Patterning tridimensionale di biofilm ingegnerizzati con Bioprinter fai da te

Riepilogo

In questo articolo viene descritto un metodo per trasformare una stampante 3D commerciale a basso costo in una stampante 3D batterica che può facilitare la stampa di biofilm a motivi geometrici. Sono descritti tutti gli aspetti necessari della preparazione del biostampa e del bio-Ink, nonché i metodi di verifica per valutare la formazione dei biofilm.

Abstract

I biofilm sono aggregati di batteri incorporati in una matrice extracellulare a fantasia spazialmente autoprodotta. I batteri all'interno di un biofilm sviluppano una maggiore resistenza agli antibiotici, che pone potenziali pericoli per la salute, ma può anche essere vantaggioso per applicazioni ambientali come la purificazione dell'acqua potabile. L'ulteriore sviluppo di terapie antibatteriche e di applicazioni ispirate al biofilm richiederà lo sviluppo di metodi riproducibili e engineerabili per la creazione di biofilm. Recentemente, è stato sviluppato un nuovo metodo di preparazione del biofilm utilizzando una stampante tridimensionale (3D) modificata con un inchiostro batterico. In questo articolo vengono descritti i passaggi necessari per creare questo biostampa 3D efficiente e a basso costo che offre più applicazioni nell'elaborazione di materiali indotti da batterio. Il protocollo inizia con una stampante 3D commerciale adattata in cui l'estrusore è stato sostituito con un erogatore di Bio-inchiostro collegato ad un sistema di pompa a siringa che consente un flusso continuo e controllabile di bio-Ink. Per sviluppare un bio-inchiostro adatto per la stampa di biofilm, i batteri di Escherichia coli ingegnerizzati sono stati sospesi in una soluzione di alginato, in modo che si solidificino a contatto con una superficie contenente calcio. L'inclusione di una sostanza chimica induttore all'interno del substrato di stampa spinge l'espressione delle proteine del biofilm all'interno del bio-Ink stampato. Questo metodo consente la stampa 3D di vari modelli spaziali costituiti da strati discreti di biofilm stampati. Tali biofilm controllati spazialmente possono fungere da sistemi modello e possono trovare applicazioni in più campi che hanno un impatto di ampio respiro sulla società, tra cui la prevenzione della resistenza agli antibiotici o la purificazione dell'acqua potabile, tra gli altri.

Introduzione

Vi è attualmente una crescente necessità di sviluppare soluzioni sostenibili e rispettose dell'ambiente per la produzione di materiali spazialmente modellati, a causa del crescente numero di mercati per tali materiali¹. Questo articolo presenta un metodo semplice ed economico per la produzione di tali materiali e offre quindi un ampio spettro di applicazioni future. Il metodo qui presentato consente la stampa tridimensionale (3D) di strutture spazialmente modellate utilizzando un bio-Ink contenente batteri viventi. I batteri restano vitali all'interno delle strutture stampate per oltre una settimana, permettendo ai batteri di eseguire attività metaboliche naturali o ingegnerizzate. I batteri stampati possono quindi produrre e depositare i componenti desiderati all'interno della struttura stampata, ad esempio creando un biofilm Cross-Linked funzionale².

I metodi tradizionali per la produzione di materiali avanzati comportano elevate spese energetiche (ad es. alte temperature e/o pressioni) e possono produrre grandi quantità di rifiuti chimici, sostanze spesso tossiche che richiedono un utilizzo esteso dei costi^{3 ,4}. Al contrario, più specie batteriche sono in grado di produrre materiali che possono essere prontamente applicabili in vari settori. Questi materiali includono polimeri come i poliidrossialkanoati (PHA)⁵ o poli (glicolide-co-lattide) (PGLA)⁶, cellulosa batterica⁷, materiali batterici in calcestruzzo⁸, compositi biomimetici⁹, adesivi a base di amiloide¹⁰, o interruttori elettrici a base biologica¹¹, tra gli altri. Inoltre, la produzione batterica di materiali preziosi avviene tipicamente a temperature e pressioni quasi ambientali e in ambienti acquosi, senza richiedere o produrre composti tossici. Durante la produzione di materiali con batteri è stato dimostrato in letteratura e alcune applicazioni industriali sono già emerse^12,13, un metodo affidabile per il patterning spaziale di tali materiali rimane una sfida.

Questo articolo illustra un metodo semplice per convertire una stampante 3D commerciale a basso costo in una stampante batterica 3D. Il protocollo illustra come preparare un bio-inchiostro contenente e sostenere i batteri viventi, nonché come preparare i substrati su cui è possibile eseguire la stampa 3D. Questo metodo è appropriato da utilizzare con una varietà di ceppi batterici naturali e ingegnerizzati in grado di produrre materiali. Questi batteri possono essere distribuiti spazialmente all'interno di una struttura stampata in 3D e continuano ancora la loro attività metabolica, che si tradurrà in una distribuzione spaziale dei materiali desiderati prodotti dai batteri.

Questo metodo di stampa consente la produzione additiva di biofilm, aggregati di batteri circondati da una matrice extracellulare autoprodotta. I biofilm sono reti 3D eterogenee in cui proteine, polimeri, cellule batteriche, ossigeno e nutrienti sono tutti strutturati spazialmente¹⁴. Mentre nella forma di un biofilm, i batteri mostrano una maggiore resistenza agli antibiotici e robustezza strutturale, rendendoli difficili da sradicare dalle superfici, compresi cateteri medici e impianti. La chiave per le proprietà biofilm, e anche la più grande sfida alla ricerca biofilm, sembra essere l'eterogeneità di biofilm^15,16,17. La produzione di biofilm di modelli controllati spazialmente è di particolare interesse in quanto consentirebbe di riprodurre o di ottimizzare i modelli spaziali dei componenti del biocarburante, aiutando la comprensione del deposito stabile di biofilmi su praticamente qualsiasi superficie in natura.

Questo articolo presenta un metodo per la produzione di biofilm che utilizzano idrogel stampati in 3D contenenti batteri E. coli ingegnerizzati che producono proteine del biofilm in presenza di un induttore, nonché metodi di verifica della formazione di biocarburante² . I principali componenti della matrice extracellulare di questi biofilm sono le fibre amiloidi di curli¹⁸ che contengono proteine csga auto-assemblate. Quando i batteri E. coli ingegnerizzati sono indotti a esprimere le proteine csga, formano un biofilm modello stabile che protegge le cellule dall'essere lavato via dalla superficie di stampa. Tale biofilm stampato in 3D può essere controllato spazialmente e può fungere da utile strumento di ricerca per l'investigazione della meccanica di struttura-funzione biofilm multiscala o materiomics¹⁹. Questi biofilm su misura aiuteranno la comprensione dei principi della formazione del biocarburante e delle loro proprietà meccaniche, consentendo ulteriori ricerche sui meccanismi di resistenza agli antibiotici tra le altre applicazioni.

Protocollo

1. conversione di una stampante 3D commerciale in una biostampa 3D

1. Rimuovere l'estrusore e il riscaldatore di una stampante 3D commerciale (tabella dei materiali) dal telaio della stampante e scollegare il cablaggio controllando questi elementi dal circuito principale (Figura 1a). Poiché il sensore che controlla la temperatura di funzionamento della stampante deve essere funzionale per comunicare con il software della stampante, rimuovere dal software di stampa l'algoritmo che ritarda la stampa fino a raggiungere la temperatura di esercizio.
2. Collegare una punta della pipetta (200 μL di punta) tramite un tubo di silicio (diametro interno di 1 mm) a una siringa da 5 mL caricata in una pompa a siringa. Montare la punta della pipetta sulla testa dell'estrusore della stampante 3D come sostituto dell'estrusore originale (Figura 1B).
3. Se si utilizza più di un tipo di bio-Ink, montare i sistemi di tubi aggiuntivi e le punte della pipetta alla stampante.

2. preparazione del substrato per la stampa 3D

1. Aggiungere 4 mL di 5 M di soluzione di CaCl₂ a 400 ml di agar 1% p/v disciolto nel brodo di Luria-Bertani (lb), integrato con antibiotici e induttori appropriati (qui 34 μg/ml cloramfenicolo e 0,5% rhamnose).
2. Erogare 20 mL della soluzione LB-agar in ogni piatto di Petri da 150 mm x 15 mm. Asciugare 30 min a temperatura ambiente con il coperchio semi-aperto.
   Nota: il protocollo può essere sospeso qui memorizzando questi substrati di stampa a 4 ° c per diversi giorni.

3. preparazione di bio-Ink

1. Preparare una soluzione di alginato di sodio (3% p/v) e riscaldare il punto di ebollizione tre volte per sterilizzare la soluzione. Conservare a 4 ° c fino ad uso.
2. Grow e. coli MG1655 Pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) batteri portatori di plasmidi pSB1C3-proteina fluorescente verde (GFP) (espressione costitutiva del GFP)² o PSB1C3-GFP-CSGA (espressione costitutiva del GFP, rhamnose-csga inducibile ) a 37 ° c con agitazione a 250 giri/min in 50 mL di LB Media contenente 34 μg/mL di cloramfenicolo e 0,5% di rhamnose.
3. Centrifugare la coltura cellulare per 5 min a 3.220 x g per pellet i batteri. Rimuovere il supernatante.
4. Risospendere il pellet batterico in 10 mL di LB medio e aggiungere 10 mL di alginato di sodio (3% p/v).

4. processo di stampa 3D

1. Installare e aprire il software di stampa 3D (tabella dei materiali) su un computer. Collegare la stampante 3D al computer. Spostare la testina di stampa nella posizione iniziale facendo clic sul pulsante Home per gli assi X, Y e Z.
2. Per ogni stampa, collocare un substrato di stampa preparato su una particolare posizione sul letto di stampa.
3. Calibrare l'altezza della testina di stampa nell'asse Z.
   1. Sollevare la testina di stampa ad un'altezza di 22 mm sotto il controllo manuale, in modo che non collidere con il bordo della capsula di Petri quando si sposta nella posizione desiderata. Posizionare la testina di stampa sopra la piastra e spostarla verso il basso fino a quando la punta della pipetta non contatta la superficie. Assegnare questa posizione dell'asse Z come Z1 (l'altezza della superficie di stampa).
   2. Sollevare la testina di stampa e spostarla all'esterno dell'area della piastra mediante il controllo manuale negli assi X, Y e Z. Se la distanza di lavoro tra la testina di stampa e la superficie della piastra è definita come Z2, immettere Z1 + Z2 nel programma di stampe come valore Z durante la stampa.
4. Programmare la forma di stampa con un metodo di coordinata punto per punto auto-sviluppato in base alla traiettoria desiderata.
   1. Se la traiettoria desiderata è una linea retta, definire solo i punti iniziale e finale. L'inclusione di punti aggiuntivi sulle linee curve risulterà in curve più morbide. Spostare la testina di stampa manualmente in ogni punto in sequenza e registrare le coordinate di questi punti in ordine. Inserire tutte queste coordinate e la velocità di movimento della testina di stampa per ogni segmento stampato nell'editor del codice G.
5. Sia prima che dopo la stampa, sollevare la testina a una distanza superiore al bordo della piastra (20 mm) e spostarsi direttamente dalla regione della piastra. Salvare questo programma come file G-code e caricarlo direttamente per l'uso nelle stampe successive, mentre si rimisura l'altezza dell'asse Z per ogni nuovo substrato di stampa.
   Nota: vedere la tabella 1 per un esempio di codice G per la stampa di un quadrato.
6. Caricare il file G-Code pre-programmato. Aprire l'editor del codice G nel software e programmare nei comandi per la stampa della forma desiderata. In ogni riga di comando, la posizione della testina di stampa può essere modificata nell'asse X, Y e/o Z. Immettere il valore Z durante tutti i passaggi di stampa come Z1 + Z2 (altezza della superficie di stampa + distanza di lavoro).
   Nota: la velocità di movimento è anche regolabile; 9.000 mm/min è un valore adatto per le velocità di stampa tipiche.
7. Caricare il Bio-inchiostro liquido nella siringa (s), e montarli nella pompa (e) della siringa del bioprinter 3D.
8. Stampare il bio-Ink sul substrato di stampa facendo clic sul pulsante stampa .
9. Durante la stampa, controllare il movimento della testina interamente dal software. Avviare manualmente la pompa della siringa prima che la testina di stampa venga a contatto con la superficie.
   Nota: il coordinamento della pompa della siringa e della stampante viene determinato empiricamente in base alla velocità di estrusione, alla velocità di spostamento della testina di stampa al primo punto di stampe e alla posizione iniziale della testina di stampe. Se la posizione iniziale della testina di stampa è di 20 mm, con una velocità della testina di stampa di 9.000 mm/min e una velocità di estrusione di 0,1 mL/h, avviare la pompa della siringa immediatamente dopo l'avvio. Se la velocità di estrusione viene cambiata da 0,1 mL/h a 0,3 mL/h, attendere 2 − 3 s per avviare la pompa della siringa dopo l'avvio della stampa.
10. Fermare la pompa della siringa non appena la testina di stampa arriva all'ultimo punto di stampare. Arrestare la pompa della siringa prima che la testina di stampa si sollevi alla fine del processo, altrimenti il bio-Ink in eccesso scenderà sul substrato di stampa e ridurrà la risoluzione di stampa.
11. Per la costruzione di strutture 3D, controllare tutti i movimenti della testina di stampa nell'editor G-code. Digitare l'altezza di stampa del primo layer. Aumentare il valore Z nel codice G di 0,2 millimetri per il secondo livello per aumentare l'altezza di stampa. Successivamente, aumentare il valore Z di 0,1 millimetri quando si sposta su un livello superiore. Non muovere la piastra durante il processo di stampa.
12. Per misurare la larghezza e l'altezza dell'idrogel stampato, utilizzare un righello di acciaio posizionato sotto o accanto al campione.

5. coltivazione e collaudo dell'efficacia della produzione di biofilm da parte di e. coli

1. Incubare i campioni stampati a temperatura ambiente per 3 − 6 giorni per consentire la produzione di componenti di biofilm (fibre Curli). Immagine delle piastre utilizzando una fotocamera o uno scanner fluorescente.
2. Per sciogliere la matrice di alginato, aggiungere 20 mL di soluzione di citrato di sodio 0,5 M (pH = 7 regolato con NaOH) ai substrati di stampa e incubare per 2 h con 30 rpm scuotendo a temperatura ambiente. Gettare il liquido e l'immagine delle piastre di nuovo per confrontare con le immagini delle piastre prima del trattamento del citrato.

Risultati

Il primo passo per la stampa 3D di successo dei biofilm è la conversione di una stampante 3D commerciale in un bioprinter. Questa conversione si ottiene rimuovendo l'estrusore e il riscaldatore della stampante, progettati per la stampa con un inchiostro polimerico, e sostituendoli con componenti appropriati per la stampa di bioinchiostri contenenti batteri viventi (Figura 1a). L'estrusore è sostituito da una punta della pipetta (o punte, se nel processo di ...

Discussione

Il protocollo qui presentato per la stampa 3D di biofilm ingegnerizzati ha due passaggi critici. In primo luogo è la preparazione della superficie di stampa agar, che è il fattore più critico per la produzione di una specifica risoluzione di stampa. È importante assicurarsi che la superficie di stampa sia piatta e che la punta della pipetta sulla testina di stampe sia posizionata all'altezza corretta dalla superficie. Se la superficie non è piatta, la distanza di lavoro cambierà durante il processo di stampa. Se la...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295