Un modèle murin pour la transition de Streptococcus pneumoniae de colonisateur à pathogène lors d’une co-infection virale récapitule la maladie exacerbée par l’âge

Résumé

Cet article décrit un nouveau modèle murin pour la transition du pneumocoque d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène pathogène au cours d’une infection virale. Ce modèle peut être facilement adapté pour étudier les interactions polymicrobiennes et hôte-pathogène au cours des différentes phases de la progression de la maladie et entre divers hôtes.

Résumé

Streptococcus pneumoniae (pneumocoque ) est un colonisateur asymptomatique du nasopharynx chez la plupart des individus, mais peut évoluer vers un agent pathogène pulmonaire et systémique lors de l’infection par le virus de la grippe A (IAV). L’âge avancé augmente la susceptibilité de l’hôte à la pneumonie pneumococcique secondaire et est associé à une aggravation de l’issue de la maladie. Les facteurs de l’hôte à l’origine de ces processus ne sont pas bien définis, en partie à cause d’un manque de modèles animaux qui reproduisent la transition de la colonisation asymptomatique à la maladie clinique grave.

Cet article décrit un nouveau modèle murin qui recrée la transition des pneumocoques du portage asymptomatique à la maladie lors d’une infection virale. Dans ce modèle, les souris sont d’abord inoculées par voie intranasale avec des pneumocoques cultivés par biofilm pour établir un portage asymptomatique, suivi d’une infection par le VAI du nasopharynx et des poumons. Il en résulte une dissémination bactérienne dans les poumons, une inflammation pulmonaire et des signes évidents de maladie pouvant évoluer vers la létalité. Le degré de maladie dépend de la souche bactérienne et des facteurs de l’hôte.

Fait important, ce modèle reproduit la susceptibilité au vieillissement, car par rapport aux jeunes souris, les souris âgées présentent une maladie clinique plus grave et succombent à la maladie plus fréquemment. En séparant le portage et la maladie en étapes distinctes et en offrant la possibilité d’analyser les variantes génétiques de l’agent pathogène et de l’hôte, ce modèle de co-infection S. pneumoniae/IAV permet l’examen détaillé des interactions d’un pathobioonte important avec l’hôte à différentes phases de la progression de la maladie. Ce modèle peut également servir d’outil important pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles contre la pneumonie pneumococcique secondaire chez les hôtes sensibles.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumocoque) sont des bactéries à Gram positif qui résident asymptomatiquement dans le nasopharynx de la plupart des individus en bonne santé ^1,2. Favorisés par des facteurs qui ne sont pas complètement définis, les pneumocoques peuvent passer de colonisateurs bénins du nasopharynx à des agents pathogènes qui se propagent à d’autres organes entraînant des infections graves, notamment l’otite moyenne, la pneumonie et la bactériémie³. La présentation de la pneumococcie dépend, en partie, des différences spécifiques à la souche, y compris le sérotype, qui est basé sur la composition des polysaccharides capsulaires. Plus de 100 sérotypes ont été caractérisés jusqu’à présent, et certains sont associés à des infections plus invasives ^4,5. Plusieurs autres facteurs augmentent le risque de pneumococcie. L’un de ces facteurs est l’infection virale, où le risque de pneumonie pneumococcique est multiplié par 100 par IAV ^6,7. Historiquement, S. pneumoniae est l’une des causes les plus fréquentes de pneumonie bactérienne secondaire après la grippe et est associée à de pires résultats⁸. Un autre facteur de risque majeur est l’âge avancé. En fait, S. pneumoniae est la principale cause de pneumonie bactérienne d’origine communautaire chez les personnes âgées de plus de 65 ans ^9,10. Les personnes âgées représentent la majorité (>75 %) des décès dus à la pneumonie et à la grippe, ce qui indique que les deux facteurs de risque - le vieillissement et l’infection par le VAI - aggravent de façon synergique la susceptibilité à la maladie^11,12,13,14. Cependant, les mécanismes par lesquels l’infection virale provoque la transition des pneumocoques du colonisateur asymptomatique à l’agent pathogène invasif et la façon dont cela est façonné par les facteurs de l’hôte restent mal définis. Cela est dû en grande partie à l’absence d’un modèle de petit animal qui récapitule la transition de la colonisation pneumococcique asymptomatique à la maladie clinique critique.

Les études de co-infection ont classiquement été modélisées chez des souris inoculées avec des pneumocoques directement dans les poumons 7 jours après l’infection grippale^15,16. Cela reproduit la susceptibilité à la pneumonie bactérienne secondaire et est idéal pour étudier comment les réponses immunitaires antivirales altèrent les défenses antibactériennes¹⁷. Cependant, des études longitudinales chez l’homme ont démontré que le portage pneumococcique dans le nasopharynx, où les bactéries peuvent former des biofilms asymptomatiques¹⁸, est uniformément associé à des maladies invasives ^19,20. Les isolats bactériens provenant d’infections de l’oreille moyenne, des poumons et du sang sont génétiquement identiques à ceux trouvés dans le nasopharynx²⁰. Ainsi, pour étudier la transition du portage asymptomatique à la maladie invasive à la suite d’une infection par le VAI, un modèle a été établi dans lequel des souris ont reçu par voie intranasale des pneumocoques cultivés par biofilm suivis d’une infection par le VAI du nasopharynx^21,22. L’infection virale des voies respiratoires supérieures a entraîné des changements dans l’environnement de l’hôte qui ont entraîné la dispersion des pneumocoques à partir de biofilms et leur propagation aux voies respiratoires inférieures²¹. Ces bactéries dispersées avaient une expression régulée à la hausse de facteurs de virulence importants pour l’infection, les convertissant de colonisateurs en agents pathogènes²¹. Ces observations mettent en évidence l’interaction complexe entre le virus, l’hôte et la bactérie et démontrent que les changements de l’hôte déclenchés par l’infection virale ont un impact direct sur le comportement pneumococcique, qui, à son tour, modifie le cours de l’infection bactérienne. Cependant, ce modèle ne récapitule pas les signes graves de maladie observés chez les humains, probablement parce que le virus est limité aux fosses nasales et que les effets systémiques de l’infection virale sur l’immunité de l’hôte et les lésions pulmonaires ne sont pas récapitulés.

Nous avons récemment établi un modèle qui intègre l’interaction complexe entre l’hôte et les agents pathogènes, mais qui imite aussi plus étroitement la gravité de la maladie observée chez l’homme²³. Dans ce modèle, les souris sont d’abord infectées par voie intranasale par des pneumocoques cultivés par biofilm pour établir un portage asymptomatique, suivi d’une infection par le VAI du nasopharynx et des poumons. Cela a entraîné une dissémination bactérienne dans les poumons, une inflammation pulmonaire et une maladie qui a évolué vers la létalité chez une fraction des jeunes souris²³. Cette étude antérieure a démontré que l’infection virale et bactérienne modifiait la défense de l’hôte : l’infection virale favorisait la dissémination bactérienne et la colonisation bactérienne antérieure altérait la capacité de l’hôte à contrôler les niveaux d’IAV pulmonaires²³. L’examen de la réponse immunitaire a révélé que l’infection par le VAI diminuait l’activité antibactérienne des neutrophiles, tandis que la colonisation bactérienne atténuait la réponse à l’interféron de type I essentielle à la défense antivirale²³. Fait important, ce modèle reproduisait la susceptibilité au vieillissement. Par rapport aux jeunes souris, les souris âgées présentaient des signes de maladie plus tôt, présentaient une maladie clinique plus grave et succombaient à une infection plus fréquemment23. Les travaux présentés dans ce manuscrit montrent que le degré de maladie dépend également de la souche bactérienne, car les souches invasives de pneumocoque affichent une dissémination plus efficace lors de l’infection par le VAI, montrent des signes plus manifestes d’inflammation pulmonaire et entraînent des taux accélérés de maladie par rapport aux souches non invasives. Ainsi, ce modèle de co-infection S. pneumoniae/IAV permet l’examen détaillé des facteurs pathogènes et des facteurs de l’hôte et est bien adapté à l’étude des réponses immunitaires aux infections polymicrobiennes aux différentes phases de la progression de la maladie.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’établissement de l’Université de Buffalo.

1. Préparation de milieux chimiquement définis (MDP)

1. Préparez les stocks comme suit:
   1. Dissoudre les composés du mélange I énumérés au tableau 1 dans 100 mL d’eau ultrapure en agitant les mélanges. Conserver dans des aliquotes de 200 μL à −20 °C.
   2. Dissoudre les composés du mélange II énumérés au tableau 1 dans 20 mL de NaOH 0,1 M en agitant. Conserver dans des aliquotes de 100 μL à −20 °C.
   3. Dissoudre les composés du mélange III énumérés au tableau 1 dans 1 mL d’eau ultrapure pendant l’agitation. Conserver dans des aliquotes de 10 μL à 4 °C.
   4. Dissoudre le composé IV du mélange indiqué au tableau 1 dans 1 mL d’eau ultrapure en agitant le mélange. Conserver dans des aliquotes de 10 μL à −20 °C.
   5. Dissoudre d’abord les composés énumérés dans le tableau 2 dans 15 mL d’eau ultrapure en agitant. Ajuster le pH à 7,0 avec quelques gouttes de 0,1 M de NaOH et ajuster le volume final à 20 mL en utilisant de l’eau ultrapure. Conserver dans 1 mL d’aliquotes à −20 °C.
   6. Dissoudre les composés énumérés au tableau 3 dans 90 mL d’eau ultrapure sur une plaque chauffante à 50 °C en agitant. Ajustez le pH à 7,0 avec 0,1 M de NaOH, puis ajustez le volume final à 100 mL avec de l’eau ultrapure. Conserver dans des aliquotes de 5 mL à −20 °C.
2. Préparer le bouillon de démarrage frais à chaque fois en dissolvant les composés du tableau 4 dans 70 ml d’eau ultrapure en agitant.
3. Au stock de démarrage frais, ajoutez les mélanges suivants dans l’ordre : 200 μL de stock de Mix I (tableau 1), 80 μL de Mix II (Tableau 1), 10 μL de Mix III (Tableau 1), 10 μL de Mix IV (Tableau 2), 1 mL de Vitamin Stock (Tableau 3) et 5 mL de Amino Acid Stock (Tableau 4).
4. Une fois les bouillons ajoutés, ajustez le volume final à 100 mL en ajoutant 30 mL d’eau ultrapure dans le bécher.
5. Compléter le MDP avec des composés du tableau 4. Une fois bien mélangé, stériliser par filtre et conserver à 4 °C pendant un maximum de 2 semaines.

2. Culture du biofilm de S. pneumoniae

1. Préparer le milieu RP-10 en mélangeant 445 mL de RPMI 1640 avec 50 mL de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 5 mL de pénicilline/streptomycine à 10 000 U/mL et 10 000 μg/mL, respectivement.
2. Cultivez la lignée cellulaire de carcinome mucoépidermoïde NCI-H292 (H292). Ajouter les cellules d’un flacon acheté à 5 mL de milieu RP-10 dans une fiole traitée par culture tissulaire T-25. Incuber à 37 °C/5% CO₂ pendant 3-5 jours pour atteindre 100% de confluence.
3. Vérifiez les cellules au microscope optique en utilisant un grossissement 10x pour évaluer la confluence.
   REMARQUE: Lorsque toutes les cellules sont en contact avec d’autres cellules et qu’il n’y a pas d’espaces entre les deux, la confluence souhaitée à 100% est atteinte.
4. Lavez les cellules 2x dans 5 mL de PBS à température ambiante. Assurez-vous que le tampon est exempt de calcium pour éviter de chélater l’EDTA à l’étape suivante.
5. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA dans la fiole et incuber à 37 °C/5 % de CO₂ pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent. Neutraliser avec 4 mL de milieu RP-10. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas et transférer dans un tube conique de 50 mL.
6. Ajouter 500 μL de suspension cellulaire par puits à une plaque de 24 puits traitée par culture tissulaire. À partir d’une fiole confluente de T-25, attendez-vous à 2 × 10 6-4^× 10⁶ cellules/mL.
7. Le lendemain, vérifiez les cellules au microscope optique pour vous assurer qu’elles sont confluentes, comme à l’étape 2.3. Si ce n’est pas le cas, incuber plus longtemps.
8. Une fois que les cellules H292 sont confluentes à 100 % dans la plaque de 24 puits, lavez doucement les cellules 3x avec 1 mL de PBS à température ambiante pour vous assurer qu’il ne reste aucun milieu contenant des antibiotiques ou des débris.
9. Après avoir lavé les cellules, ajouter 250 μL/puits de paraformaldéhyde à 4 % pour fixer les cellules. Incuber pendant 1 h sur glace ou toute la nuit à 4 °C.
10. La nuit précédant la fixation cellulaire, étaler la souche d’intérêt de S. pneumoniae sur des plaques de gélose au sang et incuber pendant une nuit à 37 °C/5 % de CO₂.
    REMARQUE : Les données présentées ici portent sur les souches de S. pneumoniae suivantes obtenues par échange collaboratif : isolat d’otite moyenne EF3030 24 du sérotype 19F, souche D39²⁵ d’Avery de sérotype 2 classique et isolat de bactériémie de sérotype 4^{TIGR4 26}. Les souches sont également disponibles dans les collections publiques référencées dans le Tableau des matériaux.
11. Préparer le MDP plus oxyrase (0,15 U/mL) en ajoutant 100 μL d’oxyrase (30 U/mL) à 20 mL de MDP.
    NOTE: L’oxyrase est utilisée pour éliminer l’oxygène afin de permettre la croissance efficace de S. pneumoniae en culture liquide²⁷.
12. Inoculer les bactéries de la plaque dans du CDM + oxyrase frais en lavant les bactéries de la plaque en ajoutant 1 mL de CDM + oxyrase et en soulevant doucement les colonies bactériennes à l’aide du côté d’un embout de pipette de 1 mL, en prenant soin de ne pas gratter l’agar. Alternativement, utilisez une boucle d’inoculation pour soulever les bactéries et les inoculer dans un tube contenant 1 mL du CDM + oxyrase.
13. Diluer les bactéries dans CDM + oxyrase à une DO initiale_{de 600} de 0,05.
14. Cultiver les bactéries dans un tube conique de 50 mL à coiffage lâche à 37 °C/5 % de CO 2 jusqu’à ce qu’une DO₆₀₀ de 0,2 soit atteinte (cela prendra entre₂ et 5 h). Vérifiez la DO₆₀₀ toutes les heures pour vous assurer qu’elle ne dépasse pas 0,2.
15. Une fois que la DO a atteint 0,2, faire tourbillonner le tube de culture bactérienne. Ensemencer 0,5 mL de bactéries sur les cellules H292 fixées et ajouter 0,5 mL de MDP + milieu oxyrase par puits. Ajouter 1 mL de CDM + oxyrase aux puits de contrôle sans bactéries. Incuber la plaque pendant 48 h à 34 °C/5% CO₂.
    NOTE: La croissance à 34 ° C est utilisée pour imiter plus étroitement la température plus basse dans le nasopharynx²¹.
16. Toutes les 12 heures suivant l’ensemencement initial, retirer délicatement 0,5 mL du milieu et reconstituer avec 0,5 mL de CDM + oxyrase fraîche. Veillez à ne pas perturber la formation du biofilm. Vérifiez le fond de la plaque pour le biofilm et recherchez une nébulosité croissante au fil du temps en raison de la croissance du biofilm. Pour contrôler la contamination, vérifiez les puits sans bactéries pour vous assurer que les puits de contrôle restent clairs.
17. À 48 h après l’inoculation, retirer le surnageant et laver 2x très doucement avec 1 mL de PBS. Remettez en suspension dans 1 mL de MDP frais et pipette vigoureusement de haut en bas pour soulever le biofilm. Pour chaque souche bactérienne, regrouper les bactéries de tous les puits dans un tube conique de 50 mL. Bien mélanger en inclinant doucement le tube bien bouché de haut en bas plusieurs fois.
18. Dans le tube conique de 50 mL, ajouter 40 % de glycérol dans le MDP à des volumes égaux pour obtenir une suspension bactérienne avec une concentration finale de 20 % de glycérol. Aliquote 1 mL dans des tubes microcentrifugeurs, surgeler sur de la glace sèche et économiser à −80 °C.
19. Avant utilisation, énumérer les bactéries en décongelant une partie aliquote sur de la glace, en faisant tourner le tube à 1 700 × g pendant 5 minutes, en retirant le surnageant, en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de PBS et en plaquant les dilutions en série sur des plaques de gélose au sang²⁸.
20. Faire pousser les plaques de gélose pendant une nuit à 37 °C/5 % de CO₂ et compter les colonies aux dilutions pertinentes pour obtenir la concentration bactérienne en unités formant colonies (UFC)/mL.
    REMARQUE: Il est recommandé de dénombrer les bactéries dans les stocks au moins un jour après la congélation ou plus tard, car il y a une baisse de la viabilité bactérienne dans les premières 24 heures. Les aliquotes congelées stockées peuvent être utilisées pour l’infection ultérieure de souris pendant un maximum de 2 mois.

3. Inoculation intranasale de souris avec S. pneumoniae cultivé en biofilm

1. Achetez des souris et utilisez-les à l’âge souhaité.
   REMARQUE: Les souris âgées de 3-4 mois sont préférées aux jeunes hôtes modèles, et les souris âgées de 21 à 24 mois peuvent être utilisées pour modéliser des personnes âgées de >65 ans²⁹ ans. Les données présentées ici concernent des souris mâles C57BL/6.
2. Décongeler les aliquotes bactériennes cultivées sur le biofilm sur la glace et faire tourner à 1 700 × g pendant 5 minutes. Retirer et jeter soigneusement le surnageant sans perturber la pastille, laver les bactéries en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de PBS et essorer à nouveau à 1 700 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le volume nécessaire pour atteindre la concentration désirée (viser 5 × 10⁶ UFC/10 μL pour l’inoculation intranasale). Confirmer les quantités de bactéries administrées en plaquant l’inoculum préparé sur des plaques de gélose au sang comme à l’étape 2.19.
3. Inoculer les souris par voie intranasale avec 5 × 10^{6 UFC} en pipetant 5 μL de l’inoculum dilué dans chaque naris. Assurez-vous de tenir fermement les souris, en stabilisant la tête, jusqu’à ce que le volume soit inhalé (généralement dans les secondes qui suivent le pipetage du volume dans les narines). Effectuez cette étape en l’absence d’anesthésie pour prévenir l’aspiration pulmonaire de l’inoculum.

4. Infection virale par le virus de la grippe A (IAV)

1. À 48 heures après l’inoculation intranasale de S. pneumoniae, décongeler la souche d’IAV d’intérêt sur la glace.
   REMARQUE : Les données présentées ici concernent une souche adaptée à la souris du virus de la grippe A A/PR/8/34 H1N1 qui a été obtenue par échange collaboratif³⁰.
2. Une fois que le virus a dégelé, diluer le virus dans du PBS à la concentration désirée; viser 20 unités de formation de plaques (UFP)/50 μL pour l’infection intratrachéale et 200 UFP/10 μL pour l’infection intranasale. Pour les groupes simulés infectés et uniquement bactériens, utilisez PBS pour inoculer les souris.
3. Placez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux des souris avant l’anesthésie. Anesthésier les souris à l’aide d’isoflurane à 5% et confirmer l’anesthésie par un pincement ferme des orteils.
4. Une fois que l’animal est anesthésié, retirez-le de la chambre isoflurane et infectez immédiatement les souris anesthésiées avec 50 μL (20 UFP) d’IAV par voie intratrachéale à l’aide d’une pince à épiler émoussée pour retirer la langue de la bouche et pipeter le volume de liquide dans la trachée.
5. Placez les souris dans une cage séparée et surveillez jusqu’à leur récupération complète (elles sont capables de maintenir une position couchée sternale [capable de se tenir debout sur la poitrine]).
6. Après la récupération, inoculer immédiatement par voie intranasale aux souris 10 μL (200 UFP) de IAV en utilisant la méthode d’inoculation de l’étape 3.3.
7. Souris domestiques qui ont subi une infection bactérienne et virale simple ou double avec le même groupe d’infection et les séparer des autres groupes.

5. Surveillance des souris pour détecter les symptômes de la maladie

1. Surveillez les souris quotidiennement pendant au moins 10 jours et notez aveuglément les signes de maladie comme suit:
   1. Score comme suit pour la perte de poids: 0 = 5% ou moins; 1 = 5 %-10 %; 2 = 10 %-15 %; 3 = 20 % ou plus. Euthanasier les souris en utilisant l’inhalation de CO₂ lorsque le score de perte de poids est de 3.
   2. Score suivant pour l’activité : 0 = normal/actif; 1 = en mouvement mais légèrement diminué; 2 = diminué; 3 = gravement diminué/léthargique (ne bouge qu’au toucher), 4 = coma/immobile. Euthanasier les souris lorsque le score d’activité est de 3.
   3. Score suivant pour la posture : 0 = pas d’intuition (normale); 1 = posture légèrement voûtée; 2 = intuition sévère. Euthanasier les souris lorsque le score de posture est de 2.
   4. Le score suivant pour les yeux : 0 = normal ; 1 = saillie; 1 = coulé; 1 = fermé; 1 = décharge. Il peut s’agir d’une combinaison. Additionnez les totaux pour le score final de l’œil.
   5. Score suivant pour la respiration: 0 = respiration normale; 1 = irrégulier ou altéré (taux supérieur/inférieur); 2 = laborieux (effort exagéré ou halètement). Euthanasier les souris lorsque le score respiratoire est de 2.
2. Sur la base des critères ci-dessus, additionnez les scores individuels pour un score clinique total de sain (0) à extrêmement malade (15). Considérez que toute souris affichant un score total supérieur à 2 est malade. Euthanasier sans cruauté toute souris affichant un score total supérieur à 9 ou les scores indiqués pour chaque critère et les marquer sur la courbe de survie.

6. Traitement des tissus infectés pour le dénombrement bactérien

1. À 48 heures suivant l’infection par le VIA, euthanasier les souris.
2. Placez la souris en décubitus dorsal. En utilisant de l’éthanol à 70%, vaporisez la poitrine et l’abdomen de la souris pour nettoyer la fourrure. À l’aide d’une pince, pincez la fourrure et la peau au milieu de la souris et coupez la fourrure avec des ciseaux à dissection de 4,5 pouces pour exposer la zone du foie jusqu’à la poitrine.
3. Collecte de sang
   1. À l’aide de ciseaux à dissection, couper doucement dans la cavité péritonéale pour exposer le foie. À l’aide d’une pince, exposez la veine porte hépatique située au sommet du foie, près du diaphragme. Couper la veine porte hépatique à l’aide des ciseaux de dissection. Une fois que le sang commence à s’accumuler dans la cavité péritonéale, prélever 10 μL de sang à l’aide d’une micropipette et placer dans 90 μL de solution anticoagulante (solution d’EDTA à 50 mM dans du PBS) dans un tube microcentrifugé pour le placage de la charge bactérienne.
   2. Utilisez une micropipette P-1000 pour recueillir le reste du sang, placez-le dans un tube de prélèvement sanguin et centrifugez à 7 600 × g pendant 2 minutes pour recueillir le sérum. Conservez les sérums dans des tubes de microcentrifugation à -80 °C pour une analyse ultérieure de toute cytokine ou métabolite souhaité.
4. Prélèvement pulmonaire
   1. À l’aide de ciseaux à dissection, faites une découpe sur les côtés de la cage thoracique exposée et tirez doucement les côtes vers la tête de la souris pour exposer le cœur. Insérez une aiguille de 25 G fixée à une seringue de 10 ml préremplie de PBS dans le ventricule droit et commencez à perfuser lentement. Recherchez le blanchiment des poumons comme indicateur de perfusion réussie. Rincer lentement pour éviter de casser le tissu pulmonaire.
   2. Soulevez le cœur avec la pince et faites une coupe pour séparer les poumons et le cœur. Une fois séparé, ramassez tous les lobes du poumon avec la pince et rincez dans un plat avec du PBS stérile pour éliminer tout sang résiduel. Dans une boîte de Pétri, hacher les poumons en petits morceaux et bien mélanger. Retirer la moitié du mélange pulmonaire pour déterminer l’UFC bactérienne ou l’UFP virale et le placer dans un tube à fond rond de 15 mL prérempli de 0,5 mL de PBS pour homogénéisation.
      REMARQUE : Il est important de ne pas prélever différents lobes du même poumon pour les diverses évaluations. Au lieu de cela, tous les lobes doivent être hachés, bien mélangés et analysés de manière égale pour les différentes évaluations.
   3. Retirer l’autre moitié du poumon pour la cytométrie en flux (section 7 ci-dessous) et la placer dans une plaque de 24 puits non traitée par culture tissulaire avec chaque puits prérempli de 0,5 mL de RP-10. Laisser à température ambiante jusqu’au traitement.
5. Collection de nasopharynx
   1. Au niveau du cou, utilisez les ciseaux de dissection pour couper la fourrure, puis coupez le muscle et exposez la trachée.
      NOTE: La trachée est une structure en forme de tube située sous le muscle.
   2. Placez de petites pinces sous la trachée à une distance de 1 cm de la mâchoire de la souris pour la stabiliser. À l’aide de ciseaux à dissection, faire doucement une fente de 0,1 cm sur la partie antérieure de la trachée, en évitant de couper complètement la trachée.
   3. Préparez une seringue de 1 mL remplie de 0,5 mL de PBS avec un tube de 0,58 mm attaché à une aiguille de 25 G. Recueillir le lavage nasal en insérant le tube dans la trachée en remontant vers le nasopharynx. Une fois que la résistance est ressentie dans la cavité nasale, placez un tube microcentrifuge au nez et rincez lentement le PBS à travers la trachée pour recueillir le lavage nasal.
   4. Placez la souris en position couchée. Vaporisez la tête de la souris avec de l’éthanol. Utilisez des ciseaux à dissection pour couper la fourrure et un coussinet mystatique pour exposer l’os de la tête de la souris.
   5. À l’aide des ciseaux à dissection, faites une coupe de 1 cm sur les côtés de la mandibule et entre les yeux. À l’aide de forceps, retirez lentement les os du visage du corps pour exposer la cavité nasale.
   6. Utilisez une pince pour retirer délicatement le tissu nasal et placez-le dans un tube inférieur rond prérempli de 0,5 ml de PBS pour l’homogénéisation.
6. Pour homogénéiser le tissu collecté, nettoyez d’abord la sonde homogénéisante en la mettant dans de l’éthanol à 70% et en allumant l’homogénéisateur à 60% de puissance pendant 30 s. Répétez l’étape dans de l’eau stérile pendant 10 s. Homogénéiser chaque tissu pendant 1 min. Nettoyez la sonde homogénéisante dans de l’eau stérile entre chaque échantillon et dans un tube frais d’éthanol à 70 % entre chaque organe et groupe d’échantillons.
7. Dénombrement des nombres bactériens
   1. Une fois que tous les organes ont été prélevés et homogénéisés, diluer en série sur des plaques de gélose au sang. Pour calculer l’UFC totale, utilisez 10 μL dans la plaque et notez le volume final en mL pour chaque échantillon. Plaquer les échantillons du nasopharynx sur des plaques de gélose au sang additionnées de gentamicine de 3 μg/mL pour sélectionner la croissance de S. pneumoniae tout en inhibant la croissance d’autres microorganismes qui colonisent ce tissu. Incuber pendant une nuit à 37 °C/5% CO₂.
   2. Pour énumérer l’UFC bactérienne pour le poumon et le nasopharynx, comptez d’abord les colonies sur les plaques de gélose au sang. Ensuite, utilisez l’équation (1) et l’équation (2) pour calculer la quantité par mL et le nombre total.
      Quantité par mL = nombre de colonies × facteur de dilution × 100 (1)
      Nombre total = quantité par mL × volume total par échantillon (2)
      NOTE: Dans l’équation (1), 100 est utilisé pour multiplier puisque 10 μL est plaqué, ce qui est une dilution 100 fois de 1 mL. Le volume total par échantillon dans l’équation (2) provient de l’étape 6.7.1, ce qui donne la limite de détection de 100 par organe.
   3. Pour énumérer l’UFC bactérienne Pour la bactériémie, comptez d’abord les colonies sur les plaques de gélose au sang. Ensuite, utilisez l’équation (3) pour déterminer la quantité par mL de sang.
      Quantité par mL de sang = nombre de colonies × facteur de dilution × 100 × 10 (3)
      NOTE: Dans l’équation (3), 100 est utilisé lorsque 10 μL est plaqué, ce qui correspond à une dilution de 100 fois de 1 mL, et 10 indique une dilution de 1:10 du sang dans l’anticoagulant. Il en résulte une limite de détection de 1 000/mL.

7. Traitement des échantillons pulmonaires pour la cytométrie en flux

1. Préparez le support requis comme suit :
   1. Préparer le PR-10 tel que décrit à l’étape 2.1.
   2. Préparer le tampon de digestion en mélangeant le RP-10 avec 2 mg/mL de collagénase et 30 μL/mL de DNase I.
   3. Préparer le tampon de lyse en dissolvant 8,29 g de_NH4Cl, 1 g de_NaHCO3 et 0,038 g d’EDTA dans 1 L de_H2O.
   4. Préparer 10x tampon FACS en mélangeant 450 mL de HBSS avec 50 mL de FBS inactivé par la chaleur et 5 g d’azoture de sodium.
   5. Préparer 1x tampon FACS en diluant 50 mL de 10x tampon FACS dans 450 mL de HBSS.
2. Prélever les échantillons pulmonaires de l’étape 6.4.3 et les placer dans une plaque à 24 puits. Ajouter 500 μL de tampon de digestion à chaque puits. Incuber pendant 45 min jusqu’à 1 h à 37 °C/5% CO₂.
3. Préremplir 50 ml de tubes coniques pour chaque échantillon avec 5 mL de RP-10. Lorsque l’incubation est terminée, placez un filtre de 100 μm au sommet du tube conique de 50 ml et mouillez-le avec 1 mL de RP-10.
4. À l’aide d’une micropipette P-1000, déplacez les poumons digérés et placez-les sur le filtre. Utilisez le piston d’une seringue de 3 ml pour écraser l’organe. Rincer 2x avec 1 mL de RP-10 à chaque fois.
5. Faire tourner les échantillons à 4 °C et 327 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de tampon de lyse. Laisser reposer 3 min pour permettre la lyse des globules rouges. Neutraliser avec 5 mL de RP-10.
6. Faire tourner les échantillons à 4 °C et 327 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant, remettre en suspension la pastille dans 1 mL de RP-10 et prélever 10 μL pour compter les échantillons.
7. Faire tourner les échantillons à 4 °C et 327 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le RP-10 à 2 × 10 6-4 × 10⁶ cellules/mL. Ajouter 60 μL de chaque échantillon dans une plaque de 96 puits pour colorer les types de cellules^{désirés 23} énumérés à l’étape 7.9, tableau 5 et tableau 6.
8. Faire tourner la plaque à 4 °C et 327 × g pendant 5 min.
9. Pendant ce temps, préparez les mélanges maîtres d’anticorps, fluorescents moins un (FMO), et les témoins à coloration unique avec les anticorps souhaités. Pour colorer les leucocytes polymorphonucléaires (PMN), les macrophages, les monocytes, les cellules dendritiques et les lymphocytes T, utilisez les anticorps et les dilutions finales énumérés dans les tableaux 5 et 6. Utiliser un volume total de 100 μL/puits du mélange d’anticorps. Suivez les dilutions indiquées dans les tableaux pour déterminer le volume approprié du mélange maître et les anticorps individuels requis.
10. Lorsque l’essorage est terminé (étape 7.8), décanter le surnageant, remettre les pastilles en suspension dans 100 μL des mélanges d’anticorps, des FMO ou des témoins à coloration unique, et incuber sur de la glace pendant 30 minutes dans l’obscurité.
11. Laver les cellules 2x en ajoutant 150 μL de tampon FACS dans les puits et en faisant tourner la plaque à 4 °C et 327 × g pendant 5 min.
12. Lorsque l’essorage est terminé, décanter le surnageant, remettre les pastilles en suspension dans 100 μL de tampon de fixation et incuber sur de la glace pendant 20 min.
13. Laver les cellules 2x en ajoutant 150 μL de tampon FACS dans les puits et en faisant tourner la plaque à 4 °C et 327 × g pendant 5 min.
14. Préparer des tubes FACS marqués avec 200 μL de tampon FACS. Remettez les pastilles en suspension dans 150 μL de tampon FACS. Filtrer individuellement chaque échantillon dans leur tube FACS correspondant à l’aide d’un filtre de 100 μm. Conserver sur la glace ou à 4 °C et à l’abri de la lumière jusqu’à ce que vous soyez prêt à analyser.
15. Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.

8. Dosage de plaque pour le dénombrement de l’IAV

1. Préparez le support requis comme suit :
   1. Préparer le milieu infectieux en dissolvant 2,5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 40 mL de DMEM en agitant à 37 °C pendant 10-20 minutes jusqu’à dissolution. Filtrer-stériliser en 460 ml de DMEM.
   2. Préparer la cellulose microcristalline à 2,4 % en dissolvant 1,2 mg de cellulose microcristalline dans 50 mL de_H2O. Autoclave sur le liquide et conserver à température ambiante.
   3. Préparer 5 % de BSA DMEM en dissolvant 2,5 g de BSA dans 40 mL de DMEM en agitant à 37°C pendant 10-20 min. Ajouter les 10 mL restants de DMEM pour obtenir un volume final de 50 mL. Filtrer-stériliser et conserver à 4 °C.
   4. Préparer 2x MEM/0,5% BSA en mélangeant 1 mL de DMEM BSA à 5% avec 9 mL de 2x MEM.
   5. Préparer un milieu de recouvrement à faible viscosité en mélangeant un rapport de 1:1 de cellulose microcristalline à 2,4 % et 2 MEM/0,5 % de BSA avec 1 mg/mL de trypsine TPCK (inhibiteur de la chymotrypsine).
   6. Préparer EMEM/FBS à 10 % en mélangeant 450 mL de milieu essentiel minimal (EMEM) d’Eagle avec 50 mL de FBS inactivé par la chaleur.
2. Cultivez la lignée cellulaire de rein canin Madin-Darby (MDCK). Ajouter les cellules d’un flacon acheté à 5 mL d’EMEM/FBS à 10 % dans une fiole traitée par culture tissulaire T-25. Incuber pendant 3 à 5 jours à 37 °C/5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules atteignent 100 % de confluence. Vérifiez la confluence comme à l’étape 2.3.
3. Retirer et jeter le milieu de culture, et rincer 2x avec 5 ml de PBS à température ambiante. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA dans la fiole et incuber à 37 °C/5 % de CO₂ pendant 10-15 minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent. Une fois soulevé, neutraliser avec 4 ml d’EMEM/10 % de FBS pour obtenir une suspension cellulaire à 2 × 10⁵ cellules/mL.
4. Ensemencer les cellules MDCK dans une plaque traitée par culture tissulaire à 12 puits en ajoutant 1 mL de cellules en suspension par puits (à 2 × 10⁵ cellules/puits) 1 jour avant de commencer le dosage de la plaque.
   REMARQUE: Assurez-vous que les cellules atteignent 100% de confluence avant utilisation et incuber plus longtemps si nécessaire pour atteindre la confluence.
5. Pour être utilisées comme étalons, effectuer des dilutions en série 10 fois (10^6-10 1) du stock IAV (d’un titre connu) dans le milieu infectieux indiqué à l’étape 8.1.1. Faire 1,2 mL de chaque dilution à tester en trois exemplaires.
6. Décongeler l’organe homogéné sur la glace. Faites tourner sur une centrifugeuse de table à 2 000 × g et recueillez le surnageant clair.
7. Répétez l’étape 8.5 mais avec le surnageant des échantillons de l’étape 8.6.
8. Aspirez le milieu des cellules et lavez 2x avec 1 mL de PBS pour enlever tout le FBS.
9. Ajouter doucement 300 μL de chaque échantillon de dilution étalon ou dilué en série le long du côté de chaque puits, en commençant par la dilution la plus élevée jusqu’à la plus basse, et en trois exemplaires.
10. Placer les plaques dans l’incubateur à 37 °C/5% CO₂, en agitant la plaque toutes les 10 minutes pendant un total de 50 min. Assurez-vous de les placer à plat dans l’incubateur et ne les empilez pas.
11. Après les 50 min, laver les cellules 2x avec 1 mL de PBS.
12. Ajouter 2 mL du milieu superposé à faible viscosité dans chaque puits, à l’exception des puits à faible dilution et sans virus; À ceux-ci, ajoutez le milieu d’infection et la trypsine.
13. Replacez la plaque dans l’incubateur à 37 °C/5% de CO 2 pendant₂ à 4 jours pour obtenir des plaques visualisables à l’œil nu.
14. Lavez rapidement les plaques en ajoutant 2 ml de PBS dans chaque puits sur le côté et agitez doucement pour suspendre le milieu de recouvrement à faible viscosité déposé.
15. Jetez tout le volume de liquide dans le puits en pipetant doucement le milieu.
16. Répétez le lavage une fois de plus avec 2 mL de PBS dans chaque puits, puis jetez tout le volume de liquide par pipetage doux.
17. Pour fixer les plaques, ajoutez 500 μL de paraformaldéhyde à 4% dans chaque puits, agitez et laissez reposer pendant 30 minutes.
18. Laver lentement sur le côté avec 1 mL de PBS; Ensuite, jetez doucement le liquide.
19. Ajouter 500 μL de violet cristallin à 1 % (dilué dans de l’eau) à chaque puits pour couvrir la monocouche cellulaire. Incuber pendant 5 min.
20. Laver avec 1 ml d’eau du robinet. Assurez-vous d’éliminer tout le liquide dans le puits par pipetage doux. Placez l’assiette à l’envers sur un mate-couches pour sécher pendant la nuit.
21. Comptez les plaques visuellement et enregistrez les images sur n’importe quel imageur disponible.

Résultats

Des S. pneumoniae cultivés sur biofilm (figure 1A) ont été utilisés pour infecter des souris (figure 1B) à l’aide d’un petit inoculum de 10 μL administré par voie intranasale à des souris non anesthésiées. Cet inoculum de petit volume entraîne un portage pneumococcique constant limité au nasopharynx (figures 2A, groupes +sp) tout en évitant la propagation systémique (groupes figure 2B, C +sp). Deux jours après l’inoculation intranasale, les souris ont été infectées par un virus de la grippe A H1N1 adapté aux murins A/PR/8/34 (IAV)^22,30 administré par voie intranasale et intratrachéale pour obtenir une administration constante de quantités spécifiques au nasopharynx et aux poumons ²³.

Ici, le modèle a été utilisé pour comparer l’évolution de la maladie à la suite d’une infection virale chez des souris déficientes par voie intranasale avec différentes souches de S. pneumoniae, y compris TIGR4 et D39, qui sont des souches invasives entraînant une pneumonie qui évolue vers une bactériémie, et EF3030, qui est une souche d’otite moyenne 21,24,25,26,31. La présentation de la maladie chez les souris co-infectées par S. pneumoniae/IAV dépendait de la souche bactérienne (figure 2). Bien qu’il n’y ait pas eu de différence significative dans le nombre de bactéries du nasopharynx (figure 2A) entre les souches, S. pneumoniae TIGR4 et D39, mais pas EF3030, disséminées dans les poumons 48 heures après l’infection par le VAI (figure 2B). Quarante pour cent des souris infectées par voie intranasale par S. pneumoniae TIGR4 ont présenté une dissémination bactérienne dans les poumons, et parmi celles-ci, la moitié d’entre elles sont devenues bactériémiques (Figure 2C), ce qui correspond aux résultats antérieurs²³.

Les souris infectées par voie intranasale par S. pneumoniae D39 ont montré une dissémination plus efficace, car une propagation aux poumons a été observée chez 100 % des souris co-infectées (figure 2B). Comme pour S. pneumoniae TIGR4, la moitié des personnes ont présenté une bactériémie (figure 2C). Dans le suivi de la survie globale, quelle que soit la souche bactérienne, le taux de survie des souris co-infectées était significativement inférieur à celui des souris individuellement confrontées à S. pneumoniae seule pour toutes les souches testées (Figure 2D). Par rapport aux souris témoins exposées avec le IAV seul, les souris infectées par voie intranasale par S. pneumoniae TIGR4 et D39, mais pas EF3030, ont affiché des taux accélérés de maladie. Au jour 2 après l’infection par le VAI, 30 % (D39) et 20 % (TIGR4) des souris avaient succombé, tandis que les groupes témoins composés uniquement d’IAV n’ont commencé à succomber qu’au jour 5 après la provocation (Figure 2D). Les souris co-infectées par S. pneumoniae EF3030 et IAV présentaient des symptômes retardés, plus semblables à ceux des témoins IAV seuls (Figure 2D). Ces résultats démontrent que le modèle de co-infection entraîne chez les jeunes souris en bonne santé une maladie dépendante de la souche bactérienne, ce qui le rend idéal pour explorer les facteurs bactériens requis à chaque étape de la progression de la maladie.

Ce modèle a été utilisé pour évaluer la présence de diverses cellules immunitaires dans les poumons (types de cellules et stratégie de déclenchement à la figure 3) à la suite d’une infection par le VAI chez des souris inoculées par voie intranasale avec différentes souches de S. pneumoniae. Les souches bactériennes D39 et TIGR4, qui se sont dispersées dans les poumons à la suite d’une infection par le VAI, ont provoqué une augmentation significative par rapport à la ligne de base (non infectées) de l’afflux de cellules immunitaires inflammatoires de la circulation, telles que les neutrophiles (PMN) et les monocytes, alors que EF3030 ne l’a pas fait (Figure 4A-C). L’infection par le VAI à elle seule a entraîné une augmentation significative par rapport à la ligne de base de l’afflux de cellules immunitaires importantes pour la défense de l’hôte contre l’infection virale, telles que les cellules NK et les cellules T gamma-delta (Figure 4A-C). Ces réponses antivirales ont été émoussées de façon significative chez les souris infectées par S. pneumoniae par voie intranasale avant la provocation virale (figure 4A-C). Ceci est cohérent avec des études antérieures évaluant les réponses aux cytokines qui ont révélé que le transport de S. pneumoniae atténuait la production d’interférons de type I et nuisait à la capacité de l’hôte à contrôler les charges d’IAV dans les poumons²³. Ces résultats démontrent que le modèle de co-infection peut être utilisé pour étudier comment les réponses immunitaires changent dans les infections mono par rapport aux infections polymicrobiennes.

Ce modèle a également été utilisé pour évaluer l’effet du vieillissement sur l’évolution de la maladie à la suite d’une infection par le VAI chez des souris infectées par voie intranasale par S. pneumoniae TIGR4. Chez les souris infectées isolément, les titres viraux ne variaient pas entre les cohortes jeunes et âgées (figure 5A)²³. Comme dans les études précédentes²³, les souris âgées ont présenté des signes de maladie plus précoces et significativement plus graves que leurs homologues jeunes, comme le démontrent les scores cliniques plus élevés (Figure 5B). Conformément aux symptômes de la maladie, les souris âgées inoculées avec S. pneumoniae ont commencé à mourir plus rapidement dans les 24 heures suivant l’infection par le VAI et toutes ont succombé à la maladie, tandis que les jeunes témoins ont survécu à l’infection à un taux significativement plus élevé (33%) (Figure 5C). Ces résultats démontrent que le modèle de co-infection peut être utilisé pour détecter une maladie plus grave chez les hôtes vulnérables, ce qui le rend idéal pour explorer les facteurs de l’hôte qui confèrent une résistance ou une susceptibilité à la co-infection.

Figure 1 : Chronologie de la co-infection et du traitement des organes pour l’évaluation de l’afflux de cellules immunitaires et de la charge pathogène. (A) Streptococcus pneumoniae est cultivé dans des biofilms. (B) Les souris sont inoculées par voie intranasale avec 5 × 10^{6 UFC} de la souche S. pneumoniae cultivée sur biofilm indiquée pour établir un portage nasopharyngé ou ne sont pas traitées. Quarante-huit heures plus tard, les souris sont soit simulées traitées avec PBS, soit reçoivent 200 PFU du virus de la grippe A PR8 par voie intranasale et 20 PFU par voie intratrachéale. Les souris sont surveillées au fil du temps pour les scores cliniques de la maladie et la survie. (C) 48 h après l’infection par le VIA, on évalue l’UFC bactérienne ou l’UFP virale dans les différents organes ou l’afflux de cellules immunitaires dans les poumons. Abréviations : UFC = unités formant colonies; PFU = unités formant des plaques; IAV = virus de la grippe A PR8; IT = intratrachéale; NP = nasopharyngé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : La double infection intranasale/intratrachéale par le VAI des souris inoculées par S. pneumoniae entraîne une propagation bactérienne et une maladie qui dépend de la souche bactérienne. De jeunes souris C57BL/6 (B6) mâles (âgées de 10 à 12 semaines) ont été infectées comme le montre la figure 1. Le nombre de bactéries dans (A) le nasopharynx, (B) les poumons et (C) le sang a été déterminé 48 heures après l’infection par le VAI. (B,C) Les pourcentages indiquent la fraction de souris qui ont présenté une propagation. (D) La survie a été surveillée pendant 10 jours après l’infection par le virus de l’IAV. Les données regroupées de (A, B) n = 5, (C) n = 11 et (D) n = 6 souris par groupe sont présentées. Chaque cercle correspond à une souris, et les lignes pointillées indiquent la limite de détection. (A-C)*, indique une différence significative (p < 0,05) entre les groupes indiqués, tels que déterminés par le test de Kruskal-Wallis. (D) *, indique une différence significative (p < 0,05) entre les souris +sp et Co-inf par souche bactérienne, déterminée par le test log-rank (Mantel-Cox). Abréviations : +sp = souris infectées par voie intranasale par des bactéries utilisant uniquement la souche indiquée; Co-inf = souris infectées par des bactéries infectées par le virus de l’IAV; IAV = souris ayant reçu le virus de la grippe A; UFC = unités formant colonies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Stratégie de contrôle des cellules immunitaires. Les poumons ont été récoltés et l’afflux de cellules immunitaires a été déterminé par cytométrie en flux. La stratégie de contrôle représentative des différents types de cellules est présentée. (A) CD45+, cellules individuelles vivantes ont été fermées et les pourcentages de (B) PMN (Ly6G +, CD11b +), macrophages (Ly6G-, Ly6C-, F480+) et monocytes (Ly6G-, Ly6C ⁺), (C) DCs (Ly6G-, CD11c+) et NK (NK1.1+, CD3-), (D) TCR^- γΔ et CD8 (CD8+, TCRβ+) et CD4 (CD4+, TCRβ⁺ ) ont été déterminées. Abréviations : SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; FSC-A = aire du pic de diffusion vers l’avant; FSC-H = hauteur du pic de diffusion vers l’avant; SSC-W = largeur latérale du pic de dispersion; L/D = vivant/mort; FMO = fluorescent moins un; NK = tueur naturel; PMN = leucocyte polymorphonucléaire; DC = cellule dendritique; TCR = récepteur des lymphocytes T. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les réponses immunitaires pulmonaires dépendent de la souche bactérienne. Les jeunes souris mâles C57BL/6 (âgées de 10 à 12 semaines) n’étaient pas infectées, inoculées seules avec la souche indiquée de Streptococcus pneumoniae (+sp), individuellement infectées par le IAV (IAV) ou co-infectées par S. pneumoniae et IAV (Co-inf). Quarante-huit heures après l’infection par le VAI (voir le plan expérimental à la figure 1), les poumons ont été prélevés et l’afflux de cellules immunitaires a été déterminé par cytométrie en flux suivant la stratégie de déclenchement de la figure 3. (A) Les pourcentages moyens de chaque type de cellule indiqué à l’intérieur de la grille CD45 sont affichés pour tous les groupes de traitement sur la carte thermique. (B) Des diagrammes de points représentatifs des types de cellules qui présentaient des différences significatives entre les traitements sont présentés pour chaque groupe de souris. (C) Les pourcentages des types de cellules immunitaires indiqués sont indiqués. Chaque cercle correspond à une souris. (A,C) Les données regroupées de n = 5 souris par groupe sont présentées. *, indique une différence significative (p < 0,05) entre Co-inf et non infecté; ^$, indique un écart significatif entre IAV et non infecté; #, indique une différence significative entre Co-inf et IAV seul. Les différences significatives entre les groupes de provocation pour chaque type de cellule ont été déterminées par ANOVA suivie du test de Tukey. Abréviations : NK = tueur naturel; PMN = leucocyte polymorphonucléaire; DC = cellule dendritique; TCR = récepteur des lymphocytes T; IAV = virus de la grippe A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Vieillissement et sensibilité accrue de l’hôte à la co-infection IAV/Streptococcus pneumoniae. Des souris mâles C57BL/6 jeunes (10-12 semaines) et âgées (21-22 mois) ont été co-infectées par S. pneumoniae TIGR4 i.n. et IAV i.n. et i.t. (comme dans la figure 1) ou individuellement confrontées à l’IAV seul. (A) Les titres viraux ont été déterminés 48 heures plus tard. Les astérisques indiquent une signification statistique (p < 0,05) telle que déterminée par le test t de Student. Les données sont regroupées à partir de n = 4 souris par groupe. (B) le score clinique et (C) la survie ont été surveillés au fil du temps. (B) La moyenne ± MEB combinée à partir de n = 6 souris par groupe est indiquée. Les astérisques indiquent une signification statistique (p < 0,05) entre les souris jeunes et les souris âgées au point temporel indiqué, tel que déterminé par le test de Mann-Whitney. (C) Les données sont regroupées à partir de n = 6 souris par groupe. Les astérisques indiquent une signification statistique (p < 0,05) entre les souris jeunes et les souris âgées, déterminée par le test de log-rank (Mantel-Cox). Abréviations : IAV = virus de la grippe A; i.n. = intranasale; i.t. = intratrachéale; SEM = erreur type de la moyenne. La figure 5A est reproduite avec la permission de Joma et ^coll.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Mix I stock pour CDM
Adénine	0,1 g
D-Alanine	0,25 g
CaCl2 Anhydre	0,025 g
Sulfate de manganèse	0,03 g
Cyanocobalamine	100 μL de 10 mg/mL de stock
Acide para-aminobenzoïque	400 μL de 5 mg/mL de stock
Pyridoxamine 2HCl	100 μL de 10 mg/mL de stock
Stock Mix II pour MDP
Guanine	0,05 g
Uracile	0,05 g
Stock Mix III pour MDP
Nitrate ferrique 9H2O	50 mg/mL
Sulfate ferrique 7H2O	10 mg/mL
Stock Mix IV pour MDP
Bêta-nicotinamide adénine dinucléotide	25 mg/mL

Tableau 1: Stocks des combinaisons I, II, III et IV pour le MDP. Abréviation : MDP = milieu chimiquement défini.

Mélange de vitamines pour MDP
Chlorhydrate de pyridoxal	0,8 g
Thiamine Cl2	0,4 g
Riboflavine	0,4 g
Ca-pantothénate	0,4 g
Biotine	0,04 g
Acide folique	0,4 g
Niacinamide	0,4 g

Tableau 2 : Mélange de vitamines pour le MDP. Abréviation : MDP = milieu chimiquement défini.

Stock d’acides aminés pour MDP
L-Alanine	0,480 g
L-Arginine	0,250 g
L-Asparagine	0,700 g
Acide L-aspartique	0,600 g
L-Cystéine	1.000 g
L-Cystine	0,100 g
Acide L-glutamique	0,200 g
L-Glutamine	0,780 g
L-Glycine	0,350 g
L-Histidine	0,300 g
L-Isoleucine	0,430 g
L-Leucine	0,950 g
L-Lysine	0,880 g
L-méthionine	0,250 g
L-phénylalanine	0,550 g
L-Proline	1,350 g
L-Sérine	0,680 g
L-Thréonine	0,450 g
L-tryptophane	0,100 g
L-Valine	0,650 g

Tableau 3 : Stock d’acides aminés pour le MDP. Abréviation : MDP = milieu chimiquement défini.

Stock de démarrage pour MDP
Dextrose	1,0 g
Sulfate de magnésium-7-hydrate	0,070 g
Phosphate de potassium dibasique	0,02 g
Phosphate de potassium monobasique	0,1 g
Acétate de sodium anhydre	0,45 g
Sodium Bicarbonate	0,25 g
Phosphate de sodium dibasique	0,735 g
Phosphate de sodium monobasique	0,32 g
Suppléments finaux pour MDP
Chlorure de choline	0,1 g
L-cystéine HCl	0,075 g
Sodium Bicarbonate	0,25 g

Tableau 4: Stock de démarrage et suppléments finals pour le MDP. Abréviation : MDP = milieu chimiquement défini.

Anticorps/fluorophore	Clone	Facteur de dilution
L/D pour l’excitation UV	N/A	0.38888889
Ly6G AF 488	1A8	0.25
CD11b APC	M1/70	0.25
CD11c PE	N418	0.18055556
Bloc Souris Fc	2.4G2	0.11111111
F4/80 PE Cy7	BM8	0.18055556
Ly6C BV605	AL-21	0.25
CD103 BV 421	M290	0.18055556
CD45 APC-eF-780	30-F11	0.18055556

Tableau 5 : Panel d’anticorps 1.

Anticorps/fluorophore	Clone	Facteur de dilution
L/D pour l’excitation UV	N/A	0.388888889
TCR-β APC Cy7	N° H57-597	0.180555556
CD4 V450 (Bleu Pacifique)	RM4-5	0.25
CD8 BV650	53-6.7	0.180555556
Bloc Souris Fc	2.4G2	0.111111111
CD45 PE	30-F11	0.180555556
CD3 AF488	145-2C11	0.180555556
TCR- γΔ APC	GL-3	0.180555556
NK1.1 AF 700	PK136	0.180555556

Tableau 6 : Panel d’anticorps 2.

Discussion

La plupart des études expérimentales existantes sur la co-infection à S. pneumoniae/IAV reposent sur l’administration de bactéries dans les poumons de souris pré-infectées par le virus de l’IAV. Ces modèles ont permis d’identifier les changements dans l’environnement pulmonaire et la réponse immunitaire systémique qui rendent l’hôte vulnérable à une infection bactérienne secondaire 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Cependant, ces modèles n’ont pas réussi à imiter la transition de S. pneumoniae d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène capable de causer des infections pulmonaires et systémiques graves. De plus, ces modèles ne conviennent pas à l’étude des facteurs de l’hôte et des interactions hôte-pathogène dans les voies respiratoires supérieures qui contribuent à la susceptibilité à l’infection. Un modèle antérieur pour le mouvement des pneumocoques du nasopharynx vers le poumon après une infection par le VAI reposait sur une infection bactérienne du nasopharynx suivie d’une infection virale. Cependant, il n’a pas réussi à reproduire les signes graves de maladie observés chez les patients humains²¹. Le modèle modifié d’infection murine décrit ici récapitule la transition de S. pneumoniae d’un portage asymptomatique à un agent pathogène qui cause une maladie clinique grave.

Une étape critique de ce modèle consiste à établir une infection à S. pneumoniae dans le nasopharynx. Streptococcus pneumoniae forme des biofilms et colonise le nasopharynx à différentes efficacités ^21,38. Pour établir une infection constante, au moins 5 × 10^{6 UFC} des souches bactériennes cultivées sur biofilm testées jusqu’à présent sont nécessaires²³. Il est recommandé que toute nouvelle souche bactérienne soit testée pour une infection stable du nasopharynx avant l’infection virale. Pour la co-infection virale, des études antérieures ont montré qu’une infection intranasale par IAV est nécessaire pour la dispersion de la bactérie du nasopharynx^21,22,23. Dans ces études antérieures, 500 UFP de l’IAV pour l’administration intranasale ont été utilisées, tandis que dans cette étude, 200 UFP étaient suffisantes pour augmenter le nombre de bactéries dans le nasopharynx. L’infection par le VAI ne se limite pas aux voies respiratoires supérieures et peut se propager aux poumons^39,40, ce qui est essentiel pour rendre l’environnement pulmonaire plus permissif pour les infections bactériennes^15,16,41. L’administration de l’IAV aux poumons peut être réalisée par administration intranasale ou par installation intratrachéale de souris anesthésiées. Des travaux antérieurs avec des souris BALB / cByJ ont révélé que l’administration intranasale entraîne une pneumonie virale²¹; cependant, l’accès de l’inoculum aux poumons après l’inoculation intranasale est plus restreint chez les souris C57BL/6. Chez les souris C57BL/6, une installation intratrachéale est nécessaire pour une administration régulière du virus²³. Dans ce modèle, la colonisation bactérienne préalable accélère la présentation des symptômes de la maladie après une infection virale²³. Comme l’infection virale peut elle-même causer des symptômes de la maladie avec une variation potentielle de la cinétique, il est recommandé de tester d’abord une gamme de doses pour toute nouvelle souche virale testée et de choisir une dose qui révèle une cinétique accélérée chez les hôtes co-infectés.

Les poumons fournissent une autre lecture critique pour l’évaluation de la maladie dans ce modèle. Pour l’évaluation de la charge pathogène et de l’afflux de cellules immunitaires, un poumon de la même souris peut être utilisé. Cependant, comme la gravité de l’infection et de l’inflammation peut différer d’un lobe à l’autre, il est recommandé de ne pas prendre différents lobes du même poumon pour les différentes évaluations. Au contraire, tous les lobes peuvent être hachés en petits morceaux, bien mélangés ensemble, puis analysés également pour les différentes évaluations. De même, le nasopharynx peut être utilisé pour le dénombrement de l’UFC bactérienne ou PFU virale et la réponse immunitaire. Cependant, le nombre de cellules obtenues à partir des lavages et des tissus est trop faible pour effectuer une cytométrie en flux sans regrouper les échantillons de souris du même groupe. Alternativement, l’inflammation dans le nasopharynx peut être évaluée histologiquement²³.

Une caractéristique essentielle de ce modèle est qu’il récapitule la maladie clinique observée chez les patients. Chez les humains, la pneumonie pneumococcique secondaire à la suite d’une infection par le VAI entraîne souvent des signes évidents de maladie, notamment de la toux, de la dyspnée, de la fièvre et des douleurs musculaires pouvant entraîner des hospitalisations, une insuffisance respiratoire et^{même la} mort8,15,42,43. Ce modèle récapitule les signes graves de maladie clinique observés chez l’homme en termes de difficulté à respirer (reflétée dans le score respiratoire) et de malaise global (reflété dans les scores de posture et de mouvement) affichés par les souris, ainsi que de décès chez certains des jeunes témoins en bonne santé. Les symptômes exacerbés de la maladie chez les souris co-infectées sont probablement le résultat à la fois de la dissémination bactérienne dans les poumons et de l’altération de la clairance virale chez les souris atteintes de portage pneumococcique²³. Une limite du modèle est que l’incidence de la maladie clinique et la dissémination bactérienne à partir du nasopharynx varient d’une souris à l’autre et sont influencées par la souche bactérienne, l’âge de l’hôte et le génotype^21,22,23. En conséquence, pour les souches invasives, la progression de l’infection localisée (sans bactériémie détectable) à la mort peut se produire dans les 24 heures. Par conséquent, pour une véritable évaluation de la propagation systémique, la bactériémie doit être suivie sur des intervalles plus courts (toutes les 6 à 12 heures). De même, le score de la maladie peut changer rapidement, en particulier dans les 72 premières heures suivant la co-infection. Par conséquent, pour suivre de près les symptômes de la maladie, il est conseillé de surveiller les souris trois fois par jour pendant les jours 1 à 3 après l’infection par le VAI.

En résumé, ce modèle reproduit le déplacement de S. pneumoniae d’un colonisateur asymptomatique du nasopharynx à un agent pathogène capable de causer une maladie pulmonaire et systémique lors de l’infection par le VAI. Dans ce modèle, l’IAV déclenche la transition de S. pneumoniae en modifiant le comportement bactérien dans le nasopharynx, en augmentant la propagation bactérienne au poumon et en modifiant l’immunité antibactérienne²³. De même, le portage bactérien atténue les réponses immunitaires antivirales et altère l’élimination de l’IAV des poumons²³. Cela rend ce modèle idéal pour analyser les changements dans les réponses immunitaires dans les infections simples par rapport aux infections polymicrobiennes. De plus, l’évolution de la maladie après une co-infection dépend, en partie, de la souche de pneumocoques présente dans le nasopharynx. Par conséquent, le modèle est adapté pour disséquer les facteurs bactériens nécessaires à la colonisation asymptomatique par rapport à la transition pathogène de S. pneumoniae. Enfin, ce modèle reproduit la susceptibilité du vieillissement aux co-infections et, bien que cela n’ait pas été testé ici, il peut être facilement utilisé pour évaluer l’impact des antécédents de l’hôte sur l’évolution de la maladie. En conclusion, la séparation du portage et de la maladie en étapes distinctes offre la possibilité d’analyser les variantes génétiques des agents pathogènes et de l’hôte, ce qui permet d’examiner en détail les interactions d’un pathobionte important avec l’hôte à différentes phases de la progression de la maladie. À l’avenir, ce modèle pourra être utilisé pour adapter les options de traitement aux hôtes vulnérables.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminobenzoic acid	Fisher	AAA1267318	Mix I stock
96-well round bottom plates	Greiner Bio-One	650101
100 µm Filters	Fisher	07-201-432
Adenine	Fisher	AC147440250	Mix I stock
Avicel	Fisher	501785325	Microcyrstalline cellulose
BD Cytofix Fixation Buffer	Fisher	BDB554655	Fixation Buffer
BD Fortessa			Flow cytometer
BD Intramedic Polyethylene Tubing	Fisher	427410	Tubing for nasal lavage
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)	Fisher	14-823-30
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure	Fisher	02-675-185	Blood collection tubes
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide	Fisher	AAJ6233703	Mix IV stock
Biotin	Fisher	AC230090010	Vitamin stock
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	#000644	Mice used in this study
Calcium Chloride Anhydrous	Fisher Chemical	C77-500	Mix I stock
CD103 BV 421	BD Bioscience	BDB562771	Clone: M290 DF 1:200
CD11b APC	Invitrogen	50-112-9622	Clone: M1/70, DF 1:300
CD11c PE	BD Bioscience	BDB565592	Clone: N418 DF 1:200
CD3 AF 488	BD Bioscience	OB153030	Clone: 145-2C11 DF 1:200
CD4 V450	BD Horizon	BDB560470	Clone: RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780	BD Bioscience	50-112-9642	Clone: 30-F11 DF 1:200
CD45 PE	Invitrogen	50-103-70	Clone: 30-F11 DF 1:200
CD8α BV 650	BD Horizon	BDB563234	Clone: 53-6.7 DF 1:200
Choline chloride	Fisher	AC110290500	Final supplement to CDM
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems	Fisher	09-761-107	Filter sterilzation apparatus
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks	Fisher	10-126-9
Corning Costar Clear Multiple Well Plates	Fisher	07-201-590
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate	Fisher	MT10017CM
Cyanocobalamin	Fisher	AC405925000	Mix I stock
D39	National Collection of Type Culture (NCTC)	NCTC 7466	Streptococcus pneumoniae strain
D-Alanine	Fisher	AAA1023114	Mix I stock
D-Calcium pantothenate	Fisher	AC243301000	Vitamin stock
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Starter stock
Dnase	Worthington Biochemical	LS002147
Eagles Minimum Essential Medium	ATCC	30-2003
EDTA	VWR	BDH4616-500G
EF3030	Center for Disease Control and Prevention	Available via the isolate bank request	Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name
F480 PE Cy7	BD Bioscience	50-112-9713	Clone: BMB DF 1:200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher	14-432-22	50 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher	14-959-11B	15 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)	Fisher	14-959-5	FACS tubes
FBS	Thermofisher	10437-028
Ferric Nitrate Nonahydrate	Fisher	I110-100	Mix III stock
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors	Fisher	08-951-5	Instruments used for harvest
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops	Fisher	22-363-602	Inoculating loops
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps	Fisher	13-812-38	Forceps for harvest
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL	Fisher	05-408-137	Micocentrifuge tubes
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL)	Fisher	14-955-459
Folic Acid	Fisher	AC216630500	Vitamin stock
Gibco RPMI 1640 (ATCC)	Fisher	A1049101
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher	14190250
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Fisher	14025134
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red	Fisher	11-935-046
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher	15-140-122
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher	15-250-061
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Fisher	25-200-056
Glycerol (Certified ACS)	Fisher	G33-4
Glycine	Fisher	AA3643530	Amino acid stock
Guanine	Fisher	AAA1202414	Mix II stock
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads	Fisher	50-112-9040
Iron (II) sulfate heptahydrate	Fisher	AAA1517836	Mix III stock
L-Alanine	Fisher	AAJ6027918	Amino acid stock
L-Arginine	Fisher	AAA1573814	Amino acid stock
L-Asparagine	Fisher	AAB2147322	Amino acid stock
L-Aspartic acid	Fisher	AAA1352022	Amino acid stock
L-Cysteine	Fisher	AAA1043518	Amino acid stock
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Fisher	AAA1038914	Final supplement to CDM
L-Cystine	Fisher	AAA1376218	Amino acid stock
L-Glutamic acid	Fisher	AC156211000	Amino acid stock
L-Glutamine	Fisher	O2956-100	Amino acid stock
L-Histidine	Fisher	AC166150250	Amino acid stock
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Invitrogen	50-112-1524	Clone: N/A DF 1:500
L-Isoleucine	Fisher	AC166170250	Amino acid stock
L-Leucine	Fisher	BP385-100	Amino acid stock
L-Lysine	Fisher	AAJ6222514	Amino acid stock
L-Methionine	Fisher	AAA1031822	Amino acid stock
Low endotoxin BSA	Sigma Aldrich	A1470-10G
L-Phenylalanine	Fisher	AAA1323814	Amino acid stock
L-Proline	Fisher	AAA1019922	Amino acid stock
L-Serine	Fisher	AC132660250	Amino acid stock
L-Threonine	Fisher	AC138930250	Amino acid stock
L-Tryptophan	Fisher	AAA1023014	Amino acid stock
L-Valine	Fisher	AAA1272014	Amino acid stock
Ly6C BV 605	BD Bioscience	BDB563011	Clone: AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488	Biolegend	NC1102120	Clone: IA8, DF 1:300
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CCL-34	MDCK cell line for PFU analuysis
Magnesium Sulfate 7-Hydrate	Fisher	60-019-68	CDM starter stock
Manganese Sulfate	Fisher	M113-500	Mix I stock
MilQ water			Ultra-pure water
Mouse Fc Block	BD Bioscience	BDB553142	Clone: 2.4G2 DF 1:100
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT	Fisher	NC1886507	Eye lubricant for infection
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line	ATCC	CRL-1848	H292 lung epithelial cell line for biofilm growth
Niacinamide	Fisher	18-604-792	Vitamin stock
NK 1.1 AF 700	BD Bioscience	50-112-4692	Clone: PK136 DF 1:200
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk	Fisher	50-200-5299	To remove oxygen from liquid cultures
Paraformaldehyde 4% in PBS	Thermoscientific	J19932-K2
Pivetal Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-8440	Isoflurane for anesthesia during infection
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Chemical	P288-500	Starter stock
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Chemical	P285-500	Starter stock
Pyridoxal hydrochloride	Fisher	AC352710250	Vitamin stock
Pyridoxamine dihydrochloride	Fisher	AAJ6267906	Mix I stock
Riboflavin	Fisher	AC132350250	Vitamin stock
Sodium Acetate	VWR	0530-500G	Starter stock
Sodium Azide	Fisher Bioreagents	BP922I-500	For FACS buffer
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500	Starter stock and final supplement to CDM
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Chemical	S374-500	Starter stock
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Chemical	S369-500	Starter stock
TCR APC	BD Bioscience	50-112-8889	Clone: GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7	BD Pharmigen	BDB560656	Clone: H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin	Fisher	R01227	Blood agar plates with the antibiotic gentamicin
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated	Fisher	PI20233
Thiamine hydrochloride	Fisher	AC148991000	Vitamin stock
TIGR4	ATCC	BAA-334	Streptococcus pneumoniae strain
Uracil	Fisher	AC157300250	Mix II stock
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g	Fisher	NC9693955