Isolement des vésicules extracellulaires de tissu du foie

Résumé

Il s'agit d'un protocole visant à isoler les vésicules extracellulaires tissulaires (VE) du foie. Le protocole décrit un processus en deux étapes impliquant la perfusion de collagène suivie de l'ultracentrifugation différentielle pour isoler les véhicules électriques du tissu hépatique.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) peuvent être libérées de nombreux types de cellules différentes et détectées dans la plupart, sinon la totalité, des fluides corporels. Les véhicules électriques peuvent participer à la communication de cellule à cellule en fermant des molécules bioactives comme l'ARN ou la protéine d'une cellule à l'autre. La plupart des études sur les véhicules électriques ont été réalisées dans des modèles de culture cellulaire ou dans des véhicules électriques isolés des fluides corporels. On s'intéresse de plus en plus à l'isolement des véhicules électriques des tissus pour étudier leur contribution aux processus physiologiques et la façon dont ils sont modifiés dans la maladie. L'isolement des véhicules électriques avec un rendement suffisant des tissus est techniquement difficile en raison de la nécessité de dissociation des tissus sans dommages cellulaires. Cette méthode décrit une procédure pour l'isolement des véhicules électriques à partir du tissu hépatique de souris. La méthode implique un processus en deux étapes commençant par la digestion in situ de collagène suivie de l'ultra-centrifugation différentielle. La perfusion tissulaire à l'aide de collagène offre un avantage sur la coupe mécanique ou l'homogénéisation du tissu hépatique en raison de son rendement accru des véhicules électriques obtenus. L'utilisation de ce processus en deux étapes pour isoler les véhicules électriques du foie sera utile pour l'étude des véhicules électriques tissulaires.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VEV) sont des vésicules membranaires qui sont libérées de nombreux types de cellules dans le corps. Les véhicules électriques contiennent une cargaison de molécules qui comprennent l'ARN, l'ADN et les protéines. Le transfert de cette cargaison par les véhicules électriques d'une cellule à l'autre est postulé comme un mécanisme par lequel les cellules dans les tissus communiquent les uns avec les autres¹. La majorité de l'information concernant la cargaison ou les rôles des véhicules électriques dans la santé normale et les maladies a été dérivée d'études sur les véhicules électriques obtenus à partir de cellules en culture ou recueillies à partir de la circulation ou d'autres fluides corporels². Afin de comprendre leurs rôles physiologiques invivo, une méthode robuste est nécessaire pour l'isolement des véhicules électriques tissulaires qui capte toutes les populations de véhicules électriques et évite les dommages cellulaires ou la contamination³. L'objectif global de la méthode décrite ci-contre est d'isoler les véhicules électriques tissulaires des foies de souris.

La plupart des types de cellules dans le foie ont été montrés pour produire des véhicules électriques, et l'étude de la signalisation basée sur les véhicules électriques fait progresser les connaissances de base et la compréhension des maladies hépatiques. Cependant, l'impact combiné des véhicules électriques de différents types de cellules dans les tissus n'est que partiellement compris. L'isolement des véhicules électriques des tissus hépatiques est nécessaire afin de comprendre les contributions in situ des véhicules électriques dans le milieu tissulaire. L'approche décrite ci-dessus est basée sur une perfusion en deux étapes pour améliorer la dissociation des tissus et minimiser les dommages cellulaires. Par la suite, les véhicules électriques sont isolés du tissu hépatique dissocié. Des approches utilisant la perfusion en deux étapes pour l'isolement des hépatocytes ont été utilisées depuis le début des années 1950⁴. Ces méthodes pour l'isolement d'hépatocyte ont été modifiées et continuellement améliorées et sont maintenant des approches standard pour l'isolement des hépatocytes dans les cultures, dans les suspensions de cellules, et des tissus^5,6,7. Dans la première étape, le foie est soumis à une perfusion non-recirculation avec tampon sans calcium, la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS). Dans la deuxième étape, le foie est perfusé avec du collagène pour dissoudre la matrice extracellulaire pour une séparation plus poussée des jonctions cellulaires-cellulaires desmosomales. Le temps de traitement optimal pour la dissolution de collagène est de 7 à 10 minutes. Une durée plus courte du traitement causera la dissolution incomplète et maintiendra des contacts de cellules dans le foie, alors qu'une plus longue durée peut causer des dommages de foie ou la perturbation de veine de portail. Les véhicules électriques sont ensuite isolés à l'aide d'une centrifugation différentielle pour enlever les cellules et les débris cellulaires. Il en résulte une collecte de véhicules électriques dans des rendements élevés qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses ou études en aval.

Protocole

Toutes les études portant sur des animaux ont été réalisées conformément à un protocole qui a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de la clinique Mayo.

1. Préparation du banc

1. Préparer un bain d'eau et le mettre à 37 oC. Les autres équipements et configurations nécessaires sont indiqués à la figure 1.
2. Mesurez 100 mg de collagène de type IV et ajoutez-le à un flacon de 125 ml contenant 100 ml de HBSS dans un bain d'eau (40 oC). Assurez-vous que le collagène a été dissous en tourbillonnant le liquide dans le flacon, et assurez-vous également que le flacon est immergé complètement dans le bain d'eau. Pour une plus grande efficacité, laisser le collagène se dissoudre pendant au moins 30 min, même s'il peut sembler se dissoudre instantanément.
3. Immerger un flacon de 125 ml contenant 50 ml de HBSS dans un bain d'eau à 40 oC. Ceci sera utilisé pour le rinçage initial.
4. Vaporiser la surface de tous les instruments tels que les ciseaux et les forceps avec 70% d'éthanol. Préparer quelques cotons-tiges propres.
5. Rincer le tube de la pompe en faisant fonctionner 70 % d'éthanol à travers la pompe et enlever tout éthanol résiduel en le rinçant deux fois avec de l'eau courante.
6. Poser un banc absorbant sur le banc du laboratoire et placer un contenant de boîte dure sur le dessus. Ceci sera nécessaire pour contenir tout excès de liquides pendant la perfusion de la souris. Enveloppez un tampon en mousse de polystyrène avec du papier d'aluminium et placez-le à l'intérieur du contenant.
7. Déposer un plat de culture stérile de 10 cm près du banc. Ceci sera employé pour tenir le foie digéré après que la perfusion soit accomplie.
8. Verser 10 ml de milieu de collagène (étape 1,2) dans un plat de culture stérile à l'avance.
9. À l'aide d'un ensemble de collecte de sang ailé, connectez le calibre 23 à l'extrémité libre du tube de la pompe (couper les ailes de la canule papillon peut conduire à une meilleure manipulation). Passez jusqu'à ce que la pointe de la canule de la collecte de sang soit remplie.

2. Préparation des animaux

1. Avant de commencer l'anesthésie à l'aide d'isoflurane, assurez-vous qu'une quantité suffisante de gaz d'approvisionnement est disponible pour la durée de la procédure. Allumez l'apport en oxygène (O₂) de la chambre d'induction à 1-2 L, puis allumez l'isoflurane entre 2-4% à l'aide d'un débitmètre.
2. Mettez la souris dans la chambre d'induction et fermez la porte supérieure. Surveillez la souris jusqu'à ce qu'elle soit couchée.
   REMARQUE : Les gaz dans la chambre maintiendront les souris anesthésiées pendant plusieurs minutes.
3. Placez la souris sur un tampon en mousse de polystyrène enveloppé de papier d'aluminium. Passer le flux de la chambre d'induction à un cône de nez. Assurez-vous que l'anesthésie est adéquate. Si la souris a commencé à répondre, retenez-la doucement dans un cône de nez jusqu'à ce qu'elle soit entièrement anesthésiée.
4. Assurer l'anesthésie en surveillant la respiration et la réponse à la stimulation pendant la procédure. Ajuster le débitmètre au besoin pour assurer une anesthésie adéquate. Les pattes doivent ne pas répondre au test de pincement sous anesthésie. Des détails supplémentaires peuvent être obtenus auprès du guide de laboratoire pour le soin des animaux.
5. Tapez ou épinglez les quatre membres de la souris.
6. Nettoyez la peau sur l'abdomen en pulvérisant 70 % d'éthanol et en l'essuyant avec de la gaze et un tampon d'alcool. Cette étape est essentielle pour éviter la contamination par la fourrure de la souris.
7. Faire une coupe grande ouverte à travers la peau de l'antérieur à l'os du bassin à l'aide d'un ensemble de ciseaux stériles. Veillez à ne pas couper les organes internes. Déplacez les intestins sur le côté gauche de l'animal à l'aide d'un applicateur à pointe de coton pour exposer délicatement la veine du portail (PV) et le veau de véna inférieur (IVC).

3. Cannulation et Perfusion (0.5 h)

1. À l'aide de forceps incurvés, placez un fil sous la veine du portail et attachez un noeud lâchement pour préparer le cinching bien après le cannulation.
2. Insérer la canule (23G de l'ensemble de collecte de sang) dans la veine du portail 5-10 mm au-dessous de la ligature. N'insérez pas la canule au-delà de la première branche de portail, sinon le lobe antérieur droit peut être insuffisamment perfusé. La canule peut être fixée ou attachée avec du fil à l'aide d'un noeud d'arrêt.
3. Démarrer la pompe pour infuser dans HBSS à un faible débit (1-2 mL/min). Une fois que l'annulation est confirmée pour être réussie, le foie commencera à blanchir.
4. Couper l'IVC pour soulager la pression et laisser le liquide excessif dans le foie s'écouler. Ceci est mieux effectué en utilisant les opérateurs d'autre part de sorte que la canule n'est pas déplacé.
5. Augmentez lentement le débit à 8 ml/min et complétez la perfusion en utilisant le volume entier de 50 ml de HBSS à travers le foie, au cours des 5 minutes suivantes.
6. Changer le milieu contenant du collagène (étape 1.2) dans le bécher juste avant que le HBSS commence à manquer. Assurez-vous que les bulles d'air ne sont pas présentes et ne s'écoulent pas dans le foie lors du changement du milieu.
7. Appliquer une pression transitoire sur l'IVC à 5 s intervalles en serrant avec des forceps. Cela fera gonfler le foie et aidera à la digestion des tissus et la dissociation (7-8 min). Au fur et à mesure que la digestion progresse, le foie gonflera et deviendra blanc. Le foie peut gonfler uniformément à environ deux fois sa taille d'origine.
8. Éteignez la pompe et retirez la canule une fois la digestion terminée. L'achèvement de la digestion du foie dépendra de la taille de la souris et de l'état du foie. Une bosselure dans le foie peut être observée si un applicateur à pointe de coton est utilisé pour sonder doucement le foie.
9. Enlever la vésicule biliaire du foie, en prenant soin de ne pas la déchirer. À l'aide d'une paire de ciseaux et de forceps lavés, extraire le foie de la souris dans un plat stérile de culture de 10 cm contenant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) pour le lavage de surface. Transférer soigneusement le foie dans le plat stérile de culture de 10 cm contenant du milieu de collagène (à partir de l'étape 1.8). Il s'agit d'une étape critique pour éviter la contamination par le sang de souris et la bile.
10. Saisir et déchirer le foie avec deux forceps propres tout en secouant doucement les cellules du foie. Au fur et à mesure, le milieu s'assombrit. Tous les hépatocytes peuvent être secoués, laissant derrière eux le tissu conjonctif et le tissu vasculaire.
11. Triturate la solution cellulaire plusieurs fois à l'aide d'une seringue de 3 ml jusqu'à ce que les parties non digérées du foie soient secouées. Versez-le dans un tube conique de 50 ml avec des passoires à cellules en nylon de 70 m pour filtrer tout tissu conjonctif non digéré. Laver le plat avec HBSS pour recueillir les cellules restantes et remplir le tube conique de 50 ml.
12. Centrifugeuse doucement le tube conique de 50 ml dans un rotor de seau oscillant à 50 x g pendant 10 min à 4 oC.
13. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 ml.

4. Isolement des véhicules électriques (5 h)

1. Centrifuger le supernatant à 300 x g pendant 10 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 ml.
2. Centrifuger le supernatant à 2000 x g pendant 20 min à 4 oC pour enlever les débris cellulaires et les agrégats.
3. Transférer le supernatant dans un tube à fond rond et centrifuger le supernatant à 10 000 x g pendant 70 min à 4 oC.
4. Recueillir le supernatant et le placer dans un tube d'ultracentrifuge en polycarbonate et une centrifugeuse à 100 000 x g pendant 70 min à 4 oC.
5. Recueillir la pastille dans un tube d'ultracentrifuge qui est ensuite lavé par la suspension à nouveau dans PBS. Centrifuger le supernatant plus loin à 100.000 x g pendant 70 min à 4 oC.
6. Le granule final composé de nanovésicules cellulaires peut être directement utilisé pour des expériences ou re-suspendu avec 1000 L de PBS et stocké à -80 oC.

5. Évaluation de la qualité et du rendement des isolements

1. Évaluer la répartition et la concentration de la taille à l'aide d'une analyse du suivi des nanoparticules ou d'une détection d'impulsions résistantes réglable suivant les protocoles du fabricant de l'instrument.
2. Effectuer un isolement et une purification supplémentaires de populations spécifiques de vésicules par diverses approches telles que l'ajout d'un gradient ou d'un coussin de saccharose, des techniques d'immunoaffinité ou une chromatographie d'exclusion de taille, basée sur des besoins expérimentaux spécifiques.

Résultats

L'appareil nécessaire à ces isolements comprend des équipements de laboratoire standard, ce qui en fait une approche relativement simple et rentable. Des isolements ont été exécutés des souris mâles et femelles de Balb/c ou de FVB de douze à trente semaines. Le plateau qui tient la souris est recouvert de papier d'aluminium à l'intérieur d'un contenant à parois dures qui recueille l'excès de liquides pendant la perfusion. Les flacons contenant du HBSS ou du milieu contenant de la collagène sont immergés dans un bain d'eau (40 oC) prêt à être utilisé. Deux plats stériles de culture de 10 cm sont utilisés. L'un est nécessaire pour le lavage de surface avec PBS, et l'autre pour la séparation des hépatocytes des composants du tissu conjonctif.

Dans cette méthode, le foie est perfused d'une manière non-continue par l'intermédiaire de la veine de portail de préférence à cannulation du cava inférieur de veine. Une approche alternative et couramment utilisée perfusion est d'effectuer la perfusion rétrograde en cannisant le cava vena inférieur et en coupant la veine du portail pour le drainage. Cependant, la veine de portail cannulation est facile d'accès et implique une courte distance au foie, car la veine de portail alimente directement dans le foie⁸. Le choix d'un point d'insertion pour le cannulation est crucial pour un succès optimal (Figure 2). La canule est placée au-delà des branches de l'estomac et des veines pancréatiques, mais pas au-delà de la première branche du portail (veines hépatiques droites et gauches). Une fois que l'emplacement optimal d'insertion dans la veine du portail est identifié, les forceps incurvés sont utilisés pour placer un fil sous la veine du portail et nouer un noeud lâche. L'aiguille de canule est fixée avec du fil à l'aide d'un noeud d'arrêt pour empêcher l'aiguille de tomber.

La figure 3 décrit le schéma de traitement global de la centrifugation différentielle pour l'isolement des véhicules électriques des tissus hépatiques. L'ultracentrifugation élimine les cellules, les débris et autres impuretés. Les quatre premières étapes de centrifugation (50 x g, 300 x g, 2 000 x g, 10 000 x g) sont conçues pour éliminer les hépatocytes, les autres cellules intactes, les cellules mortes ou les débris cellulaires respectivement. (Figures 4A et 4B). Après ces étapes, l'ultracentrifugation est à nouveau effectuée à 100 000 x g pour recueillir la pastille (Figure 4C). La pastille est lavée par la suspension à nouveau en PBS et soumise à une ultracentrifugation finale à 100 000 x g. Le granule après ultracentrifugation est absolument visible et viscide dans cette procédure par rapport aux véhicules électriques des médias de culture conditionnés. Pipetting plusieurs fois est nécessaire jusqu'à ce que les agrégats bruns sont hors de vue et complètement dissous. Le granule final est resuspendu avec 1000 l de PBS (Figure 4D). L'ultracentrifugation élimine les impuretés et autres contaminants solubles du plasma, ce qui peut affecter les résultats expérimentaux fonctionnels. La centrifugation est effectuée à 4 oC.

À partir du foie de souris, cette méthode donne une concentration de particules de tissu qui varie de 1,74 à 4,00 x 10¹² avec une moyenne de 3,46 x 10¹² particules par mL, selon l'analyse du suivi des nanoparticules (NTA) (Figure 5). La taille moyenne des véhicules électriques isolés de tissu de foie était 157.7 nm, avec une taille de mode de 144.5 nm et tailles de EV s'étendant de 100-600 nm par NTA. Le rendement de EV dépendra de facteurs tels que le poids du foie et les pertes dans les étapes de perfusate ou d'ultracentrifugation.

Figure 1 : Préparation du banc. Les matériaux et leurs emplacements sont les : (A) pompe, (B) flasque réchauffé de 125 ml contenant HBSS et port d'aspiration d'eau, cône de nez (C) relié à un vaporisateur d'Isoflurane, (D) port d'échappement d'eau de la pompe se connectant à l'aiguille, (E) plateau doublé de papier d'aluminium à l'intérieur d'un récipient fort dur, et (F) plat de culture de 10 cm dans lequel le milieu de collagène est versé à l'avance. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Site Cannulation. L'anatomie de l'abdomen de la souris est montrée. À l'aide de forceps incurvés, un fil est placé sous la veine du portail (PV) et un noeud lâche est attaché. L'emplacement d'insertion est près du foie, 5-10 mm au-dessous de la ligature, mais pas au-delà de la première branche de portail (veines hépatiques gauches et droites). La canule est fixée ou attachée à l'aide d'un fil avec un noeud d'arrêt. Ce noeud sert de marqueur de l'emplacement PV si la canule est délogée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Schematic des étapes de centrifugation. L'objectif est d'éliminer les cellules indésirables et d'autres composants et d'isoler les véhicules électriques. Les quatre premières étapes de centrifugation sont conçues pour éliminer les hépatocytes et autres cellules, les cellules mortes ou les débris cellulaires à l'aide d'une centrifugation différentielle. Après ces étapes, l'ultracentrifugation est effectuée à 100 000 x g pour collecter le granule de véhicules électriques. La pastille est lavée par la suspension à nouveau en PBS et soumise à une ultracentrifugation finale à 100 000 x g. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 4 oC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Centrifugation différentielle. (A) Après centrifugation à 50 x g pendant 10 min, on observe une pastille contenant des hépatocytes. (B) Un tube à fond rond est utilisé pour la centrifugation à 10 000 x g pendant 70 min pour enlever les débris cellulaires. (C) Un tube d'ultracentrifuge en polycarbonate est utilisé pour la centrifugation à 100 000 x g pendant 70 min. La pastille est recueillie dans un tube et lavée par une suspension à nouveau avec du PBS. (D) Le granule final est resuspendu dans 1000 L de PBS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Résultat représentatif. La taille et la concentration des véhicules électriques des tissus hépatiques peuvent être déterminées par l'analyse du suivi des nanoparticules (ATN). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ce protocole décrit une méthode optimale et reproductible pour l'isolement du tissu hépatique EV utilisant un processus de perfusion en deux étapes par l'intermédiaire de la veine de portail suivie de l'ultracentrifugation différentielle. Les étapes importantes de la procédure incluent le placement de canule, la concentration et le temps de digestion de collagène, la vitesse d'écoulement du milieu, la manipulation du tissu après la digestion, et l'ultracentrifugation différentielle classique.

La séparation cellulaire est obtenue par séparation des composants du tissu conjonctif après digestion en utilisant le type de collagène IV. La concentration de collagène utilisée pour la perfusion peut varier de 0,1 à 5 mg/ml. Il peut y avoir une variation considérable de lot à lot dans l'efficacité de la collagène pour la digestion des tissus. Des concentrations de collagène de 0,5 à 5 mg/mL ont été testées, mais la concentration utilisée n'a pas eu d'impact majeur sur le rendement des véhicules électriques obtenus. L'utilisation d'une concentration plus élevée de collagène se traduira par un gonflement plus rapide et le blanchiment du foie. L'objectif est d'obtenir une dissociation cellulaire satisfaisante sans contamination excessive ni dommage. Une concentration optimale de collagène utilisée dans ces isolements est de 1-2 mg/mL perfusé pendant 7-8 min à un débit de 8 ml/min. Une procédure de perfusion trop longue augmentera le risque de détruire le tissu conjonctif mince dans le foie ainsi que d'augmenter les risques techniques tels que le délogement d'aiguille de la veine du portail ou le piégeage de l'air avec la veine.

L'aspect le plus difficile de ce protocole est l'annulation de la veine du portail. Cela peut être difficile à réaliser, en particulier chez les souris de la taille de 18 à 25 g. Les techniques pour la perfusion de collagène ont été développées à l'origine pour une utilisation chez les rats et plus tard adoptées pour une utilisation chez la souris après de nombreuses modifications et ajustements. Cannulation à l'aide d'un ensemble de collecte de sang 23G est plus facile que le placement d'un cathéter dans les vaisseaux sanguins de petit diamètre luminal. Il est recommandé de fixer la canule à l'aide d'un nœud d'arrêt avec un noeud d'arrêt pour éviter le délogement et le noeud sert également de marqueur de l'emplacement de la veine du portail au cas où la canule se détache du navire.

Pour l'analyse en aval, il est extrêmement important d'avoir une contamination minimale des cellules. Il y a plusieurs considérations importantes dans la manipulation des tissus après digestion. Tout d'abord, les forceps et les ciseaux sont changés lorsque le foie est extrait pour éviter la contamination sanguine. Deuxièmement, il est essentiel que la vésicule biliaire soit soigneusement enlevée du foie pour éviter la déchirure et la contamination non désirée de la bile. Troisièmement, une fois que le foie a été retiré de la souris, le foie est lavé très doucement en utilisant PBS pour enlever tout sang. La réduction de la contamination par les cellules devrait être plus prioritaire que la réduction du rendement des véhicules électriques obtenus.

L'ultracentrifugation est la méthode la plus couramment utilisée pour l'isolement et la purification des véhicules électriques^8,9,10,11. Cette approche éliminera la plupart des cellules parenchymales telles que les hépatocytes ou les cholangiocytes et les cellules non parenchymales telles que les cellules Kupffer, les cellules endothéliales sinusoïdales, et les cellules stellates, En outre, les débris cellulaires, les agrégations cellulaires, et les cellules mortes seront également par centrifugation différentielle. La purification et l'isolement ultérieurs des populations spécifiques peuvent être exécutés par chromatographie d'exclusion de taille pour enlever tous les agrégats ou lipoprotéines non vésiculaires de protéine.

Une limitation de ce protocole est qu'il ne peut pas capturer toutes les vésicules tissulaires, étant donné la possibilité que certaines vésicules peuvent être enlevés dans le perfusate. Si une évaluation globale est nécessaire, il convient de prendre en considération la collecte des perfusats et l'isolement des vésicules à l'intérieur du perfusat. Une autre limitation est le risque de dommages cellulaires. Pour surveiller l'impact potentiel de la mort cellulaire excessive, la viabilité cellulaire peut être surveillée et incorporée dans les paramètres de qualité pour les isolements des tissus EV. En conclusion, cette procédure décrit un flux de travail optimisé utilisant une technique de perfusion en deux étapes par l'intermédiaire de la veine de portail suivie d'ultracentrifugation différentielle pour obtenir des véhicules électriques de tissu de foie des foies de souris à un rendement élevé. Ces véhicules électriques tissulaires conviennent à des analyses en aval telles que la caractérisation de la composition biomoléculaire et d'autres études qui visent à caractériser leurs rôles physiologiques ou pathophysiologiques ou leurs applications potentielles en tant que marqueurs de maladie.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyer flask	Fisher scientific	FB500125
125 mL Erlenmeyer flask	Fisher scientific	FB500125
Curved non-serrated scissors	Fine Science Tools	14069-12
Curved forceps	Fine Science Tools	13009-12
Masking tape	Home supply store
Aluminum foil	Home supply store
Styrofoam pad	Home supply store
Absorbent Bench Underpad	Scientific inc.	B1623
Masterflex L/S Digital Miniflex Pump	Cole-parmer	ZX-07525-20
Water bath	Thermo Electron Precision	2837
Blood collection sets	Becton Dickinson	367292
Petri dish, clear lid 100x15	Fisher Scientific	FB0875712
Falcon 70mm Nylon Cell Strainers	Fisher scientific	352350
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	12-565-270
Cotton Tipped Applicators	Moore medical	69622
25mL Serological Pipet	Falcon	357525
Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser	BioSurplus	203-2751
O2 gas
Isoflurane
Levo Plus Motorized Pipette Filler	Scilogex	74020002
Centrifuge 5804R	Sigma-aldrich	22628048
Beckman Coulter Optima L-100 XP	Beckman	969347
Beckman Coulter Avanti JXN-26	Beckman	B34182
70 Ti Fixed-Angle Rotor	Beckman	337922
JA-25.50Fixed-Angle Rotor	Beckman	363055
Nalgene Round-bottom tube	Thermo Scientific	3118-0028
Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly	Beckman	355618
Reagents
HyClone Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free	Fisher scientific	SH30588.01
Collagenase, Type IV, powder	Fisher scientific	17104019
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher scientific	SH30256.01