Modelage tridimensionnel de biofilms d’ingénierie avec une Bioimprimeur de bricolage

Résumé

Cet article décrit une méthode de transformation d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante 3D bactérienne qui peut faciliter l’impression de biofilms à motifs. Tous les aspects nécessaires de la préparation du bioimprimeur et de la bio-encre sont décrits, ainsi que des méthodes de vérification pour évaluer la formation de biofilms.

Résumé

Les biofilms sont des agrégats de bactéries incorporées dans une matrice extracellulaire à motifs spatialement auto-produits. Les bactéries au sein d’un biofilm développent une résistance accrue aux antibiotiques, qui présente des dangers potentiels pour la santé, mais peuvent également être bénéfiques pour les applications environnementales telles que la purification de l’eau potable. Le développement ultérieur de thérapies antibactériennes et d’applications inspirées par le biofilm exigera le développement de méthodes reproductibles et ingéniables pour la création de biofilms. Récemment, une nouvelle méthode de préparation de biofilm utilisant une imprimante tridimensionnelle (3D) modifiée avec une encre bactérienne a été développée. Cet article décrit les étapes nécessaires à la construction de cette bio-imprimante 3D efficace et économique qui offre plusieurs applications dans le traitement des matériaux induits par les bactériotiques. Le protocole commence par une imprimante 3D commerciale adaptée dans laquelle l’extrudeuse a été remplacée par un distributeur d’encre bio relié à un système de pompe à seringue permettant un flux continu et contrôlable de bio-encre. Pour développer une bio-encre appropriée pour l’impression de biofilm, les bactéries d' Escherichia coli modifiées ont été suspendues dans une solution d’alginate, de sorte qu’elles solidifient en contact avec une surface contenant du calcium. L’inclusion d’un produit chimique inducteur dans le substrat d’impression entraîne l’expression de protéines de biofilm dans la bio-encre imprimée. Cette méthode permet l’impression 3D de divers modèles spatiaux composés de couches discrètes de biofilms imprimés. Ces biofilms contrôlés spatialement peuvent servir de systèmes modèles et peuvent trouver des applications dans de multiples domaines qui ont un impact large sur la société, y compris la prévention de la résistance aux antibiotiques ou la purification de l’eau potable, entre autres.

Introduction

Il est actuellement de plus en plus nécessaire de développer des solutions respectueuses de l’environnement et durables pour la production de matériaux à motifs spatiaux, en raison du nombre croissant de marchés pour ces matériaux¹. Cet article présente une méthode simple et économique pour la production de ces matériaux et offre donc un large éventail d’applications futures. La méthode présentée ici permet l’impression tridimensionnelle (3D) de structures spatialement modelés à l’aide d’une bio-encre contenant des bactéries vivantes. Les bactéries demeurent viables dans les structures imprimées pendant plus d’une semaine, ce qui permet aux bactéries d’effectuer des activités métaboliques naturelles ou machinées. Les bactéries imprimées peuvent ainsi produire et déposer les composants souhaités dans la structure imprimée, par exemple en créant un biofilm réticulé fonctionnel².

Les méthodes traditionnelles de production de matériaux de pointe impliquent des dépenses énergétiques élevées (par exemple, des températures et/ou des pressions élevées) et peuvent produire de grandes quantités de déchets chimiques, souvent des substances toxiques nécessitant une utilisation extensive des coûts^{3 ,4}. En revanche, plusieurs espèces bactériennes sont en mesure de produire des matériaux qui peuvent être facilement applicables dans diverses industries. Ces matériaux comprennent des polymères tels que les polyhydroxyalcanoates (PHA)⁵ ou poly (glycolide-co-lactide) (PGLA)⁶, la cellulose bactérienne⁷, les matériaux de béton bactérien⁸, les composites biomimétiques⁹, adhésifs à base d’amyloïdes¹⁰, ou des commutateurs électriques à base de bio¹¹, entre autres. En outre, la production bactérienne de matériaux de valeur se déroule généralement à des températures et des pressions proches de l’environnement et dans des environnements aqueux, sans nécessiter ni produire de composés toxiques. Alors que la production de matériaux avec des bactéries a été démontrée dans la littérature et certaines applications industrielles ont déjà émergé^12,13, une méthode fiable pour la structuration spatiale de ces matériaux reste un défi.

Cet article illustre une méthode simple de conversion d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante bactérienne 3D. Le protocole montre comment préparer une bio-encre contenant et soutenant les bactéries vivantes, ainsi que la façon de préparer des substrats sur lesquels l’impression 3D peut être effectuée. Cette méthode est appropriée à utiliser avec une variété de souches bactériennes naturelles et modifiées capables de produire des matériaux. Ces bactéries peuvent être réparties spatialement dans une structure imprimée en 3D et continuer leur activité métabolique, ce qui entraînera une distribution spatiale des matériaux désirés produits par les bactéries.

Cette méthode d’impression permet la fabrication additive de biofilms, d’agrégats de bactéries entourés d’une matrice extracellulaire autoproduite. Les biofilms sont des réseaux 3D hétérogènes dans lesquels les protéines, les polymères, les cellules bactériennes, l’oxygène et les nutriments sont tous spatialement structurés¹⁴. Sous la forme d’un biofilm, les bactéries présentent une résistance accrue aux antibiotiques et une robustesse structurelle, ce qui les rend difficiles à éradiquer des surfaces, y compris les cathéters médicaux et les implants. La clé des propriétés du biofilm, et aussi le plus grand défi pour la recherche sur le biofilm, semble être l’hétérogénéité des biofilms^15,16,17. La production de biofilms modèles contrôlés spatialement est d’un intérêt particulier car elle permettrait de reproduire ou de régler les schémas spatiaux des composantes du biofilm, facilitant ainsi la compréhension du dépôt stable de biofilms sur pratiquement n’importe quelle surface dans nature.

Cet article présente une méthode pour la production de biofilms à l’aide d’hydrogels imprimés en 3D contenant des bactéries E. coli d’ingénierie qui produisent des protéines de biofilm en présence d’un inducteur, ainsi que des méthodes de vérification de la formation de biofilm² . Les principaux composants de la matrice extracellulaire de ces biofilms sont les fibres amyloïdes¹⁸ qui contiennent des protéines CSGA auto-assemblées. Lorsque les bactéries E. coli sont induites pour exprimer des protéines CSGA, elles forment un biofilm modèle stable qui protège les cellules contre leur lavage hors de la surface d’impression. Un tel biofilm imprimé en 3D peut être contrôlé spatialement et peut servir d’outil de recherche utile pour l’investigation de la mécanique à plusieurs échelles de la structure de biofilm ou de la matériomique¹⁹. Ces biofilms sur mesure aideront à comprendre les principes de la formation des biofilms et leurs propriétés mécaniques, permettant ainsi de poursuivre la recherche sur les mécanismes de résistance aux antibiotiques entre autres applications.

Protocole

1. conversion d’une imprimante 3D commerciale en bioimprimante 3D

1. Retirez l’extrudeuse et le radiateur d’une imprimante 3D commerciale (table des matières) du cadre de l’imprimante et débranchez le câblage contrôlant ces éléments de la carte de circuit principal (figure 1a). Étant donné que le capteur qui contrôle la température de fonctionnement de l’imprimante doit être fonctionnel pour communiquer avec le logiciel de l’imprimante, retirez du logiciel d’impression l’algorithme qui retarde l’impression jusqu’à ce que la température opérationnelle soit atteinte.
2. Raccorder une pointe de pipette (200 μL de pointe) par tube de silicium (diamètre intérieur de 1 mm) à une seringue de 5 mL chargée dans une pompe à seringue. Montez l’embout de la pipette sur la tête de l’extrudeuse de l’imprimante 3D en remplacement de l’extrudeuse d’origine (figure 1b).
3. Si vous utilisez plus d’un type de bio-encre, montez les systèmes de tuyauterie supplémentaires et les pointes de pipette sur l’imprimante.

2. préparation du substrat pour l’impression 3D

1. Ajouter 4 mL de 5 M de solution CaCl₂ à 400 ml d’agar 1% p/v dissous dans du bouillon de Luria-BERTANI (lb), additionné d’antibiotiques et d’inducteurs appropriés (ici 34 μg/ml de chloramphénicol et 0,5% de rhamnose).
2. Verser 20 mL de la solution LB-agar dans chaque boîte de Petri de 150 mm x 15 mm. Sécher 30 min à température ambiante avec le couvercle demi-ouvert.
   Remarque: le protocole peut être suspendu ici en stockant ces substrats d’impression à 4 ° c pendant plusieurs jours.

3. préparation de la bio-encre

1. Préparer une solution d’alginate de sodium (3% p/v) et chauffer au point d’ébullition trois fois pour stériliser la solution. Conserver à 4 ° c jusqu’à l’utilisation.
2. Cultiver e. coli MG1655 Pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) bactéries porteuses de plasmides pSB1C3-green fluorescent protein (GFP) (expression GFP constitutive)² ou PSB1C3-GFP-CSGA (expression GFP constitutive, CSGA induisible par rhamnose l’expression) nuit à 37 ° c avec agitation à 250 tr/min dans 50 mL de milieu LB contenant 34 μg/mL de chloramphénicol et 0,5% de rhamnose.
3. Centrifugez la culture cellulaire pendant 5 min à 3 220 x g pour pellets les bactéries. Enlevez le surnageant.
4. Résuspendez le culot bactérien dans 10 mL de milieu LB et ajoutez 10 mL d’alginate de sodium (3% p/v).

4. processus d’impression 3D

1. Installez et ouvrez le logiciel d’impression 3D (table des matières) sur un ordinateur. Connectez l’imprimante 3D à l’ordinateur. Déplacez la tête d’impression à sa position d’origine en cliquant sur le bouton d’accueil pour les axes X, Y et Z.
2. Pour chaque impression, placez un substrat d’impression préparé sur un emplacement particulier sur le lit d’impression.
3. Calibrer la hauteur de la tête d’impression dans l’axe Z.
   1. Soulever la tête d’impression à une hauteur de 22 mm sous contrôle manuel, de sorte qu’elle ne se heurte pas au bord de la boîte de Petri lors du déplacement à la position souhaitée. Positionnez la tête d’impression au-dessus de la plaque et déplacez-la jusqu’à ce que l’embout de la pipette contacte la surface d’impression. Affectez cette position de l’axe Z comme Z1 (la hauteur de la surface d’impression).
   2. Soulevez la tête d’impression et déplacez-la à l’extérieur de la zone de la plaque par commande manuelle dans les axes X, Y et Z. Si la distance de travail entre la tête d’impression et la surface de la plaque est définie comme Z2, entrez Z1 + Z2 dans le programme d’impression en tant que valeur Z pendant l’impression.
4. Programmez la forme d’impression par une méthode de coordonnées point par point auto-développée selon la trajectoire souhaitée.
   1. Si la trajectoire souhaitée est une ligne droite, définissez uniquement les points de début et de fin. Y compris les points supplémentaires sur les lignes courbes se traduira par des courbes plus lisses. Déplacez la tête d’impression manuellement à chaque point séquentiellement, et enregistrez les coordonnées de ces points dans l’ordre. Entrez toutes ces coordonnées, ainsi que la vitesse de déplacement de la tête d’impression pour chaque segment imprimé dans l’éditeur de code G.
5. Avant et après l’impression, soulevez la tête d’impression à une distance supérieure au bord de la plaque (20 mm) et sortez directement de la zone de la plaque. Enregistrez ce programme sous forme de fichier G-code et chargez-le directement pour une utilisation dans les impressions ultérieures, tout en remesurant la hauteur de l’axe Z pour chaque nouveau substrat d’impression.
   Remarque: Voir le tableau 1 pour un exemple de code G pour l’impression d’un carré.
6. Chargez le fichier de code G préprogrammé. Ouvrez l’éditeur de code G dans le logiciel et programmez dans les commandes d’impression de la forme souhaitée. À chaque ligne de commande, la position de la tête d’impression peut être modifiée dans l’axe X, Y et/ou Z. Entrez la valeur Z pendant toutes les étapes d’impression comme Z1 + Z2 (hauteur de la surface d’impression + distance de travail).
   Remarque: la vitesse de déplacement est également réglable; 9 000 mm/min est une valeur appropriée pour les taux d’impression typiques.
7. Chargez la bio-encre liquide dans la (les) seringue (s) et montez-les dans la (les) pompe (s) de seringue de la bioimprimante 3D.
8. Imprimez la bio-encre sur le substrat d’impression en cliquant sur le bouton Imprimer .
9. Pendant l’impression, contrôlez le mouvement de la tête d’impression entièrement par le logiciel. Démarrez manuellement la pompe de la seringue avant que la tête d’impression n’entre en contact avec la surface de l’imprimante.
   Remarque: la coordination de la pompe de la seringue et de l’imprimante est déterminée empiriquement en fonction de la vitesse d’extrusion, de la vitesse à laquelle la tête d’impression se déplace jusqu’au premier point, ainsi que de la position initiale de la tête de tête. Si la position initiale de la tête d’impression est de 20 mm, avec une vitesse de tête d’impression de 9 000 mm/min et une vitesse d’extrusion de 0,1 mL/h, démarrez la pompe de la seringue immédiatement après le démarrage de l’impression. Si la vitesse d’extrusion est changée de 0,1 mL/h à 0,3 mL/h, attendre 2 − 3 s pour démarrer la pompe de la seringue après le démarrage de l’impression.
10. Arrêter la pompe de la seringue dès que la tête d’impression arrive au dernier point de l’imprimerie. Arrêtez la pompe de la seringue avant que la tête d’impression ne se lève à la fin du processus d’impression, sinon l’excès de bio-encre va tomber sur le substrat d’impression et réduire la résolution d’impression.
11. Pour la construction de structures 3D, contrôlez tous les mouvements de la tête d’impression dans l’éditeur de code G. Saisissez la hauteur d’impression de la première couche. Augmentez la valeur Z dans le G-code par 0,2 millimètres pour la deuxième couche pour augmenter la hauteur d’impression. Par la suite, augmentez la valeur Z de 0,1 millimètres lors du déplacement vers une couche supérieure. Ne déplacez pas la plaque pendant le processus d’impression.
12. Pour mesurer la largeur et la hauteur de l’hydrogel imprimé, utilisez une règle en acier placée sous ou à côté de l’échantillon.

5. cultiver et tester l’efficacité de la production de biofilms par E. coli

1. Incuber les échantillons imprimés à température ambiante pendant 3 − 6 jours pour permettre la production de composants de biofilm (fibres de curli). Image des plaques à l’aide d’un appareil photo ou d’un scanner fluorescent.
2. Pour dissoudre la matrice d’alginate, ajouter 20 mL de solution de citrate de sodium 0,5 M (pH = 7 ajustée avec NaOH) aux substrats d’impression et incuber pendant 2 h avec 30 tr/min en secouant à température ambiante. Jetez le liquide et l’image des plaques à nouveau pour comparer avec les images des plaques avant le traitement du citrate.

Résultats

La première étape pour l’impression 3D réussie des biofilms est la conversion d’une imprimante 3D commerciale en bioimprimeur. Cette conversion est obtenue en enlevant l’extrudeuse et le radiateur de l’imprimante, conçus pour l’impression avec une encre polymérique, et en les remplaçant par des composants appropriés pour l’impression de bio-encres contenant des bactéries vivantes (figure 1a). L’extrudeuse est remplacée par une pointe de...

Discussion

Le protocole présenté ici pour l’impression 3D de biofilms d’ingénierie a deux étapes critiques. La première est la préparation de la surface d’impression de gélose, qui est le facteur le plus critique pour produire une résolution d’impression spécifique. Il est important de s’assurer que la surface d’impression est plane et que la pointe de la pipette sur la tête de tête est positionnée à la bonne hauteur de la surface. Si la surface n’est pas plane, la distance de travail changera pendant le ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295