Exploration de l’interaction biomoléculaire entre le chaperon moléculaire Hsp90 et sa protéine cliente Kinase Cdc37 à l’aide de la technologie de biodétection à effet de champ

Résumé

La biodétection à effet de champ (FEB) est une technique sans étiquette permettant de détecter les interactions biomoléculaires. Il mesure le courant électrique à travers le biocapteur de graphène auquel les cibles de liaison sont immobilisées. La technologie FEB a été utilisée pour évaluer les interactions biomoléculaires entre Hsp90 et Cdc37 et une forte interaction entre les deux protéines a été détectée.

Résumé

Les interactions biomoléculaires jouent un rôle polyvalent dans de nombreux processus cellulaires en régulant et en coordonnant des événements biologiques fonctionnellement pertinents. Les biomolécules telles que les protéines, les glucides, les vitamines, les acides gras, les acides nucléiques et les enzymes sont des éléments constitutifs fondamentaux des êtres vivants; ils s’assemblent en réseaux complexes dans les biosystèmes pour synchroniser une myriade d’événements de la vie. Les protéines utilisent généralement des réseaux d’interactomes complexes pour remplir leurs fonctions; il est donc obligatoire d’évaluer de telles interactions pour démêler leur importance dans les cellules aux niveaux cellulaire et de l’organisme. Pour atteindre cet objectif, nous introduisons une technologie en émergence rapide, la biodétection à effet de champ (FEB), pour déterminer des interactions biomoléculaires spécifiques. FEB est une technique de détection biomoléculaire fiable et sans étiquette de paillasse pour déterminer des interactions spécifiques et utilise des biocapteurs électroniques de haute qualité. La technologie FEB peut surveiller les interactions dans la gamme nanomolaire en raison des nanomatériaux biocompatibles utilisés sur sa surface de biocapteur. Comme preuve de concept, l’interaction protéine-protéine (IPP) entre la protéine de choc thermique 90 (Hsp90) et le cycle de division cellulaire 37 (Cdc37) a été élucidée. Hsp90 est un chaperon moléculaire dépendant de l’ATP qui joue un rôle essentiel dans le repliement, la stabilité, la maturation et le contrôle de la qualité de nombreuses protéines, régulant ainsi de multiples fonctions cellulaires vitales. Cdc37 est considéré comme un chaperon moléculaire spécifique à la protéine kinase, car il reconnaît et recrute spécifiquement les protéines kinases à Hsp90 pour réguler leurs voies de transduction du signal en aval. En tant que tel, Cdc37 est considéré comme un co-chaperon de Hsp90. La voie chaperon-kinase (complexe Hsp90/Cdc37) est hyper-activée dans de multiples tumeurs malignes favorisant la croissance cellulaire; par conséquent, c’est une cible potentielle pour le traitement du cancer. La présente étude démontre l’efficacité de la technologie FEB à l’aide du système modèle Hsp90/Cdc37. Feb a détecté un fort IPP entre les deux protéines (valeurs K_D de 0,014 μM, 0,053 μM et 0,072 μM dans trois expériences indépendantes). En résumé, FEB est une plate-forme de détection PPI sans étiquette et rentable, qui offre des mesures rapides et précises.

Introduction

Interactions biomoléculaires :
Les protéines sont des parties essentielles des organismes et participent à de nombreuses voies moléculaires telles que le métabolisme cellulaire, la structure cellulaire, la signalisation cellulaire, les réponses immunitaires, l’adhésion cellulaire, etc. Alors que certaines protéines remplissent leur(s) fonction(s) indépendamment, la plupart des protéines interagissent avec d’autres protéines en utilisant une interface de liaison pour coordonner l’activité biologique appropriée¹.

Les interactions biomoléculaires peuvent principalement être classées en fonction des c....

Protocole

REMARQUE : Les protéines recombinantes utilisées dans cette étude, Hsp90 et Cdc37, ont été obtenues commercialement (voir tableau des matériaux).

1. Activation de la puce

REMARQUE : Tous les matériaux à utiliser dans l’expérience sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Filtrer toutes les solutions préparées à l’aide d’un filtre stérile de 0,2 μm.

1. Préparer une solution de 1-Éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimure (EDC) en ajoutant 2 mg d’EDC à 2,5 mL de tampon d’acide éthane-sulfonique (MES) de 1 M2-(N-morpholino) éthane sulfonique (pH = 6,0)....

Résultats

Résultats de l’expérience 1 :
La protéine cible Hsp90 (500 nM) a été immobilisée sur la puce en suivant le protocole d’immobilisation cible décrit ci-dessus. Pour la première expérience, 10 concentrations de la protéine analytique Cdc37, allant de 25 nM à 5 000 nM, ont été préparées sur la base des données disponibles dans la littérature (voir tableau 1).

Les étapes de l’expérience peuvent être surveillées en temps réel en suivan.......

Discussion

Dans cette étude, la faisabilité de l’utilisation de la technologie FEB (une approche de caractérisation cinétique en temps réel) a été évaluée pour déterminer l’interaction biomoléculaire entre Hsp90 et Cdc37. L’expérience exploratoire initiale (première expérience) suggérait que le choix des concentrations d’analyte appropriées est une partie essentielle de l’expérience et que l’expérience devrait être conçue en incluant des points de concentration au-dessus et au-dessous de la valeur K<.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated analysis software	Agile plus software, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)	Agile plus software, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	biosensor chip
Data review software	Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag	CelluSep,  Membrane filtration products	T2-10-15 CAS number: NA	T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)	Cardea (Nanomed)	EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8	White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system	Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)	NA CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer	Merck	M3671-50G CAS number: 4432-31-9	White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips	Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10	Bio-Lab	001623237500  CAS number: 7758-11-4	Liquid transparent solution
Pipete	Thermo Scientific	11855231 CAS number: NA	Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)	Cardea (Nanomed)	0105-001-002-001 CAS number: NA	Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))	Cardea (Nanomed)	0105-001-003-001 CAS number: NA	Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37	Abcam	ab256157 CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta	Abcam	ab80033 CAS number: NA
Spreadsheet	Excel, Microsoft office	NA CAS number: NA
Statistical software	GraphPad, Prism	NA CAS number: NA	Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS	Cardea (Nanomed)	NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7	White powder
Tips	Alex red	LC 1093-800-000 CAS number: NA	Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs