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요약

여기 선물이 분석 Aspergillus flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널에서 항진균 단백질을 표현 하는 프로토콜.  우리는 감염 및 실시간으로 성숙한 커널에 곰 팡이의 확산을 모니터링 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여. 분석 결과 신속 하 고 신뢰할 수 있는, 재현.

초록

아플 라 톡 신 오염 식품 및 사료 작물은 전세계 주요 도전 이다. Aflatoxins, Aspergillus flavus (A. flavus) 균에 의해 생산은 실질적으로 옥수수와 인간과 동물 건강에 심각한 위협이 포즈 외 땅콩 같은 다른 기름 풍부한 작물 자르기 값을 줄일 수 있는 강력한 발암 물질. 전통적인 번 식, 저항 관련 된 단백질과 RNA 간섭 (RNAi)의 유전자 변형 식을 포함 하 여 다른 접근-호스트 유도 유전자 침묵의 중요 한 A. flavus 기반 유전자 대상, 평가 되 고 증가 하 아플 라 톡 신 취약 작물에 저항입니다. 과거 연구 A. flavus pathogenesis 및 아플 라 톡 신 생산,이 유전자/효소 제안에 α-아 밀라 아 제의 중요 한 역할은 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산을 줄이기 위해 잠재적인 대상으로 나타났습니다. 이와 관련, 현재 연구 A. flavus에 대 한 옥수수에 Lablab purpureus L. α-아 밀라 아 제 억제제와 같은 단백질 (AILP)의 (제정 CaMV 35S 발기인 통제) 분리 식 평가에 착수 했다. AILP A. flavus α-아 밀라 제 효소의 경쟁적 억제제 이며 콩 공통 lectin-arcelin-α-아 밀라 아 제 억제 물 단백질 가족에 속하는 36 kDa 단백질 이다. 현재 작업 전에 생체 외에서 연구 A. flavus α-아 밀라 제 활동 및 곰 팡이 성장 억제에 AILP의 역할을 시연 했다. 곰 팡이 성장 및 성숙한 커널에서 아플 라 톡 신 생산 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여 실시간으로에서 감시 되었다. 이 커널 분석 (KSA) 상영은 매우 간단 합니다을 설정 하 고 germplasm 및 유전자 변형 라인의 평가 대 한 감염 및 측정할 수 있는 확산의 범위에 안정적이 고 재현 가능한 데이터를 제공 합니다. GFP 긴장에서 형광 곰 팡이를 밀접 하 게 연관 된 성장 이며, 확장 하 여, 그것은 아플 라 톡 신 값을 잘 상관.  현재 작업의 목표는 아플 라 톡 신 저항을 증가 하는 옥수수 처럼 상업적으로 중요 한 작물에서이 이전 지식을 구현 했다. 우리의 결과 표현 하는 AILP 유전자 변형 옥수수 알갱이, 차례 차례로, 아플 라 톡 신 레벨 62%-88% 감소에 번역에 A. flavus 성장에 35%-72% 감소를 보여 줍니다.

서문

Aspergillus, 강했다 Fusarium, 푸른 곰 팡이, 곰 팡이 속으로 mycotoxin 오염 식품의 중요 한 문제 이며, 사료 작물 재배 전세계1,2,3. 이러한 phytopathogenic 버섯 중 Aspergillus 자르기 값과 인간과 동물 건강에 가장 불리 한 충격이 있다. Aspergillus flavus (A. flavus)은 옥수수, 면 실 등 땅콩 기름 풍부한 작물을 감염 하 고 수많은 독성 2 차 대사 산물 (SMs) 뿐만 아니라 강력한 발암 물질, aflatoxins, 생성 한 기회주의적 식물 병원 체 이다. 옥수수는 중요 한 음식 및 전세계 재배 작물을 먹이 이며 A. flavus에의해 오염에 매우 쉽습니다. 아플 라 톡 신 오염에의 경제적 영향을 잃고 및 옥수수에 감소 값으로 686.6 백만 달러/년 미국2 예측 변화 글로벌 기후에, aflatoxins의 영향으로 옥수수에 큰 경제적 손실을 초래할 수 있습니다. 평가 높은 1.68 십억 달러/년 가까운 미래2. 인간과 가축에 aflatoxins의 불리 한 경제 및 건강 효과 감안할 때, 옥수수에 사전 수확 아플 라 톡 신 제어 식품의 아플 라 톡 신 오염 방지 제품을 공급 하는 가장 효율적인 방법을 수 있습니다.

지난 몇 십년에 광범위 하 게 사용 된 옥수수의 아플 라 톡 신 저항에 대 한 주요 사전 수확 제어 접근 시간4의 상당한 금액을 요구 하는 번 식 통해 주로 이다. 최근, biocontrol 대규모 필드 응용 프로그램5,6에서 아플 라 톡 신 감소에서 약간의 성공을 했다. Biocontrol, 게다가 최첨단 분자 도구 ' 호스트 유도 유전자 침묵 ' RNAi 통해 (HIGS) 등의 응용 프로그램 및 저항 관련 단백질의 유전자 변형 식 몇 가지 성공을 했다 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신에의 감소에 작은 규모의 실험실 및 현장 연구에 있는 생산. 이러한 접근은 현재 미래 조작 위한 새로운 잠재적인 A. flavus 유전자 표적 식별 이외에 최적화 되 고 있습니다.

유전자 유전자 변형 제어 전략의 잠재적인 대상으로 mycotoxin 생산에 직접 관련 되는, 게다가 곰 팡이 amylases 성공적인 pathogenesis 및 mycotoxin 생산 초기 단계를 유지 하는 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 호스트 공장 감염. 몇 가지 예로 Pythium pleroticum (생강 rhizome 부패의 인과 대리인), Fusarium solani (콜리플라워 윌 트의 인과 대리인), 긍정적인 상관 관계 pathogenicity와 α-아 밀라 제 식 및 활동 사이 를 관찰 했다 7,8. 유전자 녹아웃 또는 최저의 방법을 통해 α-아 밀라 제 활동의 금지는 곰 팡이 성장과 독 소 생산을 부정적인 영향을 줍니다. A. flavus 의 α-아 밀라 제 녹아웃 돌연변이 aflatoxins 전 기판 또는 degermed 옥수수 커널9에 성장 될 때 생산 하지 못했습니다. 마찬가지로, Fusarium verticillioides 에 α-아 밀라 제 녹아웃 스트레인 옥수수 커널10의 감염 시 fumonisin B1 (mycotoxin)을 생산 하지 못했습니다. 더 최근의 연구에서 길버트 외. (2018) 시연 HIGS 통해 A. flavus α-아 밀라 제 식의 아래로 RNAi 기반 노크 크게 감소 옥수수 커널 감염11 시 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 .

또한 α-아 밀라 제 활동의 특정 억제제는 α-아 밀라 제 식의 다운 레 귤 레이 션으로 비슷한 결과 생산 했습니다. 곰 팡이 저항에는 α-아 밀라 아 제 억제제의 역할에 첫 번째 보고서는 분리와 옥수수 라인 저항 A. flavus12에서 14 kDa 트립 신-α-아 밀라 아 제 억제제의 특성에서 왔다. 더 Lablab purpureus L.13, 히 아 신 스 콩의 씨앗에서 Fakhoury 및 Woloshuk 36 kDa α-아 밀라 아 제 억제제와 같은 단백질 (AILP)의 식별에 의해 식물 종의 수백의 상영. Lectin-arcelin-α-아 밀라 아 제 억제 물 가족에 속하는 AILP 닮은 lectins의 펩 티 드 순서 일반적인 콩14,15보고. 순화 AILP 포유류 trypsin 및 A. flavus 성장 및 conidial 발 아13의 중요 한 금지를 보여주었다 생체 외에서 특성 추가 금지 행위를 발생 하지 않습니다. 제시 하는 보고서 여기 명확 하 게 쇼 α-아 밀라 제 역할을 할 수 제한 하는 병원 체 또는 전 분 (α-아 밀라 제 활동)을 통해 동원 및 중 에너지 원으로 녹는 설탕의 수집에 의존 하는 해충을 제어 방식에서 대상 들 호스트 식물 병원 성 상호 작용입니다.

알파-아 밀레이 스 A. flavus pathogenicity9,,1011, 그리고 강력한 안티-A. flavus 에이전트 (α-아 밀라 제 억제/antigrowth)13, AILP의 중요성을 감안할 때 중요 한 것으로 알려져 있다 Lablab AILP 을 표현 하는 유전자 변형 옥수수 식물 생성 제정 CaMV 35S 발기인에서 유전자. 목표는 옥수수에이 α-아 밀라 아 제 억제 물의 분리 표현식이 A. flavus pathogenesis 및 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널 감염에 대 한 효과 조사 했다. 우리의 결과 AILP를 크게 표현 하는 유전자 변형 옥수수 커널 커널 감염 시 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 감소를 보여 줍니다.

프로토콜

1. 플라스 미드 구조와 옥수수 변환

  1. PCR 증폭 Lablab AILP 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 '와 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3' 뇌관을 사용 하 여 삽입. PCR 조건 포함 30 98 ° C에 초기 변성 단계 s (1 단계), 뒤에 98 ° C 10에서 변성 s (2 단계), 55 ° C 30에서 어 닐 링 s (3 단계), 신장 20 72 ° C에서 s (4 단계), 4 단계로 2 단계 31 주기 그리고 내가 및 Pst최종 신장 5 분 수정된 pCAMBIA 1300으로 PCR 제품 벡터 Xba를 사용 하 여 복제를 위한 72 ° C에 단계 나 제한 사이트. 방향 벡터에서 복제 한 AILP 유전자의 순서를 확인 하는 최종 공장 대상 벡터 시퀀스입니다.
  2. 앞서 설명한 16 Agrobacterium 스트레인 EHA101 최종 벡터 구조 (그림 1)으로 변환 합니다.
  3. 사용 변형 Agrobacterium 최종 공장 대상 벡터 포함 된 미 숙 옥수수 (지 시 메이 스 L. 안녕 II) 배아 (식물 변환 시설의 아이오와 주립 대학에서 수행)을 변환할 16.
  4. T0 식물 (26-29 ° C, 16/8 h photoperiod 고압 나 램프 보충) 온실에서 성장 하 고 반복적으로 달성 homozygosity 유전자 변형 특성에 대 한 T6 세대를 self-pollinate.

2. 포자 발 아 시험

  1. 잎 샘플을 수확 하 고-80 ° c.에 저장 박격포와 유 봉 액체 질소를 사용 하 여 리프 샘플을 갈기. 2 mL microcentrifuge 튜브에 0.5 g으로 무게를 다 십시오, protease 억제제의 17 µ L을 추가 하 고 얼음에 튜브를 배치.
  2. 튜브 16000 x g에서 10 분 원심 식물 추출 물 0.5 mL microcentrifuge 관에 225 µ L를 전송 하 고 얼음에 놓습니다.
  3. 15 mL 원심 분리기 튜브에서 Aspergillus flavus 70-1% 감자 포도 당 국물 (w/v)에 GFP의 5 mL 포자 현 탁 액을 준비 합니다. 와 동5 포자/10ml를 haemocytometer와 하 포자 농도 조정 하 고.
    주의: A. flavus aflatoxins 생산, 생물 안전 캐비닛에이 곰 팡 두 일을 지휘 한다.
  4. 품 어 PDB에 28 ° C에서 문화 달성 50% 개시의 포자 발 아 포자의 불 룩 한으로 표시 될 때까지.
  5. 소용돌이 225 µ L 공장 aliquot 25 µ L 포자 솔루션 추출합니다. 간헐적으로 떨고와 28 ° C에서 20 시간에 대 한 샘플을 품 어.
  6. 현미경 슬라이드 및 측정 길이 세균의 포자 솔루션의 aliquot 25 µ L 튜브 포자 디지털 카메라 소프트웨어를 사용 하 여 합니다. 20 복제 측정의 최소를 사용 하 여 각 라인에 대 한.
    참고:이 단계에서 계산에 준비까지 식민지 성장을 중지 하 4 ° C에서 모든 문화를 배치 합니다.

3입니다. 커널 분석 (KSA) 결과 심사

  1. 60 x 15 mm 페 트리 접시에 4 스냅 캡 (22 m m)를 접착 하 여 KSA 모자를 생성 합니다. 접착제 모자를 사용 하기 전에 48 H 동안 건조를 허용 합니다. 각 KSA 모자 한 의원 (그림 2)를 구성합니다.
  2. 메 마른 생물 안전 캐비닛에서 70% 에탄올: H2O (v/v) 사각형 검정 트레이 (24 x 24cm)를 스프레이 하 고 공기 건조를 보자. 살 균 크로마토그래피 용지 트레이를 추가. 9 KSA 캡 70% 에탄올 스프레이, 공기 건조, 검정 쟁반에.
  3. 테스트 중인 각 유전자 변형 옥수수 줄, 20 손상 되지 않은 커널 선택 하 고 50 mL 원심 분리기 튜브에. 70% 에탄올을 추가 하 고 4 분 동안 앉아 보자. 부드럽게 살 균 동안 튜브를 흔들. 부 세 번 살 균 이온된 H2o.에서에서 에탄올과 린스 커널 어
  4. Aspergillus flavus 70-6 일 오래 된 문화에서 GFP17 V8 매체 (5% 쥬 스 V8, 2 %agar, pH 5.2)에서 자란의 포자 현 탁 액을 준비 합니다.
    1. 20 mL 살 균 0.02% 트리톤 X-100/이온된 H2O (v/v)을 추가 하 고 메 마른 루프와 포자에서 스크랩. 피펫으로 inoculum와 300 mL의 멸 균 비 커에 장소.
    2. 0.02와 5 희석 준비 % 트라이 톤 X-100 포자 수는 haemocytometer로 수행. 4 x 106 포자/mL의 농도로 100 mL를 얻기 위해 필요한 경우에 다시 희석.
  5. 저 어 바 살 균 300 mL 비 커에 커널 넣습니다. 비 커에 inoculum을 추가 합니다.
    주의: 솔루션 시작을 하면 inoculum을 커널에 추가 됩니다. 3 분 저 어 접시에 비 커를 놓습니다. 3 분 후 빈 비 커에 inoculum을 붓는 다.
  6. 집게를 사용 하 여 커널 검정 접시 (1 커널/모자)에 배치 합니다. 30 mL 각 검정 트레이 하단에 저온 및 7 일 동안 어둠 속에서 31 ° C에 품 어 추가 합니다.
  7. 사진에 대 한 커널 준비.
    1. 현미경 분석 및 사진에 대 한 각 줄에서 옆으로 4 커널 설정 합니다.
      참고: 커널 4 ° C에서 사진 촬영을 완료 하기 전에 5 일 보다는 더 이상 저장할 수 없습니다.
    2. A. flavus (그림 3)와 함께 접종 7 일 후에 커널의 사진을 찍을.
    3. 연 조직 및 이온된 수 커널 깨끗 한 외관. 중심부의 경도 섹션을 수행 하 고 즉시 형광 현미경 사진 촬영.
  8. 커널 분석에 대 한 준비.
    1. 연 조직 및 이온된 수와 나머지 커널 깨끗 한 외관.
    2. 1 담당자 15 mL 나사 모자 폴 리 카보 네이트에 구성 장소 4 커널 유리병 포함 2 스테인레스 스틸 볼 즉시 추가 처리 및 분석까지 액체 질소와-80 ° C에 게 튜브를 고정 합니다.
    3. -80 ° C 냉동 고에서 튜브를 제거 하 고 3 분 1500 rpm에서 균질 화기에 커널 갈기.
      참고: 커널에서 액체 질소로 냉동 보관.

4. PCR 검사 유전자 변형 옥수수 커널

  1. A. flavus 제조업체의 지침에 따라 감염 분쇄 옥수수 커널에서 DNA 분리 kit genomic DNA (gDNA)을 사용 합니다. 간단히, 분쇄 옥수수 알갱이의 10-15 mg 280 µ L 버퍼 F, 20 µ L 효소, 및 3 µ L dithiothreitol (DTT)을 추가 합니다. 품 어 그리고 thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 분)에 흔들. 1 분 x 10000 g에서 centrifuge 고 맑은 상쾌한 equilibrated 열 전송. 3 분을 elute gDNA를 1 분 동안 700 x g 에서 원심 분리기 실 온에서 품 어.
  2. 추출 된 gDNA 20 µ L PCR 반응에서 PCR 키트를 사용 하 여 각 샘플에 대 한 설정의 0.8 µ L를 가져가 라. 제조 업체의 프로토콜에서 권장 thermocycling 조건을 따릅니다. PCR 조건 포함 뒤에 98 ° C 5에서 변성 98 ° C 5 분 (1 단계)에서 초기 변성 단계 s (2 단계), 55 ° C 5에서 어 닐 링 s (3 단계), 신장 20 72 ° C에서 s (4 단계), 4 단계로 2 단계 40 주기 그리고 1 분 (5 단계)를 위한 72 ° C에서 최종 신장 단계.
  3. 앞으로 뇌관 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3를 사용 하 여 ' 반전 뇌관 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' Lablab AILP 의 존재를 확인 유전자 변형 옥수수 커널에서 유전자.

5. RNA 격리, cDNA 합성 및 반 정량적 RT-PCR

  1. 받아 무 균 A. flavus 감염 옥수수 커널 이전 RNA 추출-80 ° C에 저장. 하지만 약간의 수정18제조업체의 프로토콜에 따라 총 RNA 격리 키트를 사용 하 여 RNA를 추출 합니다. 추출 버퍼에 무 균된 옥수수 커널 분말의 50 밀리 그램을 추가, 그것은 잘 (vortexing) 없이 1 mL 피펫으로 팁을 사용 하 여 혼합 하 고에 두고 얼음 진행 하기 전에 5-6 분에 대 한 이후 단계 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로.
  2. CDNA 제조업체의 프로토콜 18따라 cDNA 합성 키트를 사용 하 여 준비 합니다.
  3. 반 정량적 RT-PCR에 대 한 PCR 반응 당 undiluted cDNA의 0.5 µ L를 사용 하 여 앞서 설명한18로. 정방향 및 역방향 뇌관 qAILP F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3를 사용 하 여 '와 qAILP-R 5'-CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA-3' 각각 Lablab AILP 유전자 발현을 검출 하 고 전달 하 고 프라이 머 qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ와 qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ 옥수수 ribosomal 구조 유전자 (리브), GRMZM2G02483819 집 유지 유전자로 표현 위한 각각.

6. GFP 정량

  1. 50 mL를 각각 0.2 M 이수소 나트륨 인산 염 (NaH2포4) 0.2 M 염기 나트륨 인산 염 (Na2HPO4·7H2O) 이온된 H2o.에서에서의 준비
  2. PH 7.0 소 렌 슨의 인산 염 버퍼의 100 mL을 확인 합니다. PH 7.0, 추가 19.5 mL NaH2포4 주식, 30.5 mL NaHPO4·7H2O 주식, 및 50 mL 이온된 H2o.
  3. 그리고 25 mg 지상 커널 자료 (신선한 무게, FW) 밖으로 무게 1.0 mL microcentrifuge 튜브에. 원심 분리기 튜브와 30에 대 한 소용돌이에 500 µ L 인산 버퍼를 추가 s.
  4. 샘플 16000 x g에서 15 분간 원심. 블랙 96 잘 접시에 피펫으로 100 µ L 상쾌한. Fluorometer (여기 485 nm, 방출 528 nm)와 샘플을 읽을.

7. 총 아플 라 톡 신 분석

  1. 샘플 처리 및 아플 라 톡 신 추출
    1. 60 ° c.에 2 일 동안 공기 오븐에서 건조 커널 샘플 및 샘플 무게 50 mL 유리 스 토퍼와 삼각 플라스 크에.
    2. 증기 두건에서 각 플라스 크에 염화 메 틸 렌 25 mL를 추가 합니다.
      주의: 염화 메 틸 렌 높은 휘발성 이며 유해 (자극성, 발암 물질)으로 간주 됩니다. 라텍스도 니트 릴 장갑 염화 메 틸 렌 작업에 안전 하다. 사용 하 여 향상 된 유기 용 매 저항 PolyVinylAlcohol 장갑.
    3. 손목 동작 셰이 커에 30 분에 대 한 샘플을 흔들어. 30 분 후에 천천히 붓고 추출 피리 필터 종이 원을 통해 80 mL 비 커. 증기 두건에서 비 커 마른 하룻밤 보자.
    4. 다음 날, 메 틸 렌 염화 물 (약 5 mL) 내부 주위 물 총 건조 비 커의 테두리, 소용돌이, 2 dram 유리 튜브에 붓는 다. 두고 튜브는 증기 두건에서 하룻밤 건조 하 열.
  2. 아플 라 톡 신 분석
    1. 4.0 mL 80% 메탄올을 추가: 이온 H2O (v/v) 튜브.
    2. 필터링 하는 아플 라 톡 신 추출 키트를 사용 하 여 제공 된 열과 메탄올 솔루션 정화. 제조업체의 지침에 따라 fluorometer와 총 아플 라 톡 신 수준 분석.

결과

옥수수 변환 및 유전자 변형 식물의 분자 검사

옥수수이 II 라인의 미 성숙한 배아 최종 공장 대상 벡터 CaMV 35S 의 통제 Lablab purpureus AILP 유전자 표현 포함 Agrobacterium tumefaciens EHA101 긴장을 사용 하 여 변형 되었다 발기인입니다. 5 독립적으로 변형 된 옥수수 라인 후속 연구에 대 한 t 6 세대...

토론

병원 균과 해충 농업 작물에서 수확량 손실 글로벌 문제20이다. 현재, 합성 살 균 제와 살충제의 응용 프로그램 제어 식물 병원 균과 해충에 대 한 주된 수단 이지만 이러한 바이오 식품 및 사료의 잔류 독성21인간과 동물 건강 심각한 위협을 제기할 수 있다. 식품 및 사료 작물 옥수수의 경제 중요성, 고려에 감소 또는 아플 라 톡 신 오염 제거 가장 중요

공개

저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

감사의 말

우리는 데이비드 Meints, 알칸사 스의 대학 초기 세대 중 유전자 변형 옥수수를 분석에 그의 원조에 대 한 감사 합니다. 이 작품 미국 농 무부-ARS 크리스틴 프로젝트 6054-42000-025-00D의 재정 지원을 받았다. 상호 또는이 문서에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부-ARS의 동등한 고용 기회 (EEO) 정책 모든 사람을 위한 기회 균등을 명령 하 고 기관의 인사 정책, 관행 및 작업의 모든 측면에서 차별 금지.

자료

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참고문헌

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