Ингибирование роста Aspergillus flavus и афлатоксина производства трансгенных кукурузы выражая α-амилаза ингибиторов от Lablab пурпурный л

Резюме

Здесь мы представляем протокол для анализа роста Aspergillus flavus и производство афлатоксина в кукурузы ядра, выражая противогрибковые белка.  Мониторинг с помощью GFP-выражая A. flavus штамм мы инфекции и распространению гриба в зрелых ядра в режиме реального времени. Assay, быстрых, надежных и воспроизводимых.

Аннотация

Серьезной проблемой во всем мире является загрязнение афлатоксина в пищевых и кормовых культур. Афлатоксины, производимые гриба Aspergillus flavus (A. flavus) являются мощными канцерогенами, которые существенно снижают стоимость урожая кукурузы и богатых культур других нефти как арахисовое помимо представляет серьезную угрозу для здоровья человека и животных. Различные подходы, включая традиционной селекции, трансгенных выражение сопротивления связанных белков и РНК-интерференции (RNAi)-на основе подавления экспрессии гена хост индуцированной из критических A. flavus гена целевых объектов, оцениваются для увеличения афлатоксин сопротивление в восприимчивых культур. Последние исследования показали, что важная роль α-амилазы в производстве A. flavus патогенеза и афлатоксин, предлагая этот ген/фермент является потенциальной мишенью для снижения роста A. flavus и производства афлатоксина. В этой связи текущее исследование было проведено для оценки гетерологичных выражение Lablab пурпурный л α-амилазы ингибиторы как белка (AILP) в кукурузы против A. flavus(под контролем учредительного промотора 35S CaMV). AILP — 36 kDa белок, который конкурентный ингибитор фермента α-амилазы A. flavus и принадлежит к семейству белков Лектин arcelin-α-амилазы ингибиторы в общем бин. Исследования in vitro до текущей работы продемонстрировал роль AILP в ингибирование активности α-амилазы A. flavus и роста плесени. Микоз и производство афлатоксина в зрелых ядра были мониторинг в режиме реального времени с помощью GFP-выражая A. flavus штамм. Это ядро отбора пробы (КСА) очень проста в настройке и предоставляет данные надежных и воспроизводимых на инфекции и масштабов распространения, которые могут быть количественно для оценки зародышевой плазмы и трансгенных линий. Флуоресценции от штамма GFP тесно взаимосвязанных чтобы грибковые роста и, путем расширения, это хорошо коррелированных афлатоксина ценностям.  Цель работы текущего было осуществлять предыдущие знания в коммерчески важных культур, как кукуруза для увеличения сопротивления афлатоксина. Наши результаты показывают снижение 35-72% A. flavus роста в AILP-выражая трансгенных кукурузы ядра, которые, в свою очередь, переведены на 62% – 88% снижение уровня афлатоксина.

Введение

Контаминации, грибковых родов Aspergillus, фузариозу, Penicilliumи Alternaria является одной из основных проблем продовольствия и кормов культур во всем мире^1,2,3. Среди этих Фитопатогенные грибов Aspergillus имеет наивысший негативное воздействие на стоимость урожая и здоровье человека и животных. Aspergillus flavus (A. flavus) это оппортунистическая завод возбудителя, который заражает нефти богатых культур, таких как кукуруза, хлопковое и арахиса и производит мощный канцерогенов, афлатоксинов, а также многочисленные токсичных вторичных метаболитов (SMs). Кукуруза является важной пищей и кормить культур выращивается во всем мире и очень чувствительны к загрязнению A. flavus. Экономические последствия загрязнения афлатоксином теряет и снижение стоимости в кукурузы может быть как $686.6 млн в год в США² с прогнозируемые изменения глобального климата, воздействие афлатоксинов может привести к большей экономических потерь кукурузы с оценки как высокого как $1,68 млрд в год в ближайшем будущем². С учетом экономических и медицинских последствий афлатоксинов в организме человека и животных, управления афлатоксина до сбора урожая кукурузы может быть наиболее эффективным способом предотвратить загрязнение афлатоксина в пищевых продуктах и кормить продуктов.

Основные управления до сбора урожая подход для сопротивления афлатоксина в кукурузы, которая широко используется в последние несколько десятилетий является главным образом путем селекции, которая требует значительного количества времени⁴. Недавно биоконтроль добился определенных успехов в сокращении афлатоксина в больших масштабах поля приложения^5,6. Помимо биоконтроль применение передовых молекулярных инструменты, такие как «Хост индуцированной сайленсинга генов» (HIGS) через RNAi и трансгенных выражение сопротивления связанных белков добился определенных успехов в сокращении роста A. flavus и афлатоксина производство в небольших масштабах лабораторных и полевых исследований. Эти подходы являются в настоящее время осуществляется оптимизация Помимо выявления новых потенциальных A. flavus гена цели для будущих манипуляции.

Помимо генов, которые непосредственно участвуют в микотоксинов в качестве потенциальных целей стратегий трансгенных контроля было показано грибковых амилаз играть решающую роль в обеспечении успешного производства патогенеза и образование микотоксинов во время ранних стадиях хост завод инфекции. Несколько примеров Pythium pleroticum (возбудителя имбиря корневища гнилью), фузариозу Солани (возбудителя увяданию цветная капуста), где положительные корреляции между патогенности и α-амилазы выражение и деятельности были замечены ^7,8. Ингибирование активности α-амилазы через Нокаут гена или нокдаун подходы отрицательно сказывается на грибковые роста и токсинного производства. Α-амилазы нокаут мутантов A. flavus был не в состоянии производить афлатоксинов при выращивании на крахмал субстрата или degermed кукурузы ядра⁹. Аналогичным образом в Fusarium verticillioides штамма нокаут α-амилазы не производить Фумонизин B₁ (микотоксинов) во время инфекции кукурузы ядра¹⁰. В более недавнем исследовании Гилберт et al. (2018) показали, что на основе RNAi сбить A. flavus α-амилазы выражения через HIGS значительно сократить производство роста и афлатоксина A. flavus во время кукурузы ядра инфекции¹¹ .

Специфичные ингибиторы активности α-амилазы также дали аналогичные результаты, полученные от вниз регуляцию экспрессии α-амилазы. Первый доклад по вопросу о роли ингибитор α-амилазы в грибковых сопротивления пришли из изоляции и характеристика ингибитор трипсина α-амилазы 14-кДа из кукурузы линии устойчивы к A. flavus¹². Дальнейшего скрининга нескольких сотен видов растений Фахури и Woloshuk привели к выявлению 36 kDa белок α-амилазы ингибиторы как (AILP) из семян бобов гиацинт, пурпурный Lablab L.¹³. Пептид последовательность AILP напоминала лектинов, принадлежащих к семейству Лектин arcelin-α-амилазы ингибиторы сообщили в общем бин^14,15. Очищенный AILP не проявляют любой ингибиторная активность на млекопитающих трипсина и далее в пробирке характеристика показали значительное торможение роста A. flavus и конидиальная всхожесть¹³. Доклады, представленные здесь ясно показывает α-амилазы может служить цели управления подходов к ограничению возбудителей болезней или вредителей, которые зависят от мобилизации крахмала (через активности α-амилазы) и приобретения растворимых сахаров в качестве источника энергии во время их патогенные взаимодействие с растений-хозяев.

Альфа амилаза, как известно, быть критическим в A. flavus патогенности^9,10,11и с учетом важности AILP как мощным анти-A. flavus агент (α-амилазы ингибирование/опровергнут)¹³, Мы создали трансгенных растений кукурузы, выражая Lablab AILP гена под учредительного CaMV 35S промоутер. Целью было расследовать если гетерологичных выражение этой α-амилазы ингибиторы в кукурузу эффективна против A. flavus патогенеза и афлатоксина производства во время кукурузы ядра инфекции. Наши результаты показывают, что трансгенных кукурузы ядра, выражая AILP значительно сократить производство роста и афлатоксина A. flavus во время ядра инфекции.

протокол

1. плазмидные конструкции и кукурузы преобразования

1. PCR усиливает Lablab AILP вставить с помощью грунтовки, 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 "и 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3». Условия PCR включают первоначальный денатурации шаг на 98 ° C за 30 s (шаг 1), а затем денатурации на 98 ° C 10 s (шаг 2), отжиг при температуре 55 ° C за 30 s (шаг 3), удлинение 72 ° C для 20 s (шаг 4), 31 циклов 2 шага к шагу 4 , и окончательный удлинение шаг в 72 ° C за 5 мин клон продукт PCR в модифицированных pCAMBIA 1300 вектор с использованием Xbaя и Pstя места ограничения. Последовательность последний завод вектор назначения для подтверждения ориентацию и последовательность клонированного гена AILP в векторе.
2. Как ранее описанных ¹⁶трансформировать Agrobacterium штамм EHA101 с помощью окончательного вектора конструкции (рис. 1).
3. Использование преобразования Agrobacterium содержащие окончательный завод вектор назначения для преобразования незрелых кукурузы (Zea mays L. Hi-II) эмбрионов (выполняется в завод преобразования объекта в университете штата Айова) ¹⁶.
4. Растут T₀ растений в теплицах (26 – 29 ° C; 16/8 h фотопериода дополнена Na лампы высокого давления) и неоднократно самоопыляться получить T₆ поколения для достижения homozygosity для трансгенных черта.

2. spore всхожесть пробирного

1. Урожай листьев образцы и хранить при температуре-80 ° C. Измельчить листья образцы с ступку и пестик, с использованием жидкого азота. Весят, 0,5 г в 2 мл microcentrifuge трубы, 17 мкл ингибитора протеазы и место трубы на льду.
2. Центрифуга трубы для 10 мин на 16000 x g. Передача 225 мкл концентрированного экстракта растения 0,5 мл microcentrifuge труб и место на льду.
3. В 15 мл пластиковых пробирок Подготовьте 5 мл суспензии спор о Aspergillus flavus 70 – гена GFP в 1% картофеля декстроза бульон (w/v). Вортекс и регулировать споры до концентрации 10⁵ споры/мл с haemocytometer.
   Предупреждение: A. flavus производит афлатоксинов, все с этим грибом следует проводить в биологической безопасности кабинета.
4. Инкубируйте в PDB при 28 ° C, до тех пор, пока культура достигает 50% начала прорастания спор как указано выпячивание споры.
5. Вортекс и аликвота 25 мкл споро решения к заводе 225 мкл экстракта. Проинкубируйте образцы для 20 часов на 28 ° C, периодически встряхивая.
6. Аликвота 25 мкл раствора spore на микроскопа и мера длина зародыша трубки споры с помощью программного обеспечения цифровой камеры. Используйте как минимум 20 измерений для каждой строки.
   Примечание: На данном этапе, место всех культур на 4 ° C, чтобы остановить рост колонии до готовности для подсчета.

3. ядро отбора пробы (КСА)

1. Постройте КСА шапки склеиванием 4 заглушки оснастки (22 мм) в чашку Петри 60 x 15 мм. Дать клею высохнуть в течение 48 часов перед использованием шапки. Каждая крышка KSA является один конгрессмен (рис. 2).
2. В стерильные биологической безопасности кабинета спрей Поднос квадратный биопроб (24 x 24 см) с 70% этанол: H₂O (v/v) и пусть воздух сухой. Добавьте стерильные хроматографии бумаги в лоток. Spray 9 КСА шапки с 70% этиловом спирте, пусть воздух сухой и поместите в лоток биопроб.
3. Для каждой трансгенных кукурузы линии проходит проверку выберите 20 неповрежденных ядра и место в 50 мл пластиковых пробирок. Добавить 70% этанола и пусть сидят в течение 4 минут. Осторожно встряхните трубы во время стерилизации. Слить этанола и промыть ядра три раза в стерильных дейонизированной H₂O.
4. Подготовьте споро приостановление Aspergillus flavus 70 –¹⁷ GFP с 6 день старой культуры вырос на носителе V8 (5% сока V8, агар 2%, рН 5.2).
   1. Добавить 20 мл стерильной 0,02% Тритон X-100/деионизированная H₂O (v/v) и лом от споры с помощью стерильного цикла. Накапайте посевным материалом и место в 300 мл стерильного стакан.
   2. Подготовить 5 раз разрежения с 0,02% Тритон X-100, затем выполнить подсчет спор с haemocytometer. Разбавьте снова, если необходимо получить 100 мл с концентрацией 4 х 10⁶ споры/мл.
5. Место ядра в стерильных 300 мл стакан с баром перемешать. Добавьте стакан посевным материалом.
   Предупреждение: Добавление ядра посевным материалом вызовет решение всплеск. Поместите стакан на тарелку, перемешать на 3 минуты. После 3 минут слейте посевным материалом в пустой стакан.
6. С помощью щипцов, место ядра в bioassay блюдо (1 ядро/cap). Добавьте 30 мл деионизированной воды в нижней части каждого лотка биопроб и Инкубируйте на 31 ° C в темноте 7 дней.
7. Подготовьте ядра для фотографии.
   1. Отложите 4 ядра из каждой строки для микроскопического анализа и фотографии.
      Примечание: Ядра можно хранить при 4 ° C не более чем за 5 дней до завершения фотографии.
   2. Возьмите фотографии ядер после семи дней вакцинации с A. flavus (рис. 3).
   3. Чистые внешние ядер с мягких тканей и обессоленной воды. Выполните продольных секций ядер и немедленно принимать фотографии под флуоресцентный Микроскоп.
8. Подготовка ядра для анализа.
   1. Чистые внешние оставшихся ядер с мягких тканей и деионизированной водой.
   2. Место 4 ядра, составляющих 1 респ, поликарбонат колпачок 15 мл флакон содержащий 2 шариков из нержавеющей стали. Немедленно заморозить флаконов в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C до дальнейшей обработки и анализа.
   3. Удалить пузырьки из морозильной камеры-80 ° C и шлифуют ядра в гомогенизатор на 1500 об/мин за 3 минуты.
      Примечание: Держать ядра, заморожены жидким азотом.

4. PCR скрининг трансгенных кукурузы ядер

1. Использование ДНК изоляции комплект изолировать genomic дна (геномная ДНК) из распыленного кукурузы ядра, инфицированных A. flavus согласно инструкциям производителя. Вкратце добавьте 280 мкл буфера F, 20 мкл протеазы и 3 мкл Дитиотреитол (DTT) 10-15 мг вдувания кукурузы ядер. Инкубировать и встряхните в thermomixer (56 ° C, 1200 об/мин, 30 мин). Центрифуга на 10000 x г за 1 мин и передаче ясно супернатант уравновешенной столбец. Инкубации при комнатной температуре 3 мин и центрифуги на 700 x g за 1 мин до элюировать геномная ДНК.
2. Возьмите 0,8 мкл извлеченные геномная ДНК учредить 20 реакции PCR мкл для каждого образца, используя набор ПЦР. Следуйте thermocycling условия, как это рекомендовано в производителя протокол. Условия PCR включают первоначальный денатурации шаг на 98 ° C за 5 мин (шаг 1) следуют денатурации на 98 ° C за 5 s (шаг 2), отжиг при температуре 55 ° C за 5 s (шаг 3), удлинение 72 ° C для 20 s (шаг 4), 40 циклов 2 шага к шагу 4 и окончательный удлинение шаг в 72 ° C в течение 1 мин (шаг 5).
3. Используйте вперед грунтовка 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' и обратить вспять грунтовка 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' для подтверждения наличия Lablab AILP гена в трансгенных кукурузы ядра.

5. РНК изоляции, синтез cDNA и полуколичественных RT-PCR

1. Возьмите гомогенизированные A. flavus инфицированных кукурузы ядра, ранее хранятся при температуре-80 ° C для извлечение RNA. Извлечь РНК, с использованием всего комплекта РНК изоляции согласно протоколу производителя, но с небольшими изменениями¹⁸. После добавления 50 мг порошка гомогенизированные кукурузы ядра в буфере добычи, смешайте это хорошо (без vortexing) с помощью кончика пипетки 1 мл и оставить его на льду для 5-6 минут, прежде чем последующие шаги как описано в протоколе производителя.
2. Подготовьте cDNA, используя набор для синтеза cDNA согласно производителя протокол ¹⁸.
3. Используйте 0.5 мкл неразбавленном cDNA в реакции PCR для полуколичественного RT-PCR как ранее описанных¹⁸. Использование прямого и обратного праймеры qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' и qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' соответственно для выявления Lablab AILP экспрессии генов и вперед и обратить вспять праймеры qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ и qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ соответственно для выражения гена кукурузы рибосомных структурных (ребро), GRMZM2G024838¹⁹ как уборка ген.

6. GFP количественный

1. Подготовка 50 мл 0,2 М монокальций фосфат натрия (NaH₂PO₄) и 0,2 М двуосновной фосфат натрия (Na₂HPO₄·7H₂O) в дейонизированной H₂O.
2. Составляют 100 мл рН 7,0 Sorenson фосфатного буфера. Для рН 7,0 добавьте₂PO₄ NaH 19,5 мл бульона, 30,5 мл NaHPO₄·7H₂O фондовая и 50 мл деионизированная H₂O.
3. Весят материал ядра земли 25 мг (свежий вес, FW) и место в пробки microcentrifuge 1,0 мл. Добавьте 500 мкл рабочего раствора фосфатного буфера для пластиковых пробирок и вихрь 30 s.
4. Центрифугуйте образцы на 15 минут в 16000 x g. Накапайте 100 мкл супернатант в черный 96 хорошо плиту. Прочитайте образцы с флуориметр (возбуждения 485 Нм, выбросов 528 Нм).

7. Общая афлатоксина анализ

1. Пример обработки и афлатоксина добыча
   1. Сухие образцы ядра в духовке Принуждённая циркуляция воздуха для 2 дней при температуре 60 ° C. Взвесить образцы и место в 50 мл колбу Эрленмейера с стеклянной пробкой.
   2. В Зонта добавьте 25 мл хлористого метилена каждый флакон.
      Предупреждение: Хлорид метилена является крайне неустойчивым и считается опасным (раздражитель, канцероген). Латекс ни нитриловые перчатки являются безопасными для работы с хлорид метилена. Используйте более органических растворителей стойкие перчатки поливиниловый спирт.
   3. Встряхните образцы для 30 мин на запястье действий шейкер. После 30 мин медленно Налейте экстракт через круг рифленая Бумага фильтровальная 80 мл стакан. Пусть мензурки сухой ночлег в зонта.
   4. Следующий день, шприц Метилен хлористый (примерно 5 мл) вокруг внутри обода из сухой мензурки, вертеться вокруг и вылить в стеклянных флаконах 2 драм. Флаконов отпуск открыть для просушки в Зонта на ночь.
2. Афлатоксин анализ
   1. Добавить 4.0 мл 80% метанола: деионизированная H₂O (v/v) для флаконов.
   2. Использование набора извлечения афлатоксина для фильтрации очистки раствора метанола с заданного столбца. Анализ уровней всего афлатоксина с флуориметр, согласно инструкциям производителя.

Результаты

Кукурузы трансформации и молекулярных скрининг трансгенных растений

Незрелых зародышей кукурузы Hi-II линий были преобразованы с помощью Agrobacterium tumefaciens EHA101 штамма, содержащий последний завод назначения вектора выражения ...

Обсуждение

Потери урожая сельскохозяйственных культур вследствие патогенов и вредителей является глобальной проблемой²⁰. В настоящее время применение синтетических фунгицидов и пестицидов является преобладающим средством для контроля патогенов растений и вредителей, но остаточн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge	Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL	Ace Glass	6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
Force Air Oven	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno/Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves	Ansell	012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker	Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL	DKW Life Sciences	14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants	Nexttec	47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera	Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera	Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes	ThermoFisher Scientific	240835
Phire Plant Direct PCR Kit	ThermoFisher Scientific	F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm	DKW Life Sciences	242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit	Sigma-Aldrich	STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer	Biotek
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
V8 juice	Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3	Fisher Scientific	09-820P
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific