Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique.  En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.

Résumé

Contamination par les aflatoxines dans les cultures de l’alimentation humaine et animale est un défi majeur dans le monde entier. Les aflatoxines, produites par le champignon Aspergillus flavus (a. flavus) sont des agents cancérigènes qui réduisent considérablement la valeur des récoltes de maïs et autres plantes oléagineuses riches comme l’arachide en plus qui posent une menace sérieuse pour la santé humaine et animale. Différentes approches, y compris la reproduction traditionnelle, transgénique expression des protéines de résistance liée et l’interférence ARN (Arni)-base de gène induite par le hôte faire taire des critiques a. flavus gènes cibles, sont envisagées pour augmenter résistance d’aflatoxine dans les cultures sensibles. Des études antérieures ont montré un rôle important de le α-amylase dans la production de pathogénie et d’aflatoxines a. flavus , suggérant cette gène/enzyme est une cible potentielle pour réduire la croissance d’a. flavus et la production d’aflatoxine. À cet égard, la présente étude visait à évaluer l’expression hétérologue (sous contrôle du promoteur CaMV 35 s constitutif) d’une protéine de type inhibiteur de α-amylase Lablab purpureus L. (AILP) chez le maïs contre a. flavus. AILP est une protéine de 36 kDa, qui est un inhibiteur compétitif de l’enzyme α-amylase a. flavus et appartient à la famille de protéine inhibiteur de la lectine – arcelin – α-amylase en commun haricot. Des études in vitro avant les travaux en cours avaient démontré le rôle de AILP dans l’inhibition de l’activité de le α-amylase a. flavus et la croissance fongique. La croissance fongique et la production d’aflatoxine dans les grains mûrs ont été suivis en temps réel en utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus . Ce noyau screening test (KSA) est très simple à mettre en place et fournit des données fiables et reproductibles sur les maladies infectieuses et le degré de propagation qui ont pu être quantifiée pour l’évaluation des ressources génétiques et les lignées transgéniques. La fluorescence de la souche GFP est étroitement corrélés aux champignons de la croissance et, par extension, il est bien corrélé aux valeurs de l’aflatoxine.  Les travaux en cours visait à mettre en œuvre cette connaissance préalable dans une récolte commercialement importante comme le maïs pour augmenter la résistance de l’aflatoxine. Nos résultats montrent une réduction de 35 % à 72 % de croissance d’a. flavus dans les grains transgéniques maïs exprimant l’AILP qui, à son tour, traduit par une réduction de 62 % à 88 % dans les niveaux d’aflatoxine.

Introduction

Contamination par les mycotoxines par les genres fongiques, Alternaria , Fusarium, Penicilliumet Aspergillusest un problème majeur de la nourriture et nourrissent de plantes cultivées dans le monde^1,2,3. Parmi ces champignons phytopathogènes, Aspergillus a le plus d’impact défavorable sur la valeur des récoltes et de la santé humaine et animale. Aspergillus flavus (A. flavus) est un plante opportuniste pathogène qui infectent les plantes oléagineuses riches telles que le maïs, le coton et d’arachide et produit les agents cancérigènes, aflatoxines, ainsi que de nombreux métabolites secondaires toxiques (SMs). Le maïs est un aliment important et nourrir des cultures dans le monde entier et est très sensible à la contamination par a. flavus. L’impact économique de la contamination par les aflatoxines sur perd et valeur réduite chez le maïs peut être autant que $ 686,6 millions/an dans l’US² avec les changements prévus dans le climat mondial, l’incidence des aflatoxines peut entraîner de plus grandes pertes économiques dans le maïs avec aussi hautes que $ 1,68 milliards/an dans le futur proche²estimations. Étant donné les conséquences économiques et sanitaires des aflatoxines chez les humains et le bétail, contrôle avant la récolte aflatoxines dans le maïs peut être le moyen le plus efficace pour prévenir la contamination par les aflatoxines dans les denrées alimentaires et aliments pour animaux.

L’approche du contrôle de pré-récolte majeur pour la résistance des aflatoxines dans le maïs qui a été largement utilisé dans les dernières décennies est principalement par le biais de sélection, ce qui nécessite une quantité importante de temps⁴. Récemment, biocontrol a eu un certain succès dans la réduction des aflatoxines dans la zone de grande échelle pour les applications^5,6. En plus de la lutte biologique, application de pointe outils moléculaires tels que « Hôte induite par Gene Silencing » (HIGS) par le biais de RNAi et expression transgénique de protéines associées à la résistance a eu un certain succès dans la réduction de la croissance d’a. flavus et d’aflatoxines production dans les études de laboratoire et de terrain à petite échelle. Ces approches sont actuellement en cours d’optimisation en plus de l’identification de nouvelles cibles potentielles de gène a. flavus pour manipulation future.

Outre les gènes qui sont directement impliqués dans la production de mycotoxines comme cibles potentielles des stratégies de lutte transgéniques, amylases fongiques auraient dû être divulgués à jouer un rôle crucial dans le maintien de production réussie de pathogénie et de mycotoxine pendant les premiers stades de l’infection des plantes hôtes. Quelques exemples incluent Pythium pleroticum (agent causal de la pourriture du rhizome de gingembre), Fusarium solani (agent causal de la flétrissure de chou-fleur), où des corrélations positives entre la pathogénicité et le α-amylase expression et l’activité ont été observées à ^7,,⁸. Inhibition de l’activité de le α-amylase par knock-out du gène ou approches knockdown affecte négativement la production de toxine et de croissance fongique. Un mutant de knock-out de α-amylase d’a. flavus a été incapable de produire des aflatoxines lorsqu’il est cultivé sur amidon substrat ou dégermées grains de maïs⁹. De même, au Fusarium verticillioides une souche de α-amylase n’ont pas produit de fumonisine B₁ (mycotoxines) au cours de l’infection des grains de maïs¹⁰. Dans une étude plus récente, Gilbert et coll. (2018) ont montré qu’un axée sur l’ARNi Démantelez d’a. flavus expression de α-amylase par HIGS significativement réduit a. flavus production de croissance et d’aflatoxines pendant l’infection noyau maïs¹¹ .

Inhibiteurs spécifiques de l’activité de le α-amylase ont également produit des résultats similaires obtenus de down-régulation de l’expression de le α-amylase. Le premier rapport sur le rôle d’un inhibiteur de le α-amylase fongique résistance provenait de l’isolement et la caractérisation d’un inhibiteur de la trypsine-α-amylase 14 kDa de lignées de maïs résistants à a. flavus¹². Outre le dépistage de plusieurs centaines d’espèces de plantes par Fanfan et Woloshuk conduit à l’identification d’une protéine de type inhibiteur de α-amylase 36 kDa (AILP) des graines de haricots de Jacinthe, Lablab purpureus L.¹³. La séquence peptidique de lectines AILP ressemblait à appartenant à la famille de l’inhibiteur de la lectine – arcelin – α-amylase déclarés en commun haricot^14,15. AILP purifiée ne présente pas toute activité inhibitrice envers la trypsine mammifères et plus de caractérisation in vitro ont montré une inhibition significative de la croissance d’a. flavus et la germination des conidies¹³. Les rapports présentés ici clairement montre α-amylase peut servir d’objectif dans les approches de contrôle pour limiter les agents pathogènes ou parasites qui dépendent de la mobilisation d’amidon (à travers l’activité de le α-amylase) et l’acquisition des sucres solubles comme source d’énergie au cours de leur pathogène interaction avec les plantes hôtes.

Alpha-amylase est connu pour être critique dans a. flavus pathogénicité^9,10,11et compte tenu de l’importance de AILP comme un puissant anti-a. flavus agent (α-amylase inhibition/antigrowth)¹³, Nous avons généré des plants de maïs transgéniques exprimant Lablab AILP gène sous le promoteur CaMV 35 s constitutif. Le but était de vérifier si une expression hétérologue de cet inhibiteur de le α-amylase dans le maïs est efficace contre a. flavus pathogenèse et aflatoxine production au cours de l’infection de noyau de maïs. Nos résultats démontrent que les grains de maïs transgéniques exprimant AILP significativement réduit l’a. flavus croissance et aflatoxine production au cours de l’infection de noyau.

Protocole

1. plasmide constructions et la transformation de maïs

1. PCR amplification Lablab AILP insert en utilisant les amorces 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'et 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Les conditions de la PCR incluent une étape de dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s (étape 1), suivie de la dénaturation à 98 ° C pendant 10 s (étape 2), recuit à 55 ° C pendant 30 s (étape 3), l’allongement à 72 ° C pendant 20 s (étape 4), 31 cycles de l’étape 2 à l’étape 4 , et un allongement final étape à 72 ° C pendant 5 min. Clone le produit PCR dans un pCAMBIA mis à jour le 1 300 vector à l’aide de XbaI et Pstj’ai des sites de restriction. Séquence le vecteur de destination finale végétale pour confirmer l’orientation et la séquence du gène AILP cloné dans le vecteur.
2. Transformer la souche Agrobacterium EHA101 avec la construction du vecteur final (Figure 1) comme précédemment décrit ¹⁶.
3. Utilisation transformé Agrobacterium contenant le vecteur de destination finale usine pour transformer les embryons immatures maïs (Zea mays L. Hi-II) (effectuées à l’usine de Transformation installation de Iowa State University) ¹⁶.
4. Faire pousser des plantes₀ T dans la serre (26 – 29 ° C, photopériode de 16/8 h additionné de Na-lampes à haute pression) et à plusieurs reprises auto-polliniser pour obtenir la génération₆ T pour atteindre l’homozygotie pour le caractère transgénique.

2. test de germination de spores

1. Récolter des échantillons de feuilles et de conserver à-80 ° C. Moudre les échantillons de feuilles dans un mortier à l’aide d’azote liquide. Peser avec 0,5 g en tubes de microcentrifuge de 2 mL, ajouter 17 µL d’inhibiteur de protéase et placer les tubes sur la glace.
2. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 16 000 x g. Transférer 225 µL d’extrait de plante aux tubes de microcentrifuge de 0,5 mL et placer sur la glace.
3. Dans un tube à centrifuger 15 mL, préparer une suspension 5 mL de spores d' Aspergillus flavus 70 – GFP dans un bouillon de dextrose de pomme de terre 1 % (p/v). Vortex et ajuster la concentration de spores à⁵ 10 spores/mL avec un hémocytomètre.
   Attention : A. flavus produit des aflatoxines, tous les travaux avec ce champignon devraient être conduite dans une armoire de sécurité biologique.
4. Incuber dans APB à 28 ° C jusqu'à ce que la culture atteint 50 % début de la germination de la spore comme indiqué par le renflement des spores.
5. Extraient de vortex et aliquote 25 µL spore de solution à l’usine de 225 µL. Incuber les échantillons pendant 20 heures à 28 ° C sous agitation intermittente.
6. Aliquote 25 µL de solution de spores sur une lame de microscope et mesurez la longueur du germe de tubes de spores en utilisant le logiciel de l’appareil photo numérique. Utiliser un minimum de 20 mesures répétées pour chaque ligne.
   Remarque : À ce stade, placer toutes les cultures à 4 ° C pour arrêter la croissance de la colonie jusqu’au moment de compter.

3. noyau Screening Test (KSA)

1. Construire des casquettes KSA en collant les 4 capuchons de clin d’oeil (22 mm) dans un plat de pétri de 60 x 15 mm. Laissez la colle sécher pendant 48 H avant d’utiliser des bouchons. Chaque capuchon KSA constitue une Rep (Figure 2).
2. Dans une armoire de sécurité biologique stérile, pulvériser un plateau carré bio-essai (24 x 24 cm) avec 70 % éthanol : H₂O (v/v) et laissez l’air sec. Papier pour chromatographie stérile s’ajoute la barre d’état. 9 sélections KSA de pulvérisation avec l’éthanol à 70 %, laisser l’air sec et placez dans le bac de dosage biologique.
3. Pour chaque ligne de maïs transgénique mis à l’essai, sélectionnez 20 cerneaux intacts et placer dans un tube à centrifuger 50 mL. Ajouter de l’éthanol à 70 % et laisser reposer pendant 4 minutes. Secouer doucement les tubes pendant la stérilisation. Égoutter les amandes éthanol et rincer trois fois dans stérile désionisée H₂O.
4. Préparer une suspension de spores d' Aspergillus flavus 70 – GFP¹⁷ d’une culture vieille de 6 jour cultivées sur un milieu V8 (5 % jus V8, 2 % d’agar, pH 5,2).
   1. Ajouter 20 mL stérile 0,02 % Triton X-100/désionisée H₂O (v/v) et les débris hors des spores avec une anse stérile. Pipette au large de l’inoculum et le place dans un bécher stérile de 300 mL.
   2. Préparer une dilution de 5 fois avec 0,02 % X-100 Triton, puis effectuez un comte de spore avec un hémocytomètre. Diluer à nouveau si nécessaire pour obtenir 100 mL avec une concentration de 4 x 10⁶ spores/mL.
5. Placer les grains dans un bécher stérile de 300 mL avec une barre de remuer. Ajouter l’inoculum dans le bécher.
   Attention : Ajout des noyaux à inoculum cause solution éclabousse. Placer le bécher sur une plaque de remuer pendant 3 minutes. Après 3 minutes, égoutter inoculum dans un récipient vide.
6. À l’aide d’une pince, placer les noyaux dans le plat de biodosage (1 noyau/cap). Ajouter 30 mL désionisée au fond de chaque bac de dosage biologique et incuber à 31 ° C dans l’obscurité pendant 7 jours.
7. Préparer les noyaux pour la photographie.
   1. Mettre de côté 4 noyaux de chaque ligne pour analyse microscopique et la photographie.
      Remarque : Les amandes peuvent être stockés à 4 ° C pendant pas plus de 5 jours avant la fin de la photographie.
   2. Prendre des photos des grains après sept jours après l’inoculation avec a. flavus (Figure 3).
   3. Nettoyer l’extérieur des noyaux avec un tissu mou et l’eau désionisée. Effectuer des coupes longitudinales de cerneaux et immédiatement prendre des photos sous le microscope à fluorescence.
8. Préparer les noyaux pour l’analyse.
   1. Nettoyer l’extérieur des grains restants avec un tissu mou et l’eau désionisée.
   2. Placer 4 noyaux, constituant 1 rep, dans un polycarbonate de bouchon à vis 15 mL flacon contenant 2 boules d’acier inoxydable. Immédiatement geler les flacons dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C jusqu'à l’analyse et le traitement ultérieur.
   3. Retirer les flacons du congélateur-80 ° C et moudre les amandes dans un homogénéisateur à 1 500 tr/min pendant 3 minutes.
      Remarque : Conservez les grains gelés à l’azote liquide.

4. dépistage de la PCR de grains de maïs transgéniques

1. Utilisez le kit d’isolation de l’ADN pour isoler l’ADN génomique (Adng) de grains de maïs pulvérisés infectées par a. flavus selon les instructions du fabricant. Brièvement, ajouter 280 µL de tampon de F, 20 µL protéase et 3 µL le dithiothréitol (DTT) à 10-15 mg de grains de maïs pulvérisés. Incuber et agiter dans un thermomixer (56 ° C, 1200 tr/min, 30 min). Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min et transvaser le liquide clair surnageant dans colonne équilibré. Incuber à température ambiante pendant 3 min et centrifuger à 700 x g pendant 1 min éluer Adng.
2. Prendre 0,8 µL d’extrait Adng à mettre en place une réaction de PCR 20 µL de chaque échantillon à l’aide d’un kit PCR. Vous devez remplir les conditions cyclage thermique tel que recommandé dans le protocole du fabricant. Les conditions de la PCR incluent une étape de dénaturation initiale à 98 ° C pendant 5 min (étape 1) suivie de dénaturation à 98 ° C pendant 5 s (étape 2), recuit à 55 ° C pendant 5 s (étape 3), l’allongement à 72 ° C pendant 20 s (étape 4), 40 cycles d’étape 2 à l’étape 4 et une étape d’élongation finale à 72 ° C pendant 1 min (étape 5).
3. Utiliser l’apprêt avant 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' et inverser l’apprêt 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' pour confirmer la présence de la Lablab AILP gène dans les grains de maïs transgéniques.

5. les ARN, synthèse de cDNA et RT-PCR semi-quantitative

1. Prenez homogénéisé a. flavus infectés grains de maïs préalablement stockées à-80 ° C pour l’extraction de l’ARN. Extraire l’ARN utilisant un kit d’isolation de RNA total selon le protocole du fabricant mais avec légère modification¹⁸. Après l’ajout de 50 mg de poudre de noyau maïs homogénéisé dans le tampon d’extraction, mélangez-le bien (sans utilisation du vortex) à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et laissez-le sur glace pendant 5 à 6 minutes avant de procéder aux étapes suivantes comme décrit dans le protocole du fabricant.
2. Préparer le cDNA utilisant un kit de synthèse de cDNA selon protocole ^{18 les directives du fabricant}.
3. Utiliser 0,5 µL d’ADNc non dilué par réaction PCR pour RT-PCR semi-quantitative comme précédemment décrit¹⁸. Utiliser des amorces et inverses qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' et qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectivement à détecter Le Lablab AILP l’expression des gènes et avant et fait reculer les amorces qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ et qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ, respectivement pour l’expression du gène structural ribosomique maïs (Rib), GRMZM2G024838¹⁹ , comme un gène ménager.

6. quantification de la GFP

1. Préparation de 50 mL chacun de phosphate monobasique de sodium 0,2 M (NaH₂PO₄) et 0,2 M phosphate dibasique de sodium (Na₂HPO₄·7H₂O) dans désionisée H₂O.
2. Composent de 100 mL de tampon phosphate pH 7.0 Sorenson. Pour pH 7.0, ajouter 19,5 mL NaH₂PO₄ stock, 30,5 mL NaHPO₄·7H stock d’O₂et 50 mL eau désionisée H₂O.
3. Peser 25 mg produit de noyau broyé (poids frais, FW) et placer dans un tube de microcentrifuge de 1,0 mL. Ajouter 500 µL de tampon de phosphate au tube à centrifuger et vortexer pendant 30 s.
4. Centrifuger les échantillons pendant 15 minutes à 16 000 x g. Surnageant du pipette 100 µL dans une assiette bien noir 96. Lire les échantillons avec un fluorimètre (excitation 485 nm, émission 528 nm).

7. analyse des aflatoxines totales

1. Échantillons de traitement et aflatoxines d’extraction
   1. Des échantillons de noyau dans un four à air pulsé à sec pendant 2 jours à 60 ° C. Peser les échantillons et introduire dans un Erlenmeyer avec un bouchon en verre de 50 mL.
   2. Sous une hotte, ajouter 25 mL de chlorure de méthylène dans chaque fiole.
      Attention : Le chlorure de méthylène est très volatil et est considéré comme dangereux (cancérigène irritant,). Gants latex ni nitrile sont sûrs pour l’utilisation de chlorure de méthylène. Utiliser des gants alcool polyvinylique résistant aux solvants organiques d’améliorée.
   3. Secouez les échantillons pendant 30 min sur un agitateur oscillant. Après 30 min, verser lentement l’extrait à travers un filtre plissé cercle dans un bécher de 80 mL. Laisser sécher jusqu’au lendemain béchers dans une hotte de laboratoire.
   4. Le lendemain, squirt chlorure de méthylène (5 mL environ) autour de l’intérieur de la jante des secs béchers, tourbillonnent autour et verser dans dram 2 flacons en verre. Congé de flacons ouvrent pour sécher toute la nuit sous une hotte.
2. Analyse des aflatoxines
   1. Ajouter 4,0 mL 80 % méthanol : eau désionisée H₂O (v/v) de flacons.
   2. Utiliser un kit d’extraction d’aflatoxine pour filtrer purifier la solution méthanolique avec la colonne fournie. Analyser les niveaux d’aflatoxine totale avec un fluorimètre, selon les instructions du fabricant.

Résultats

Transformation de maïs et de criblage moléculaire des plantes transgéniques

Les embryons immatures de lignées de maïs Hi-II ont été transformées à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens EHA101 souche contenant le vecteur de destination final plante exprimant le gène AILP Lablab purpureus sous le contrôle du CaMV 35 s promoteur. Cinq lignées de maïs transformées d...

Discussion

Des pertes de rendement dans les cultures agricoles en raison des agents pathogènes et parasites est un problème mondial²⁰. Actuellement, application de pesticides et fongicides synthétiques est le moyen prédominant pour contrôle pathogènes et parasites, mais toxicité résiduelle de ces substances biochimiques dans l’alimentation humaine et animale peut constituer une menace sérieuse pour la santé humaine et animale,²¹. Compte tenu de l’importance économique d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge	Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL	Ace Glass	6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
Force Air Oven	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno/Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves	Ansell	012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker	Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL	DKW Life Sciences	14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants	Nexttec	47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera	Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera	Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes	ThermoFisher Scientific	240835
Phire Plant Direct PCR Kit	ThermoFisher Scientific	F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm	DKW Life Sciences	242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit	Sigma-Aldrich	STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer	Biotek
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
V8 juice	Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3	Fisher Scientific	09-820P
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific