엔지니어 드 바이오 필름의 3 차원 패터 닝-it-스스로 바이오 필름

요약

본 문서에서는 저가형 상업용 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환 하 여 패턴화 된 바이오 필름의 인쇄를 촉진할 수 있는 방법을 설명 합니다. 바이오 필름 및 바이오 잉크를 제조 하는 데 필요한 모든 측면 뿐만 아니라 생물 막의 형성을 평가 하기 위한 검증 방법도 설명 합니다.

초록

바이오 필름은 자체 생산 된 공간적으로 패턴화 된 세포 외 기질에 내장 된 박테리아의 집합체 이다. 생물 막 내의 박테리아는 잠재적인 건강 위험을 제기 하는 향상 된 항 생 저항을 개발 합니다, 그러나 또한 식 수의 정화와 같은 환경 신청을 위해 유익할 수 있습니다. 항균 치료제 및 생물 막에서 영감을 얻은 응용 분야의 추가 개발은 생물 막 생성을 위한 재현 가능 하 고 공학 가능한 방법의 개발을 요구할 것입니다. 최근에는 세균 잉크로 수정 된 3 차원 (3d) 프린터를 이용한 바이오 필름 제제의 신규 한 방법이 개발 되 고 있다. 이 문서에서는 세균 유도 재료 처리에 여러 응용 프로그램을 제공 하는이 효율적이 고 저렴 한 3D 바이오 제약 업체를 구축 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜은 적용 가능한 상업용 3D 프린터로 시작 하 여 압출 기를 주사기 펌프 시스템에 연결 된 바이오 잉크 디스펜서로 교체한 후 제어 되 고 연속적인 바이오 잉크 흐름을 가능 하 게 합니다. 생물 막 인쇄에 적합 한 바이오 잉크를 개발 하기 위해, 조작 된 대장균 박테리아를 알지 네이트 용액에 현 탁 시킨 후, 이들이 칼슘을 함유한 표면과 접촉 하 여 응고 되도록 하였다. 인쇄 기판 내에 유도 화학 물질의 포함은 인쇄 된 바이오 잉크 내에서 생물 막 단백질의 발현을 구동 한다. 이 방법을 사용 하면 인쇄 된 바이오 필름의 개별 레이어로 구성 된 다양 한 공간 패턴의 3D 인쇄가 가능 합니다. 이러한 공간적으로 제어 되는 생물 막은 모델 시스템의 역할을 할 수 있으며, 항생제 내성 예방 또는 음 용 수 정화 등 사회에 광범위 한 영향을 미치는 여러 분야의 응용 분야를 찾을 수 있습니다.

서문

현재 이러한 물질의 시장 수가 증가 함에 따라 공간적으로 패턴화 된 재료의 생산을 위한 친환경적이 고 지속 가능한 솔루션을 개발 해야 하는 필요성이 커지고 있다¹. 이 문서는 이러한 재료의 생산을 위한 간단 하 고 경제적인 방법을 제시 하 고, 따라서 미래의 응용 프로그램의 큰 스펙트럼을 제공 합니다. 여기에 제시 된 방법은 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 사용 하 여 공간적으로 패턴 된 구조의 3 차원 (3d) 인쇄를 허용 한다. 박테리아는 자연 또는 공학적 된 신진 대사 활동을 수행 하는 박테리아를 가능 하 게 1 주일 이상 인쇄 된 구조 내에서 가능한 남아. 인쇄 된 박테리아는 예를 들어 기능적 가교 된 생물 막²를 생성 하 여 인쇄 된 구조 내에서 원하는 성분을 생성 하 고 침전 시킬 수 있다.

첨단 소재 생산을 위한 전통적인 방법에는 높은 에너지 지출 (예: 고온 및/또는 압력)이 포함 되며 대량의 화학 폐기물을 생산할 수 있으며, 종종 비용-광범위 한 활용도가 요구 되는 독성 물질을 생산 합니다.^{3 ,4}. 대조적으로, 여러 세균 종은 다양 한 산업에서 쉽게 적용 할 수 있는 물질을 생산할 수 있다. 이들 물질은 폴 리 하이드 록 시 알 카 네이트 (PHA)⁵ 또는 폴 리아 (락 티 드)⁶의 세균 셀 룰로 오 스⁷, 세균 콘크리트 물질⁸, 생물 모방 복합 재⁹와 같은 중합체를 포함 하며, 아 밀 로이드 계 접착제¹⁰또는 바이오 기반 전기 스위치 (¹¹)는 그 중 에서도. 더욱이, 귀중 한 물질의 세균 생산은 일반적으로 독성 화합물을 요구 하거나 생산 하지 않고 주변 온도와 압력 및 수성 환경에서 일어난다. 박테리아로 재료를 생산 하는 것은 문헌에서 입증 되었지만 일부 산업 응용 분야는 이미^12,13, 이러한 물질의 공간적 패터 닝을 위한 신뢰할 수 있는 방법은 여전히 과제로 남아 있다.

이 문서에서는 저비용 상업용 3D 프린터를 3D 세균 프린터로 변환 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 살아있는 세균을 함유 하 고 유지 하는 바이오 잉크를 제조 하는 방법 뿐만 아니라, 3D 프린팅이 수행 될 수 있는 기판을 준비 하는 방법을 보여준다. 이 방법은 재료를 생산할 수 있는 다양 한 천연 및 공학적 세균 균 주와 함께 사용 하는 것이 적절 하다. 이러한 박테리아는 공간적으로 3D 프린팅 된 구조 내에서 분산 될 수 있고, 여전히 그들의 대사 활성을 계속 하며,이는 박테리아에 의해 생성 된 원하는 물질의 공간적 분포를 초래할 것 이다.

이 인쇄 방법은 자체 생산 된 세포 외 기질로 둘러싸인 생물 막, 세균 응집 체의 적 층 제조를 가능 하 게 한다. 바이오 필름은 단백질, 폴리머, 박테리아 세포, 산소 및 영양분이 모두 공간적으로 구조화 된 이종 3D 네트워크입니다. 생물 막의 형태로, 박테리아는 증가 된 항생제 저항과 구조적 견고성을 나타내며, 의료용 카 테 터 및 임 플 란 트를 포함 한 표면에서 근절 하기 어렵게 합니다. 생물 막 특성에 대 한 핵심은 생물 막 연구에도 가장 큰 과제 이며, 바이오 필름^15,16,17의 이질성 일 것으로 보인다. 공간적으로 제어 되는 모델의 바이오 필름의 생산은 생물 막 성분의 공간적 패턴을 재생 하거나 조정 하는 것을 허용 하 고, 사실상 모든 표면에서 생물 막의 안정적인 침착에 대 한 이해를 돕는 것과 같은 특별 한 관심을가지고 있습니다. 자연.

이 기사는 바이오 필름 형성의 검증 방법 뿐만 아니라 유도 체의 존재 하에 바이오 필름 단백질을 생산 하는 엔지니어링 된 대장균 박테리아를 포함 하는 3d 프린팅 하이드로 젤을 사용 하는 바이오 필름의 제조 방법을 제시 합니다.² . 이들 바이오 필름의 주요 세포 외 기질 성분은 자가 조립 된 CsgA 단백질을 함유 하는 curli 아 밀 로이드 섬유 (¹⁸ ) 이다. 개발 된 대장균 박테리아가 csga 단백질을 발현 하도록 유도 되 면, 이들은 인쇄 표면에서 씻 겨 지는 세포를 보호 하는 생물 막의 안정한 모델을 형성 한다. 이러한 3D 프린팅 생물 막은 공간적으로 제어 될 수 있고 다중 스케일 생물 막 구조 기능 역학 또는 물질 들 (¹⁹)의 조사를 위한 유용한 연구 도구로 서 작용할 수 있다. 이러한 맞춤형 바이오 필름은 바이오 필름 형성과 기계적 특성의 원리에 대 한 이해를 돕고, 다른 응용 프로그램 들 사이에서 항 생 저항의 메커니즘에 대 한 추가 연구를 가능 하 게 합니다.

프로토콜

1. 상업용 3D 프린터를 3D 바이오 제약으로 변환

1. 프린터 프레임에서 상업용 3D 프린터 (재질 테이블)의 압출 기와 히터를 분리 하 고 메인 회로 기판에서 이러한 요소를 제어 하는 배선을 분리 합니다 (그림 1a). 프린터의 작동 온도를 제어 하는 센서가 프린터 소프트웨어와 통신 하기 위해 작동 해야 하므로, 인쇄 소프트웨어에서 작동 온도에 도달할 때까지 인쇄를 지연 시키는 알고리즘을 제거 하십시오.
2. 실리콘 튜빙 (내경 1mm)을 통해 피 펫 팁 (200 µ L 팁)을 주사기 펌프에 넣은 5Ml 주사기에 연결 합니다. 원래 압출 기의 대체품으로 3D 프린터 압출 기 헤드에 피 펫 팁을 장착 합니다 (그림 1b).
3. 여러 종류의 바이오 잉크가 사용 되는 경우, 추가 튜빙 시스템 및 피 펫 팁을 프린터에 장착 하십시오.

2.3D 프린팅을 위한 기판 준비

1. 5Mcacl₂ 용액 5ml를 400 ml의 1%에 첨가 하 여 적당 한 항생제와 유도 제 (여기에 34 µ 클로 람 페니 콜 및 0.5% 람 코)로 보충 한다.
2. 각 150 mm x 15mm 페 트리 디쉬에 LB 한 천 용액 20ml를 분주 합니다. 뚜껑을 반쯤 연 후 상 온에서 30 분간 건조 시킵니다.
   참고: 이러한 인쇄 기판을 최대 며칠 동안 4°c에서 저장 하 여 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

3. 바이오 잉크 준비

1. 알 긴 산 나트륨 용액 (3%)을 준비 하 고, 끓는 점에 3 회가 열 하 여 용액을 살 균 한다. 사용 될 때까지 4°c에서 보관 하십시오.
2. 대장균 MG1655 균 주의 프로 δ Csga ompR234 (대장균δ csga) 세균 운반 플라스 미드 pSB1C3 녹색 형광 단백질 (Gfp)² 또는 pSB1C3-gfp-csga (구성형 Gfp 발현, 람 코 유도성 csga) 성장 발현) 37에서 밤새 250 rpm으로 흔들어 34 µ를 함유 하는 LB 배지에 50 mL의 클로 람 페니 콜과 0.5% 람 코.
3. 3220 x g 에서 5 분 동안 세포 배양 액을 원심 분리 하 여 세균을 펠 릿 한다. 상층 액을 제거 합니다.
4. 박테리아 펠 릿을 LB 배지 10ml에 재 일시 중단 하 고 알 긴 산 나트륨 10ml (3%)를 첨가 한다.

4.3D 프린팅 프로세스

1. 컴퓨터에 3D 프린팅 소프트웨어 (자재 표)를 설치 하 고 엽니다. 3D 프린터를 컴퓨터에 연결 합니다. X, Y 및 Z 축의 홈 버튼을 클릭 하 여 프린트 헤드를 홈 위치로 이동 합니다.
2. 각 인쇄에 대해 준비 된 인쇄 기판을 인쇄 베드의 특정 위치에 놓습니다.
3. Z 축에서 프린트 헤드의 높이를 보정 합니다.
   1. 원하는 위치로 이동할 때 페 트리 디쉬의 가장자리와 충돌 하지 않도록 수동 제어에서 22mm의 높이로 프린트 헤드를 올립니다. 프린트 헤드를 판의 위에 놓고, 피 펫 팁이 인쇄 면에 접촉 할 때까지 아래로 움직입니다. 이 Z 축 위치를 Z1 (인쇄 표면의 높이)로 지정 합니다.
   2. 프린트 헤드를 올리고 X, Y 및 Z 축에서 수동 제어를 통해 플레이트 영역의 외부로 이동 합니다. 프린트 헤드와 플레이트 표면 사이의 작동 거리가 Z2로 정의 된 경우 인쇄 하는 동안 인쇄 프로그램에 Z1 + Z2를 Z 값으로 입력 하십시오.
4. 원하는 궤적에 따라 자체 개발한 포인트 바이 포인트 좌표 결정 방법으로 인쇄 형상을 프로그래밍 합니다.
   1. 원하는 궤적이 직선이 면 시작점과 끝점만 정의 합니다. 곡선에 추가 점을 포함 하면 곡선이 부드러워집니다. 수동으로 프린트 헤드를 모든 지점으로 순차적으로 이동 하 고 이러한 점의 좌표를 순서 대로 기록 하십시오. G 코드 편집기에 각 인쇄 된 세그먼트에 대 한 프린트 헤드 이동 속도 뿐만 아니라 이러한 좌표를 모두 입력 합니다.
5. 인쇄 전후 모두 프린트 헤드를 플레이트 가장자리 (20mm) 보다 높은 거리까지 들어올려 플레이트 영역에서 직접 이동 합니다. 이 프로그램을 G 코드 파일로 저장 하 고 새로운 인쇄 기판에 대 한 Z 축 높이를 다시 측정 하면서 후속 인쇄물에 사용 하기 위해 직접 로드 합니다.
   참고: 정사각형 인쇄를 위한 G 코드 예제는 표 1 을 참조 하십시오.
6. 미리 프로그램 된 G 코드 파일을 로드 합니다. 소프트웨어에서 G 코드 편집기를 열고 원하는 모양을 인쇄 하는 명령에서 프로그램 합니다. 각 명령행에서 프린트 헤드의 위치는 X, Y 및/또는 Z 축에서 변경 될 수 있습니다. 모든 인쇄 단계에서 Z1 + Z2 (인쇄 면의 높이 + 작동 거리)로 Z 값을 입력 합니다.
   참고: 이동 속도 또한 조정 가능 합니다. 9000 m/min은 일반적인 인쇄 속도에 적합 한 값입니다.
7. 액체 바이오 잉크를 주사기에 넣고 3D 바이오 바이 저의 주사기 펌프에 장착 합니다. "
8. 인쇄 버튼을 클릭 하 여 인쇄 기판에 바이오 잉크를 인쇄 합니다.
9. 인쇄 하는 동안, 소프트웨어에 의해 완전히 프린트 헤드의 움직임을 제어 합니다. 프린트 헤드가 인쇄 표면과 접촉 하기 전에 주사기 펌프를 수동으로 시작 합니다.
   참고: 실린 지 펌프와 프린터의 조정은 돌출 속도, 프린트 헤드가 첫 번째 인쇄 지점으로 이동 하는 속도, 프린트 헤드의 초기 위치에 따라 경험적으로 결정 됩니다. 초기 프린트 헤드 위치가 20mm 인 경우, 9000의 프린트 헤드 속도와 0.1 mL/h의 압출 속도를 사용 하면 인쇄가 시작 된 직후 주사기 펌프를 시작 합니다. 압출 속도가 0.1 mL/h에서 0.3 mL/h로 변경 되 면 인쇄가 시작 된 후 2-3 초 동안 주사기 펌프를 시작 합니다.
10. 프린트 헤드가 마지막 인쇄 지점에 도착 하자마자 주사기 펌프를 중지 하십시오. 인쇄 과정의 끝에서 프린트 헤드가 상승 하기 전에 주사기 펌프를 정지, 그렇지 않으면 과도 한 바이오 잉크가 인쇄 기판에 드롭 인쇄 해상도를 줄일 수 있습니다.
11. 3D 구조를 구성 하려면 G 코드 편집기에서 프린트 헤드의 모든 움직임을 제어 합니다. 첫 번째 레이어의 인쇄 높이를 입력 합니다. 두 번째 레이어에 대해 G 코드의 Z 값을 0.2 밀리미터 단위로 늘려 인쇄 높이를 늘립니다. 그런 후 상위 레이어로 이동할 때 Z 값을 0.1 밀리미터 만큼 늘립니다. 인쇄 과정에서 판을 움직이지 마십시오.
12. 인쇄 된 하이드로 겔의 폭과 높이를 측정 하려면 샘플 아래 또는 옆에 배치 된 강철 눈금자를 사용 하십시오.

5. 대장균 에의 한 생물 막 생산의 효과를 성장 및 테스트

1. 3-6 일 동안 실 온에서 인쇄 된 샘플을 배양 하 여 생물 막 성분 (curli 섬유)의 생산을 허용 합니다. 카메라 또는 형광 스캐너를 사용 하 여 플레이트를 이미지 합니다.
2. 알 긴 산 매트릭스를 용 해 하려면, 0.5 M의 구 연산 나트륨 용액 20ml(naoh로 조정 된 pH = 7)을 인쇄 기판에 넣고 실 온에서 30 rpm으로 흔들어 2 시간 동안 배양 한다. 액체를 버리고 플레이트를 다시 이미지 하 여 시트 레이트 처리 전에 판의 이미지와 비교 하십시오.

결과

바이오 필름의 성공적인 3D 프린팅에 대 한 첫 번째 단계는 상업용 3D 프린터를 바이오 필름으로 변환 하는 것입니다. 이 변환은 폴리머 잉크로 인쇄 하도록 설계 된 프린터의 압출 기와 히터를 제거 하 고 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 인쇄 하는 데 적합 한 구성 요소로 대체 함으로써 달성 됩니다 (그림 1a). 압출 기는 주사기 펌프에 ?...

토론

엔지니어링 된 바이오 필름의 3D 프린팅을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 단계를가지고 있습니다. 첫 번째는 특정 인쇄 해상도를 생산 하는 가장 중요 한 요인이 되는 한 천 인쇄 면의 준비입니다. 인쇄 표면이 평평 하 고 프린트 헤드의 피 펫 팁이 표면에서 올바른 높이로 배치 되었는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 표면이 평평 하지 않으면 인쇄 과정에서 작동 거리가 변경 됩?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295