modelos estão flutuando em poços.
   5. Substituir o meio de cultura celular com meio fresco a cada 3 dias, cultura-lo por 30 dias no total.

4. viabilidade e experiências de formação esferoide sobre os discos de hidrogel.

1. Preparação do disco de hidrogel
   1. Repita os passos de 3.2.1 - 3.2.6.
      Nota: É possível substituir o cartucho com um pequeno recipiente estéril.
   2. Use uma seringa de 1ml graduada estéril e corte o bocal para criar um grande buraco na seringa (o buraco tem o mesmo diâmetro que o resto do tubo seringa). Limpe-o com 70% de etanol e deixá-lo até que esteja seco.
      Nota: Fazer isto em um BSC estéril.
   3. Usar uma tampa de poço-placa, adicionar 100 mM CaCl₂ até que a superfície é coberta; Então, leve o celular-carregado de hidrogel para encher a seringa; EXTRUDE 100 µ l usando o enforcamento cair método. Deixe o hidrogel para 1 min e enxague com DPBS excessiva. Transferir os discos de hidrogel em uma placa 6-poços de agarose-revestido, adicionar 5 mL de DMEM basal e incube-os a 37 ° C e 5% de CO₂ por até 30 dias. Atualize o meio a cada 3 dias.
2. Viabilidade celular e esferoide
   1. Use um ensaio MTS para determinar a viabilidade celular. Lavar cada disco com DPBS e corte em 4 partes com uma boa lâmina estéril. Recolher as peças de todo o disco e transferi-los para uma placa de 96 poços. Em seguida, adicionar 100 μL de DMEM além de 20 µ l de reagente MTS a cada poço e incubar a mistura a 37 ° C por 2 h.
   2. Após a reação de MTS, recuperar o sobrenadante e transferir para uma placa limpa de 96. Medir a absorvância das amostras em 490 nm.
3. Formação de esferoide
   1. Pegue o modelo da hélice ou disco incubado da incubadora nos dias 0, 7, 15, 21 e 30 da cultura e transferi-los para uma placa limpa de 6.
   2. Uso um disco giratório confocal microscópio para visualizar os esferoides e adquirir as imagens usando várias posições e z-pilhas invertido. Cada hélice, ou modelo de disco, ao longo do seu diâmetro horizontal da esquerda para a direita com uma lacuna de 500 µm e adquirir uma z-pilha do fundo para o topo plano focal em cada posição horizontal da imagem.
      Nota: Consulte a Tabela de materiais para as informações do fornecedor.
   3. Reconstrua a imagem usando uma ferramenta de pilha máximo aritmética, fornecida pelo programa ImageJ, para criar as imagens 2D usadas para análise um esferoide.

5. microscopia eletrônica (SEM)

1. Prepare o hidrogel de alginato/gelatina conforme descrito na etapa 1.2.
   Nota: Não são necessárias condições estéreis.
   Cuidado: Paraformaldeído e nitrogênio líquido são perigosos e devem ser manuseados com cuidado.
2. Colocar 1 mL de hidrogel em um almofariz, adicionar nitrogênio líquido e triturá-lo usando um pilão. Continue a adicionar nitrogênio líquido para evitar o hidrogel de descongelação. Transferir o pó em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, selá-lo e armazená-lo a-80 ° C por 2 h. congelar a amostra por 24 h.
3. Para a imagem latente de esferoide, lave o hidrogel suavemente com DPBS 2 x, consertar as células por imersão em paraformaldeído 4% durante 30 min a 37 ° C e em seguida Enxague com DPBS e congelá-los com nitrogênio líquido. Finalmente, congela a amostra por 24 h.
4. Analisar a estrutura de hidrogel/esferoide e morfologia com um microscópio eletrônico de varredura (MEV) em 25,0 kV, abaixo dos 70 Pa (pressão de câmara), com uma ampliação de 40 X 5, 000 X.

Resultados

A varredura de temperatura mostra uma diferença distinta do precursor A3G7 a 25 ° C e 37 ° C. O precursor é líquido a 37 ° C e tem uma viscosidade complexa de 1938.1 ± 84,0 mPa x s, o que é validado por um G maior "sobre G'. Como a temperatura diminui, o precursor sofre física gelificação devido o emaranhamento física espontânea das moléculas de gelatina em uma formação de tri-hélice^29,30. Ambos o G' e a G "aument...

Discussão

Estruturas celulares-carregado podem ser comprometidas se a contaminação (química ou biológica) ocorre em qualquer ponto no processo. Geralmente, contaminação biológica é vista após dois ou três dias da cultura como uma cor mudar os meios de cultura ou a estrutura de bioprinted. Portanto, a esterilização (desinfecção química e física) é um passo fundamental para todos os processos relacionados à célula. Notável, gelatina de autoclavagem altera suas propriedades de coagulação, que tornou mais lento d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium alginate	FMC BioPolymer	CAS-No: 9005-38-3	Protanal LF 10/60 FT
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X)	Gibco	LS14190136	1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate	Corning	N/A	Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes	Corning	352098	Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge	GMI	N/A	Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C1016
MilliQ water	Millipore	N/A
Millipore 0.22 µm filters	Millipore	SLGS033SB	Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302	Anton Paar	N/A
Rheometer measuring tool CP25	Anton Paar	79038	Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass	Anton Paar	N/A	Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope	Hitachi	N/A	SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure	Acros Organics	416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM)	Gibco	11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized	Sigma	A5955
Fetal bovine serum	Wisent Bioproducts	080-150
Cell culture T-75 flasks	Sigma-Aldrich	CLS430641	75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1	GeSiM	N/A
GeSim software	GeSiM	N/A	Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist	EFD Nordson	7012126
End cap	EFD Nordson	7014472
Tip cap	EFD Nordson	7014469
Piston	EFD Nordson	7012182
Stainless nozzle G25	EFD Nordson	7018345
Water bath	VWR	N/A
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates	Corning	3516	TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile
Confocal spinning disk inverted microscope	Olympus Life Science	N/A	Olympus IX83
MTS assay kit	Promega	G3582	CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay
Live/Dead viability cytotoxicity kit	Molecular Probes,ThermoFisher Scientific	L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X	Gibco	25200-072
Corning 96-well plate	Corning	3595	Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer	Heidolph Brinkmann	N/A	Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue	Invitrogen	T10282	0.4% solution
Ethanol	Commercial Alcohols	P016EA95	Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator	Panasonic	N/A	MCO 19AIC-PA
Lyophilizer	SP Scientific	N/A	Virtis Sentry 2.0
SolidWorks	Dassault Systems	N/A	A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB	The MathWorks	N/A	A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1