Padronização tridimensional de biofilmes projetados com uma Bioimpressora do-it-yourself

Resumo

Este artigo descreve um método de transformar uma impressora 3D comercial de baixo custo em uma impressora 3D bacteriana que pode facilitar a impressão de biofilmes padronizados. Todos os aspectos necessários da preparação da bioimpressora e da biostinta são descritos, bem como métodos de verificação para avaliar a formação de biofilmes.

Resumo

Biofilmes são agregados de bactérias incorporadas em uma matriz extracelular autoproduzida espacialmente padronizada. As bactérias dentro de um biofilme desenvolvem a resistência antibiótica aumentada, que levanta perigos potenciais da saúde, mas podem igualmente ser benéficas para aplicações ambientais tais como a purificação da água bebendo. O desenvolvimento de terapias antibacterianas e aplicações inspiradas no biofilme exigirá o desenvolvimento de métodos reprodutíveis e engeneráveis para a criação de biofilme. Recentemente, um novo método de preparação de biofilme usando uma impressora tridimensional modificada (3D) com uma tinta bacteriana foi desenvolvido. Este artigo descreve as etapas necessárias para criar essa bioimpressora 3D eficiente e de baixo custo que oferece várias aplicações em processamento de materiais induzido por bacterialmente. O protocolo começa com uma impressora 3D comercial adaptada em que a extrusora foi substituída por um dispensador de bio-tinta conectado a um sistema de bomba de seringa que permite um fluxo controlável e contínuo de biotinta. Para desenvolver uma bio-tinta apropriada para a impressão do biofilme, as bactérias projetadas de Escherichia coli foram suspendidas em uma solução do alginate, de modo que solidificar no contato com uma superfície que contem o cálcio. A inclusão de um indutor químico dentro do substrato de impressão impulsiona a expressão de proteínas de biofilme dentro da biotinta impressa. Este método permite a impressão 3D de vários padrões espaciais compostos de camadas discretas de biofilmes impressos. Tais biofilmes espacialmente controlados podem servir como sistemas modelo e podem encontrar aplicações em vários campos que têm um amplo impacto na sociedade, incluindo a prevenção de resistência a antibióticos ou a purificação de água potável, entre outros.

Introdução

Atualmente, há uma necessidade crescente de desenvolver soluções sustentáveis e ambientalmente amigáveis para a produção de materiais com padrões espaciais, devido ao número crescente de mercados para esses materiais¹. Este artigo apresenta um método simples e econômico para a produção de tais materiais e, portanto, oferece um grande espectro de aplicações futuras. O método apresentado aqui permite a impressão tridimensional (3D) de estruturas espacialmente padronizadas usando uma bio-tinta contendo bactérias vivas. As bactérias permanecem viáveis dentro das estruturas impressas por mais de uma semana, permitindo que as bactérias realizem atividades metabólicas naturais ou projetadas. As bactérias impressas podem, assim, produzir e depositar os componentes desejados dentro da estrutura impressa, por exemplo, criando um biofilme funcional reticulado².

Os métodos tradicionais para a produção de materiais avançados envolvem gastos de alta energia (por exemplo, altas temperaturas e/ou pressões) e podem produzir grandes quantidades de resíduos químicos, muitas vezes substâncias tóxicas que necessitam de custo-utilização extensiva^{3 ,4}. Em contraste, várias espécies bacterianas são capazes de produzir materiais que podem ser prontamente aplicáveis em várias indústrias. Estes materiais incluem polímeros como polihidroxialcananoatos (PHA)⁵ ou poli (glycolide-co-lactide) (pgla)⁶, celulose bacteriana⁷, materiais concretos bacterianos⁸, compósitos Biomiméticos⁹, adesivos baseados em amiloide¹⁰, ou interruptores elétricos baseados em bio¹¹, entre outros. Além disso, a produção bacteriana de materiais valiosos ocorre tipicamente em temperaturas e pressões Near-Ambient e em ambientes aquosos, sem exigir ou produzir compostos tóxicos. Enquanto a produção de materiais com bactérias tem sido demonstrada na literatura e algumas aplicações industriais já surgiram^12,13, um método confiável para padronização espacial de tais materiais continua a ser um desafio.

Este artigo demonstra um método direto para converter uma impressora 3D comercial de baixo custo em uma impressora bacteriana 3D. O protocolo mostra como preparar uma bio-tinta contendo e sustentar as bactérias vivas, bem como a forma de preparar substratos para o qual a impressão 3D pode ser realizada. Este método é apropriado usar-se com uma variedade de tensões bacterianas naturais e projetadas capazes de produzir materiais. Essas bactérias podem ser distribuídas espacialmente dentro de uma estrutura impressa em 3D e ainda continuar sua atividade metabólica, o que resultará em uma distribuição espacial dos materiais desejados produzidos pelas bactérias.

Este método de impressão permite a fabricação aditiva de biofilmes, agregados de bactérias cercadas por uma matriz extracelular autoproduzida. Os biofilmes são redes 3D heterogêneas nas quais proteínas, polímeros, células bacterianas, oxigênio e nutrientes são todos espacialmente estruturados¹⁴. Enquanto na forma de um biofilme, as bactérias exibem um aumento da resistência aos antibióticos e robustez estrutural, tornando-os difíceis de erradicar a partir de superfícies, incluindo cateteres médicos e implantes. A chave para as propriedades de biofilme, e também o maior desafio para a pesquisa de biofilme, parece ser a heterogeneidade dos biocombustíveis^15,16,17. A produção de biofilmes modelo espacialmente controlados é de interesse especial, pois permitiria reproduzir ou ajustar os padrões espaciais dos componentes do biofilme, auxiliando na compreensão da deposição estável de Biofilo em praticamente qualquer superfície em Natureza.

Este artigo apresenta um método para a produção de biofilmes utilizando hidrogéis impressos em 3D contendo bactérias de E. coli projetadas que produzem proteínas de biofilme na presença de um indutor, bem como métodos de verificação da formação de biofilme² . Os principais componentes da matriz extracelular desses biofilmes são as fibras amilóides de cabelo¹⁸ que contêm proteínas csga automontadas. Quando as bactérias projetadas de E. coli são induzidas para expressar proteínas de csga, formam um biofilme modelo estável que proteja as pilhas de encontro a ser lavado fora da superfície de impressão. Tal biofilme impresso em 3D pode ser controlado espacialmente e pode servir como uma ferramenta de pesquisa útil para a investigação da mecânica de função de estrutura de biofilme multiescala ou chamado¹⁹. Esses biofilmes medida auxiliarão na compreensão dos princípios da formação de biofilme e suas propriedades mecânicas, possibilitando mais pesquisas sobre os mecanismos de resistência aos antibióticos entre outras aplicações.

Protocolo

1. conversão de uma impressora 3D comercial em um bioimpressora 3D

1. Retire a extrusora e o aquecedor de uma impressora 3D comercial (tabela de materiais) do quadro da impressora e desconecte a fiação controlando esses elementos da placa de circuito principal (Figura 1a). Uma vez que o sensor que controla a temperatura operacional da impressora precisa ser funcional para se comunicar com o software da impressora, retire do software de impressão o algoritmo que atrasa a impressão até que a temperatura operacional seja atingida.
2. Ligue uma ponta de pipeta (200 μL de ponta) através da tubagem de silício (diâmetro interno de 1 mm) a uma seringa de 5 mL carregada numa bomba de seringa. Monte a ponta da pipeta na cabeça da extrusora da impressora 3D como um substituto para a extrusora original (Figura 1b).
3. Se for utilizado mais do que um tipo de tinta biológica, monte o (s) sistema (es) de tubagem adicional e as pontas da pipeta na impressora.

2. preparação de substrato para impressão 3D

1. Adicionar 4 mL de solução de 5 M de CaCl₂ a 400 ml de agar 1% p/v dissolvido em meio de caldo Luria-BERTANI (lb), suplementado com antibióticos e indutores apropriados (aqui 34 μg/ml de cloranfenicol e 0,5% de rhamnose).
2. Dispense 20 mL da solução de LB-Agar em cada prato de Petri de 150 mm x 15 mm. Seque 30 min à temperatura ambiente com a tampa meio aberta.
   Nota: o protocolo pode ser pausado aqui armazenando estes substratos da impressão em 4 ° c por até diversos dias.

3. preparação da bio-tinta

1. Prepare uma solução de alginato de sódio (3% p/v) e aqueça para o ponto de ebulição três vezes para esterilizar a solução. Conservar a 4 ° c até ser utilizado.
2. Cultivar e. coli MG1655 pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) bactérias portadoras de plasmíos pSB1C3-proteína verde fluorescente (GFP) (expressão de GFP constitutiva)² ou PSB1C3-GFP-csga (expressão de GFP constitutiva, rhamnose-inducible csga expressão) durante a noite a 37 ° c com agitação a 250 rpm em 50 mL de meio LB contendo 34 μg/mL de cloranfenicol e 0,5% de rhamnose.
3. Centrifugue a cultura da pilha por 5 minutos em 3.220 x g para pellet as bactérias. Retire o sobrenadante.
4. Re-suspender o pellet bactérias em 10 mL de LB médio e adicionar 10 mL de alginato de sódio (3% w/v).

4. processo de impressão 3D

1. Instale e abra o software de impressão 3D (tabela de materiais) em um computador. Conecte a impressora 3D ao computador. Mova o cabeçote de impressão para a posição inicial clicando no botão Home para os eixos X, Y e Z.
2. Para cada impressão, coloque um substrato de impressão preparado para um local específico na cama de impressão.
3. Calibre a altura da cabeça de impressão no eixo Z.
   1. Levante o cabeçote de impressão para uma altura de 22 mm controle manual, de modo que ele não colide com a borda da placa de Petri quando se deslocam para a posição desejada. Posicione o overtop da cabeça de impressão da placa e mova-o para baixo até que a ponta da pipeta entre em contato com a superfície de impressão. Atribua esta posição do eixo Z como Z1 (a altura da superfície de impressão).
   2. Levante o cabeçote de impressão e mova-o para fora da área de placa por controle manual nos eixos X, Y e Z. Se a distância de trabalho entre a cabeça de impressão e a superfície da chapa for definida como Z2, insira Z1 + Z2 no programa de impressão como o valor Z durante a impressão.
4. Programe a forma de impressão por um método autodesenvolvido de coordenadas ponto a ponto, de acordo com a trajetória desejada.
   1. Se a trajetória desejada for uma linha reta, defina apenas os pontos inicial e final. Incluindo pontos adicionais em linhas curvas resultará em curvas mais suaves. Mova a cabeça de impressão manualmente para cada ponto sequencialmente e registre as coordenadas desses pontos em ordem. Insira todas essas coordenadas, bem como a velocidade de movimento da cabeça de impressão para cada segmento impresso no editor de código G.
5. Antes e depois da impressão, levante a cabeça de impressão para uma distância superior à borda da placa (20 mm) e mova-se diretamente para fora da região da chapa. Salve este programa como um arquivo de código G e carregue diretamente para uso em impressões subseqüentes, enquanto remedindo a altura do eixo Z para cada novo substrato de impressão.
   Nota: consulte a tabela 1 para obter um exemplo de código G para imprimir um quadrado.
6. Carregue o arquivo de código G pré-programado. Abra o editor de código G no software e programe os comandos para imprimir a forma desejada. Em cada linha de comando, a posição do cabeçote de impressão pode ser alterada no eixo X, Y e/ou Z. Insira o valor Z durante todas as etapas de impressão como Z1 + Z2 (altura da superfície de impressão + distância de trabalho).
   Nota: a velocidade de movimento também é ajustável; 9.000 mm/min é um valor adequado para as taxas de impressão típicas.
7. Coloque a bio-tinta líquida em seringa (s), e monte-as na bomba (s) da seringa da bioimpressora 3D.
8. Imprima a tinta biológica no substrato de impressão clicando no botão Imprimir .
9. Durante a impressão, controle o movimento da cabeça de impressão inteiramente pelo software. Inicie manualmente a bomba da seringa antes de a cabeça de impressão entrar em contacto com a superfície de
   Nota: a coordenação da bomba da seringa e da impressora é determinada empiricamente, dependendo da velocidade de extrusão, a velocidade na qual a cabeça de impressão se move para o primeiro ponto de impressão e a posição inicial do cabeçote. Se a posição inicial da cabeça de impressão for de 20 mm, com uma velocidade de cabeçote de impressão de 9.000 mm/min e uma velocidade de extrusão de 0,1 mL/h, inicie a bomba da seringa imediatamente após a impressão ser iniciada. Se a velocidade de extrusão for alterada de 0,1 mL/h para 0,3 mL/h, aguarde 2 − 3 s para iniciar a bomba da seringa após a impressão ser iniciada.
10. Pare a bomba da seringa assim que a cabeça de impressão chegar ao último ponto de impressão. Pare a bomba da seringa antes que a cabeça de impressão Levante-se acima na extremidade do processo de impressão, se não a bio-tinta excedente cairá na carcaça da impressão e reduzirá a definição da impressão.
11. Para a construção de estruturas 3D, controle todos os movimentos do cabeçote de impressão no editor de código G. Digite a altura de impressão da primeira camada. Aumente o valor-Z no código G por 0,2 milímetros para a segunda camada para aumentar a altura de impressão. Depois disso, aumente o valor-Z em 0,1 milímetros ao mover-se para uma camada superior. Não mova a placa durante o processo de impressão.
12. Para medir a largura e a altura do Hydrogel impresso, use uma régua de aço coloc abaixo ou ao lado da amostra.

5. crescendo e testando a eficácia da produção de biofilme por e. coli

1. Incubar as amostras impressas à temperatura ambiente durante 3 − 6 dias para permitir a produção de componentes de biofilme (fibras de curli). Imagem das placas usando uma câmera ou scanner fluorescente.
2. Para dissolver a matriz de alginato, adicione 20 mL de solução de citrato de sódio a 0,5 M (pH = 7 ajustado com NaOH) para os substratos de impressão, e incubar por 2 h com 30 RPM tremendo à temperatura ambiente. Descarte o líquido e a imagem das placas novamente para comparar com as imagens das placas antes do tratamento com citrato.

Resultados

O primeiro passo para a impressão 3D bem-sucedida de biofilmes é converter uma impressora 3D comercial em uma bioimpressora. Esta conversão é conseguida removendo o extrusor e o calefator da impressora, projetados imprimindo com uma tinta poliméricos, e substituindo estes com os componentes apropriados para a impressão bio-tinta que contem as bactérias vivas (Figura 1a). A extrusora é substituída por uma ponta de pipeta (ou pontas, se múltiplas BIOT...

Discussão

O protocolo apresentado aqui para a impressão 3D de biofilmes projetados tem duas etapas críticas. Primeiro é a preparação da superfície de impressão em ágar, que é o fator mais crítico para a produção de uma resolução de impressão específica. É importante garantir que a superfície de impressão é plana e que a ponta da pipeta na cabeça de cabeça é posicionada na altura correta da superfície. Se a superfície não for plana, a distância de trabalho mudará durante o processo de impressão. Se a di...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295