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Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de crescimento de Aspergillus flavus e produção de aflatoxinas em grãos de milho expressar uma proteína antifúngica.  Estamos usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus monitorado a infecção e a propagação do fungo em sementes maduras em tempo real. O ensaio é rápido, confiável e reprodutível.

Resumo

Contaminação por aflatoxinas em culturas alimentares e alimentos para animais é um grande desafio em todo o mundo. As aflatoxinas, produzidas pelo fungo Aspergillus flavus (a. flavus) são potentes agentes cancerígenos que reduzem substancialmente o valor das culturas de milho e outras culturas de óleo rico como amendoim além de posar uma ameaça grave para a saúde humana e animal. Diferentes abordagens, incluindo tradicionais de reprodução, expressão transgênica da resistência associada a proteínas e RNA de interferência (RNAi)-com base induzida pelo anfitrião silenciamento de crítica a. flavus alvos de gene, estão sendo avaliados para aumentar resistência de aflatoxina em culturas sensíveis. Após estudos têm mostrado um importante papel de α-amilase em produção de patogênese e aflatoxina a. flavus , sugerindo que este gene/enzima é um alvo potencial para reduzir o crescimento da . flavus e produção de aflatoxina. A este respeito, o atual estudo foi realizado para avaliar uma expressão heteróloga (sob controle do promotor constitutivo CaMV 35S ) de uma proteína de como inibidor de α-amilase Lablab purpureus L. (AILP) no milho contra a. flavus. AILP é uma proteína de 36-kDa, que é um inibidor competitivo da enzima α-amilase da . flavus e pertence à família de proteína lectina – arcelin – α-amilase inibidor em comum feijão. Estudos in vitro, antes do trabalho atual tinham demonstrado o papel de AILP na inibição da atividade de α-amilase da . flavus e crescimento fúngico. Crescimento de fungos e produção de aflatoxina em grãos maduros foram monitorados em tempo real usando uma estirpe de GFP-expressando a. flavus . Este kernel triagem ensaio (KSA) é muito simples de configurar e fornece dados confiáveis e reprodutíveis na infecção e a extensão da propagação que pode ser quantificada para avaliação de germoplasma e linhas transgénicas. A fluorescência da estirpe GFP é estreitamente correlacionados com fungal crescimento e, por extensão, é bem correlacionado aos valores de aflatoxina.  O objetivo do trabalho atual foi implementar esse conhecimento anterior em uma colheita comercialmente importante como milho para aumentar a resistência de aflatoxina. Nossos resultados mostraram uma redução de 35% e 72% no crescimento da . flavus em sementes de milho transgênicos AILP-expressando que, por sua vez, traduzida em uma redução de 62% e 88% nos níveis de aflatoxina.

Introdução

Contaminação por micotoxinas pelos gêneros de fungos, Aspergillus, Fusarium, Penicilliume Alternaria é um grande problema de alimentos e alimentação de culturas cultivadas em todo o mundo1,2,3. Entre estes fungos fitopatogênicos, Aspergillus tem o maior impacto adverso na saúde humana e animal e o valor de colheita. Aspergillus flavus (A. flavus) é um patógeno oportunista planta que infecta rico oleaginosas tais como o milho, caroço de algodão e de amendoim e produz os potentes carcinógenos, aflatoxinas, bem como numerosos metabólitos secundários tóxicos (SMs). Milho é um alimento importante e alimenta das culturas cultivadas em todo o mundo e é altamente suscetível à contaminação pela . flavus. O impacto econômico da contaminação por aflatoxinas em perde e valor reduzido no milho pode ser tanto quanto $ 686,6 milhões/ano no EUA2 com previstas alterações no clima global, o impacto de aflatoxinas pode resultar em maiores perdas económicas no milho com estimativas tão elevadas quanto $ 1,68 bilhões/ano no futuro próximo2. Tendo em conta os efeitos adversos econômicos e saúde de aflatoxinas em humanos e animais, controle pré-colheita aflatoxina no milho pode ser a maneira mais eficiente para prevenir a contaminação por aflatoxinas em alimentos e produtos de alimentação.

A abordagem de controle pré-colheita principal para a resistência de aflatoxina em milho que tem sido amplamente utilizado nas últimas décadas é principalmente por meio de reprodução, que requer uma quantidade significativa de tempo4. Recentemente, a biocontrol teve algum sucesso na redução de aflatoxina em grande escala campo aplicações5,6. Além de biocontrole, aplicação de ferramentas moleculares de ponta como 'Host induzidas pelo silenciamento de genes' (HIGS) através de RNAi e transgênico expressão de proteínas associadas a resistência tem tido algum sucesso na redução do crescimento da . flavus e a aflatoxina produção em estudos de laboratório e de campo de pequena escala. Essas abordagens são atualmente sendo otimizadas além de identificar novos alvos potenciais do gene a. flavus para manipulação futura.

Além de genes que estão diretamente envolvidos na produção de micotoxinas como alvos de estratégias de controle de transgênicos, amilases de fungosas têm sido mostradas para desempenhar um papel crítico na manutenção de uma produção bem sucedida de patogênese e micotoxinas durante as fases iniciais de infecção de planta do anfitrião. Alguns exemplos incluem Pythium pleroticum (agente causal da podridão do rizoma de gengibre), Fusarium solani (agente causal da murcha de couve-flor), onde a correlação positiva entre a expressão de patogenicidade e α-amilase e atividade foram observadas 7,8. Inibição da atividade de α-amilase através de gene nocaute ou abordagens "knockdown" afeta negativamente a produção de crescimento e toxina fúngica. Um mutante de nocaute de α-amilase da . flavus foi incapaz de produzir aflatoxinas quando cultivadas em amido substrato ou degermed grãos de milho9. Da mesma forma, em Fusarium verticillioides uma estirpe de nocaute de α-amilase não conseguiu produzir fumonisina B1 (micotoxinas) durante a infecção de sementes de milho,10. Em um estudo mais recente, Gilbert et al. (2018) demonstraram que uma baseada em RNAi derrubar de expressão de α-amilase a. flavus através de HIGS reduziu significativamente a. flavus produção crescimento e aflatoxina durante a infecção de milho do kernel11 .

Inibidores específicos da atividade de α-amilase também produziram resultados semelhantes como obtido para baixo-regulação da expressão de α-amilase. O primeiro relatório sobre o papel de um inibidor de α-Amilase fúngica resistência veio o isolamento e caracterização de um inibidor de tripsina-α-amilase 14-kDa de linhagens de milho resistentes à . flavus12. Rastreio suplementar de várias centenas de espécies de plantas por Fakhoury e Woloshuk levado à identificação de uma proteína de como inibidor de α-amilase 36-kDa (AILP) das sementes de feijão de hyacinth, Lablab purpureus L.13. A sequência do peptídeo de lectinas AILP se assemelhava, pertencente à família de inibidor de lectina – arcelin – α-amilase em comum relatado feijão14,15. AILP purificado não apresentam qualquer atividade inibitória para mamíferos tripsina e mais in-vitro caracterização mostraram inibição significativa do crescimento da . flavus e germinação conidiais13. Os relatórios apresentados aqui claramente, shows de α-amilase pode servir como um alvo em abordagens de controle para restringir patógenos ou pragas que dependem de mobilização do amido (através da atividade de α-amilase) e aquisição de açúcares solúveis, como fonte de energia durante a sua patogénica interação com as plantas hospedeiras.

Alfa-amilase é conhecido por ser crítico na . flavus patogenicidade9,10,11e dada a importância do AILP como um potente antia. flavus agente (inibição/antigrowth α-amilase)13, geramos plantas de milho transgênicas expressando Lablab AILP gene sob o promotor constitutivo de CaMV 35S. O objetivo foi investigar se a expressão heteróloga deste inibidor de α-amilase no milho é eficaz contra a produção da . flavus patogênese e aflatoxina durante a infecção de milho do kernel. Nossos resultados demonstram que sementes de milho transgênicos expressando AILP significativamente reduziram a. flavus produção crescimento e aflatoxina durante a infecção do kernel.

Protocolo

1. plasmídeo construções e transformação de milho

  1. PCR amplificar Lablab AILP inserir usando as primeiras demão 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'e 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. As condições PCR incluem uma etapa de desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s (etapa 1), seguido por desnaturação a 98 ° C, durante 10 s (etapa 2), recozimento a 55 ° C por 30 s (etapa 3), alongamento a 72 ° C, durante 20 s (etapa 4), 31 ciclos da etapa 2 para o passo 4 , e um alongamento final passo a 72 ° C por 5 min. Clone do produto do PCR em um pCAMBIA modificado 1.300 vetor usando Xba Pste eu locais da limitação. O vetor de destino final da planta para confirmar a orientação e a sequência do gene AILP clonado no vetor de sequência.
  2. Transforme o Agrobacterium estirpe EHA101 com a construção de vetor final (Figura 1) como anteriormente descrito, 16.
  3. Uso transformado Agrobacterium contendo o vetor de destino final da planta para transformar embriões imaturos de milho (Zea mays L. Hi-II) (realizados na planta transformação facilidade da Iowa State University) 16.
  4. Crescer T0 plantas na estufa (26 – 29 ° C, fotoperíodo de 16/8 h, suplementado com at-lâmpadas de alta pressão) e self-pollinate repetidamente para obter geração de6 T para atingir a homozigotia para o traço de transgénico.

2. ensaio de germinação dos esporos

  1. Colheita de amostras de folha e armazenar a-80 ° C. Moa as amostras de folha com um almofariz e um pilão usando nitrogênio líquido. Pesar 0,5 g em tubos de microcentrifuga de 2 mL, adicionar 17 µ l de inibidor da protease e colocar os tubos em gelo.
  2. Centrifugar tubos por 10 min a 16.000 x g. Transfira a 225 µ l do extrato da planta para tubos de microcentrifuga de 0,5 mL e no gelo.
  3. Em um tubo de centrífuga de 15 mL, prepare uma suspensão de esporos de 5ml de Aspergillus flavus 70-GFP em caldo de dextrose de batata 1% (p/v). Vórtice e ajustar a concentração de esporos a 105 esporos/mL com um haemocytometer.
    Atenção: A. flavus produz aflatoxinas, todo o trabalho com este fungo deve efectuar-se em uma câmara de segurança biológica.
  4. Incube em PDB a 28 ° C até cultura atinge 50% início de germinação dos esporos conforme indicado pelo abaulamento de esporos.
  5. Extraem o vórtice e a alíquota 25 µ l de esporos solução a planta 225 µ l. Incube as amostras por 20 horas a 28 ° C, com agitação intermitente.
  6. Alíquota 25 µ l de solução de esporos em um microscópio e medida do comprimento do germe tubos esporos usando o software da câmera digital. Use um mínimo de 20 medições replicar para cada linha.
    Nota: Nesta fase, Coloque todas as culturas a 4 ° C para parar o crescimento da colônia até estar pronto para contar.

3. o kernel triagem ensaio (KSA)

  1. Construa as tampas KSA por colagem 4 tampas de snap (22 mm) em uma placa de Petri 60 x 15 mm. Permitir que a cola secar durante 48 H antes de usar tampões. Cada tampa KSA constitui um Rep (Figura 2).
  2. Um estéril de segurança microbiológica, pulverize uma bandeja de bioensaio quadrada (24 cm x 24 cm) com 70% de etanol: H2O (v/v) e deixar o ar seco. Adicione papel para cromatografia estéril para a bandeja. Pulverizador 9 bonés KSA com etanol a 70%, deixe o ar seco e coloque na bandeja de bioensaio.
  3. Para cada linha de milho transgénica sendo testada, selecione 20 sementes defeituosas e coloque em um tubo de centrífuga de 50 mL. Adicionar etanol a 70% e deixe descansar por 4 minutos. Agite os tubos durante a esterilização. Despeje os kernels de etanol e enxaguar três vezes em desionizada estéril H2O.
  4. Prepare uma suspensão de esporos de Aspergillus flavus 70-GFP17 de uma cultura de 6 dia de idade cultivadas em meio de V8 (5% de suco V8, 2% de ágar, pH 5.2).
    1. Adicionar 20 mL estéril 0.02% Triton X-100/desionizada H2O (v/v) e sucata de esporos com uma ansa estéril. Pipetar fora o inóculo e coloque num copo de 300 mL estéril.
    2. Preparar uma 5-fold diluição com 0,02% Triton X-100, em seguida, executar uma contagem de esporos com um haemocytometer. Dilua novamente se necessário para obter 100 mL com uma concentração de 4 x 106 esporos/mL.
  5. Coloque o miolo em um copo de 300ml esterilizado com uma barra de agitação. Adicione o inóculo para o copo.
    Cuidado: Adicionar miolo de inóculo fará com solução de respingo. Colocar o copo num prato misture por 3 minutos. Após 3 minutos, despeje inóculo para um copo vazio.
  6. Usando uma pinça, coloque o miolo no prato de bioensaio (1 do kernel/tampão). Adicione 30 mL deionizada à parte inferior de cada bandeja de bioensaio e incubar a 31 ° C, no escuro, durante 7 dias.
  7. Prepare sementes para a fotografia.
    1. Reserve 4 núcleos de cada linha para análise microscópica e fotografia.
      Nota: O miolo pode ser armazenado a 4 ° C, para não mais do que 5 dias antes de completar a fotografia.
    2. Tire fotos de kernels após sete dias de inoculação com a. flavus (Figura 3).
    3. Limpo exterior de kernels com um tecido macio e água deionizada. Executar cortes longitudinais de kernels e imediatamente tirar fotografias ao microscópio fluorescente.
  8. Prepare sementes para análise.
    1. Exterior limpo de kernels restantes com um tecido macio e água deionizada.
    2. Coloque 4 núcleos, constituindo 1 representante, de um policarbonato e tampa de rosca 15 mL frasco contendo 2 bolas de aço inoxidável. Congele imediatamente frascos em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C até posterior processamento e análise.
    3. Remover os frascos de-80 ° C congelador e moer grãos em um homogeneizador a 1.500 rpm por 3 minutos.
      Nota: Mantenha o miolo congelado com nitrogênio líquido.

4. rastreio de PCR de sementes de milho transgênicos

  1. Use o kit de isolamento do DNA para isolar o DNA genômico (gDNA) de grãos de milho pulverizados infectados com a. flavus , de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, adicione 280 µ l buffer F, 20 protease µ l e 3 µ l ditiotreitol (DTT) de 10-15 mg de grãos de milho pulverizados. Incubar e agitar em um thermomixer (56 ° C, 1.200 rpm, 30 min). Centrifugar a 10.000 x g por 1 min e transferir o sobrenadante claro para coluna equilibrada. Incube a temperatura ambiente por 3 min e centrifugar a 700 x g por 1 min eluir gDNA.
  2. Leve 0,8 µ l de gDNA extraído para configurar uma reação de PCR 20 µ l de cada amostra, usando um kit PCR. Siga as condições thermocycling como recomendado no protocolo do fabricante. As condições PCR incluem uma etapa de desnaturação inicial a 98 ° C por 5 min (etapa 1), seguida por desnaturação a 98 ° C por 5 s (etapa 2), recozimento a 55 ° C por 5 s (etapa 3), alongamento a 72 ° C, durante 20 s (etapa 4), 40 ciclos da etapa 2 para o passo 4 e uma etapa de alongamento final a 72 ° C, durante 1 min (passo 5).
  3. Use para a frente da primeira demão 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' e reverter a primeira demão 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' para confirmar a presença do Lablab AILP gene nos kernels milho transgénicos.

5. RNA isolamento, síntese do cDNA e RT-PCR semi-quantitativa

  1. Tome homogeneizado a. flavus infectado milho miolo previamente armazenado a-80 ° C para a extração de RNA. Extraia o RNA usando um kit de isolamento do RNA total de acordo com o protocolo do fabricante, mas com ligeira modificação18. Depois de adicionar 50 mg de pó homogeneizada do kernel milho no buffer de extração, misture bem (sem a utilização do Vortex) usando uma ponta da pipeta de 1 mL e deixá-lo no gelo por 5-6 minutos antes de prosseguir para as etapas subsequentes conforme descrito no protocolo do fabricante.
  2. Prepare o cDNA usando um kit de síntese do cDNA de acordo com protocolo 18 do fabricante.
  3. Utilize 0,5 µ l de cDNA não diluído por reação de PCR por RT-PCR semi-quantitativa como anteriormente descrito,18. Use as primeiras demão para diante e reverso qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' e qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectivamente para detectar a expressão do gene Lablab AILP e para a frente e reverter as primeiras demão qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ e qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ, respectivamente, à manifestação de milho gene ribosomal estrutural (costela), GRMZM2G02483819 , como um gene de manutenção da casa.

6. quantificação de GFP

  1. Preparar 50 mL cada de 0,2 M de fosfato monobásico de sódio (NaH2PO4) e fosfato de sódio dibásico 0,2 M (Na2HPO4·7H2O) em desionizada H2O.
  2. Compõem-se 100 mL de tampão de fosfato do pH 7.0 Sorenson. Para pH 7,0, adicione 19,5 mL NaH2PO4 caldo, 30,5 mL NaHPO4·7H estoque de O2e 50 mL de água deionizada H2O.
  3. Pesar 25 mg terra do kernel material (peso fresco, FW) e coloque em um tubo de microcentrifugadora de 1,0 mL. Adicionar tampão de fosfato 500 µ l para o tubo de centrifugação e vórtice por 30 s.
  4. Centrifugar as amostras durante 15 minutos a 16.000 x g. Sobrenadante µ l de Pipetar 100 em uma placa bem preto 96. Leia as amostras com um dados (excitação 485 nm, emissão 528 nm).

7. análise de aflatoxina total

  1. Processamento e aflatoxina extração de amostra
    1. Secar as amostras do kernel em um forno de ar forçado por 2 dias a 60 ° C. Amostras de pesar e colocar em um frasco de Erlenmeyer com uma rolha de vidro de 50 mL.
    2. Em uma coifa, adicione cloreto de metileno 25 mL para cada frasco.
      Cuidado: Cloreto de metileno é altamente volátil e é considerado perigoso (irritativa, cancerígeno). Luvas de nitrilo nem látex são seguras para trabalhar com cloreto de metileno. Use o melhor luvas de PolyVinylAlcohol resistentes a solventes orgânicas.
    3. Agite amostras durante 30 min num agitador de acção do pulso. Após 30 min, lentamente despeje o extrato através de um círculo de papel de filtro de pregas em um copo de 80 mL. Deixe a béquer secar durante a noite em uma coifa.
    4. No dia seguinte, esguinchar cloreto de metileno (cerca de 5 mL) em torno do interior da borda de copos a seco, giram em torno e despeje em frascos de vidro de 2 dram. Frascos de deixar aberto para secar em uma coifa durante a noite.
  2. Análise de aflatoxina
    1. Adicionar 4,0 mL 80% de metanol: água deionizada H2O (v/v) para tubos de ensaio.
    2. Usar um kit de extração de aflatoxinas para filtrar purificar solução de metanol com a coluna fornecida. Analise os níveis de aflatoxinas totais com um dados, de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Transformação de milho e triagem molecular de plantas transgênicas

Os embriões imaturos de linhagens de milho Hi-II foram transformados usando estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA101 contendo o vetor de destino final planta expressando o gene AILP Lablab purpureus sob o controle dos CaMV 35S promotor. Cinco linhas de milho independente transformadas eram avançadas par...

Discussão

As perdas de rendimento em culturas agrícolas devido a pragas e patógenos é um problema global de20. Atualmente, a aplicação de fungicidas sintéticas e pesticidas é o predominante para controlar patógenos vegetais e pragas, mas toxicidade residual destes compostos bioquímicos na alimentação humana e animal pode representar uma ameaça grave para a saúde humana e animal21. Considerando a importância econômica do milho como comida e cultura alimentar, redução ...

Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos a David Meints, Universidade de Arkansas por sua assistência no desenvolvimento e analisando o milho transgénico durante as primeiras gerações. Este trabalho recebeu o apoio financeiro do projeto CRIS USDA-ARS 6054-42000-025-00D. Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica em recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura. Política de oportunidade de emprego igual (EEO) dos USDA-ARS mandatos de igualdade de oportunidades para todas as pessoas e proíbe a discriminação em todos os aspectos das operações, práticas e políticas de pessoal da agência.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarCaisson
Amazing Marine GoopEclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time SystemBio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mmFisher Scientific08-772F
Eppendorf 5424 MicrocentrifugeFisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mLAce Glass6999-10
Ethanol
FluoroQuant AflaRomer LabsCOKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cmFisher Scientific09-790-14E
Force Air OvenVWR
FQ-ReaderRomer LabsEQFFM3010
Geno/Grinder 2010OPS DiagnosticsSP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant GlovesAnsell012-15-554
Innova 44 Incubator ShakerBrunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mLDKW Life Sciences14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for PlantsNexttec47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 cameraNikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS cameraNikon
Nunc Square BioAssay DishesThermoFisher Scientific240835
Phire Plant Direct PCR KitThermoFisher ScientificF130WH
Polycarbonate Vials, 15 mlOPS DiagnosticsPCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mmDKW Life Sciences242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrateSigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasicSigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA KitSigma-AldrichSTRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''OPS DiagnosticsGBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 FluorometerBiotek
T100 Thermal CyclerBio-Rad
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
V8 juiceCampbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3Fisher Scientific09-820P
Wrist-Action ShakerBurrell Scientific

Referências

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