Préparation des réactifs <ol><li> Faire un tampon contenant du PBS avec BSA (0,5%), et 2 mM d&#39;EDTA. Parce que les bulles d&#39;air peuvent bloquer les colonnes de séparation MACS, le tampon doit être dégazée et stocké à 2-8 ° C avant utilisation. </li><li> Nous utilisons un milieu RPMI 1640 contenant du sérum de souris de 5%. Le milieu de culture ne doit pas contenir de BSA ou FCS, car ces composés va modifier la spécificité de la stimulation cellulaire. </li><li> L&#39;IL-17 Souris Assay sécrétion - enrichissement cellulaire et le kit de détection de Miltenyi-Biotec. Le kit contient les éléments suivants: l&#39;IL-17 Réactif Catch, l&#39;IL-17 anticorps de détection (biotine), l&#39;anti-biotine-PE, et les microbilles anti-PE. </li></ol> Stimuler les splénocytes <ol><li> Ce protocole est effectuée en présence d&#39;un contrôle positif et négatif, comme splénocytes non stimulées et une contre-coloration des cellules T. Ce protocole est réalisé en utilisant une technique stérile. </li><li> Préparer une suspension cellulaire unique de splénocytes de souris qui ont été isolés en utilisant les dissociateur gentleMACS ™. La concentration des cellules devraient être prédéterminés par le comptage des cellules. Pellet les cellules à 200 g pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Après la centrifugation, aspirer le surnageant hors du culot à l&#39;aide d&#39;une pipette. Ne pas transvaser le tube pour éviter la perte de la pastille. </li><li> Maintenant, remettre en suspension les cellules dans le milieu de culture et ensuite ajouter à un puits. Ajouter moyennes suffisante pour une concentration de dix millions de cellules par ml et cinq millions de cellules par cm carré. </li><li> Afin de stimuler une réponse immunitaire dans nos cellules en suspension, nous ajoutons ionomycine (1 pg / ml) et PMA (10 ng / mL) à l&#39;échantillon et mélanger la solution par un léger pipetage de haut en bas. Puis les puits sont étiquetés en conséquence. </li><li> Maintenant, nous allons incubation de nos cellules pour 3 heures à 37 ° C sans mélange de commencer la période de stimulation. Passez à l&#39;IL-17 à 3 heures de l&#39;analyse du début de la stimulation, afin de planifier en conséquence. </li><li> Pour arrêter la sécrétion, les cellules sont placées sur la glace et nous recueillons les cellules stimulées par un léger pipetage de haut en bas avec le tampon froid. Les cellules sont ensuite transférées à partir du puits d&#39;un tube et sont lavés une seconde fois. </li><li> Afin de s&#39;assurer que toutes les cellules sont recueillies, c&#39;est une bonne idée de vérifier votre plat sous un microscope. Si les cellules restent encore attachés, vous pouvez collecter les cellules restantes en rinçant la vaisselle avec du tampon froid. Tout amas de cellules dans votre suspension cellulaire peut être enlevé en utilisant les filtres de pré-séparation. </li></ol> Marquage des cellules avec le réactif Catch <ol><li> Il est primordial de noter que ce test fonctionne de manière optimale si moins de 2% de l&#39;IL-17-cellules sécrétrices sont présents. </li><li> Si la concentration de cellules sécrétant de l&#39;IL-17 devrait être supérieure à 2% des volumes d&#39;ajuster en conséquence. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="Figure 8" width="500" height="162" /></li><li> Un écueil potentiel de cette procédure est la contamination croisée des réactifs Catch, qui peuvent survenir lors de l&#39;étiquetage lorsque l&#39;anticorps bi-spécifique se lie à une cellule T non sécrétant et des pièges de l&#39;IL-17 sécrétée par un lymphocyte voisins, générant ainsi des faux positifs. </li><li> Afin de contourner ce problème, il est essentiel de cellules refroidir avant de l&#39;étiquetage et à travailler avec tampon froid pour ralentir la diffusion de l&#39;IL-17 et d&#39;éviter cette contamination croisée. En plus de maintenir les cellules froides, ils doivent être maintenus à une concentration définie. </li><li> Pour commencer la procédure de labellisation, nous utilisons dix millions de cellules dans un tube de 15 ml refermable. Si le nombre de cellules supérieur doivent être utilisés, il suffit de l&#39;échelle de tous les volumes en conséquence. Une fois la concentration cellulaire optimale a été obtenue, laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon froid. </li><li> Isoler les cellules à 300 g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée (2-8 ° C). </li><li> Après la centrifugation, aspirer le surnageant complètement en utilisant une pipette. Ne pas transvaser le surnageant que cela mènera à la perte de cellules et les volumes imprécis. Répéter l&#39;étape de lavage qui consiste à ajouter 10 ml de tampon froid, centrifugation, et l&#39;aspiration. </li><li> Maintenant que nous avons une pastille de pureté désirée, remettre en suspension les cellules dans 80 uL de milieu de culture froide. Pour eux, l&#39;étiquette, nous allons maintenant ajouter 20 ul de souris IL-17 Réactif Catch. </li><li> Incuber les cellules pendant 5 minutes sur la glace. </li><li> Après la période d&#39;incubation de 5 minutes sur la glace, enlever le tube et diluer les cellules dans 10 ml de 37 ° C mi-chaud. Fixez ensuite le tube sur le Tube Rotator MACSmix et incuber le tube à 37 ° C pendant 45 min sous un mouvement continu. Augmenter la température à 37 ° C redémarre sécrétion de cytokines. </li></ol> Marquage des cellules avec l&#39;anticorps de détection IL-17 (biotine) et anti-biotine-PE <ol><li> Après la période de sécrétion de 45 minutes à 37 ° C, placer le tube immédiatement sur la glace. Cela va arrêter la sécrétion de cytokines. A partir de là il est essentiel de garder les cellules sur la glace.Travailler avec le tampon froid va éviter la contamination croisée du réactif de capture. </li><li> Remplir le tube avec tampon froid et centrifuger à 300xg à 2-8 ° C pendant 10 min. Aspirer le surnageant complètement. Répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 ul de tampon froid et le tube est mis sur la glace. </li><li> Afin d&#39;éviter une liaison non spécifique de l&#39;anticorps, nous recommandons l&#39;ajout de réactif FcR 10 ul de blocage et incuber sur glace pendant 5 min. Puis nous ajoutons 20 ul de souris IL-17 anticorps de détection (biotine) qui est conjugué à la biotine et incuber pendant 10 minutes sur la glace. </li><li> Encore une fois, se laver les cellules que nous avons fait avant en ajoutant 10 ml de tampon froid et centrifuger à 300xg à 2-8 ° C pendant 10 min. </li><li> Maintenant aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 80 ul de tampon froid. </li><li> Ajouter 20 uL de nos anticorps secondaire, anti-biotine-PE. </li><li> Mélanger les cellules et une solution d&#39;anticorps secondaire, et à nouveau incuber le tube pendant 10 minutes sur la glace. </li><li> Une fois cette seconde incubation est terminée, laver les cellules avec 10 ml de tampon froid et centrifuger. </li><li> Le culot peut désormais être remis en suspension dans 500 ul de tampon froid. </li><li> Si les cellules doivent être séparées pour l&#39;analyse plus loin en aval, elles peuvent être marquées magnétiquement avec l&#39;Anti-PE-microbilles et séparés manuellement ou automatisées à l&#39;aide de colonnes MACS et séparateurs MACS. </li><li> Nous avons maintenant terminé l&#39;étiquetage des splénocytes et sont prêtes pour l&#39;analyse. </li></ol> Analyse par FACS <ol><li> Pour notre analyse, nous allons comparer les splénocytes stimulés et non stimulés par cytométrie en flux. </li><li> Avant l&#39;analyse par cytométrie en flux, les cellules sont colorées avec de l&#39;iodure de propidium à 0,5 pg / mL à la porte des cellules mortes. L&#39;analyseur de MACSQuant ™ a été chargé avec 200 000 cellules pour chaque échantillon et nous sommes maintenant allons regarder les diagrammes de dispersion de la réactivité des anticorps par rapport dans les échantillons. Deux considérations importantes pour l&#39;analyse de cellules rares - comme l&#39;IL-17 cellules positives - par cytométrie en flux sont: <ul><li> la fixation d&#39;un porte sur les lymphocytes dans la diffusion vers l&#39;avant par rapport nuage de côté </li><li> et gating sur les cellules mortes (colorées à l&#39;iodure de propidium) et des cellules B (qui peut causer des taches de fond non spécifique) pour améliorer encore la sensibilité de détection </li></ul></li><li> Nous avons utilisé CD4-APC anticorps pour détecter les cellules T et l&#39;anticorps pour détecter CD45R/B220-PerCP les cellules B. Nous voyons les propriétés de diffusion vers l&#39;avant et latérales des échantillons et d&#39;appliquer une grille sur la population de lymphocytes. </li><li> Une deuxième porte a été appliquée pour voir les cellules colorées et les cellules mortes B teinté (axe Y). Ces cellules sont exclus de l&#39;analyse des cellules T. </li><li> Dans cet exemple, qui est essentiellement de notre contrôle négatif, nous pouvons voir qu&#39;il ya très peu d&#39;IL-17 CD4 sécrétant positifs dans les échantillons de cellules T non stimulées - environ 0,003% (figure 4). En regardant la population des cellules T stimulées, on peut voir un nombre important de cellules CD4 positives des cellules T qui sécrètent l&#39;IL-17 - environ 0,367% (figure 5A) avant la séparation et 60,76% après la séparation magnétique avec la technologie MACS (figure 5B). </li></ol>

Tous les protocoles et fiches techniques sont disponibles à www.miltenyibiotec.com. Avertissements Les réactifs contiennent de l&#39;azide de sodium. Dans des conditions acides azide de sodium, produit l&#39;acide, ce qui est extrêmement toxique. Azides doivent être dilués avec de l&#39;eau courante avant de les jeter. Ces précautions sont recommandées pour éviter les dépôts dans les canalisations des conditions explosives peuvent se développer.

Cellules TH17 jouent un rôle essentiel dans l&#39;immunité adaptative et la réponse inflammatoire et sont un élément clé dans la conduite inflammation auto-immune. Ce document vidéo comment utiliser la souris Miltenyi de l&#39;IL-17 Assay sécrétion - enrichissement cellulaire et le kit de détection (PE). Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important d&#39;avoir une estimation de la fréquence de l&#39;IL-17-cellules sécrétant dans votre préparation de cellules de départ. La concentration cellulaire appropriée pendant la période de l&#39;étiquetage et la sécrétion de cytokine empêche la contamination croisée par d&#39;autres cellules de votre suspension et assure des résultats fiables.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-094-213</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx</a>
</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Medium</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-440</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>CD4-APC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-611</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>CD8a-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-605</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-093-233</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>FcR Blocking reagent, mouse </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-575</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MACSmix Tube Rotator</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-753</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>gentleMACS&#x2122; Dissociator</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-093-235</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>autoMACS Pro Starting Kit</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec </td>
<td>130-092-545</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACS Columns</td>
<td>Tool</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACS Separator</td>
<td>Tool</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

La cytokine MACS sécrétion de technologie de dosage permet la détection des cytokines sécrétées au niveau de la cellule unique et isolée sensible de viabilité des cellules sécrétant des cytokines. Afin de marquer l&#39;IL-17 cellules sécrétrices, une suspension cellulaire unique de splénocytes de souris est préparé et stimulé à 37 ° C avec PMA / ionomycine pour induire la sécrétion de cytokines. Pour arrêter la sécrétion des cellules sont ensuite placés sur la glace et sont exposées à l&#39;IL-17 Réactif Catch un anticorps bi-spécifique qui se lie à CD45 sur la surface des cellules de leucocytes et de l&#39;IL-17 comme il est sécrétée et pris près de la surface cellulaire. La sécrétion est alors relancée par l&#39;augmentation de la température à 37 ° C et de l&#39;IL-17 est piégé par le réactif de capture. La sécrétion est ensuite arrêté de nouveau, en plaçant les cellules sur la glace. Pour détecter l&#39;IL-17 pris au piège, les cellules sont incubées avec un IL-17-second anticorps spécifiques conjugué à la biotine et un anticorps anti-biotine-PE. Les cellules peuvent désormais être directement analysées par cytométrie en flux ou préparés pour l&#39;isolement et l&#39;enrichissement par étiquetage ultérieur avec anti-PE microbilles conjuguées.

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Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Cette procédure décrit la détection et l&#39;isolement des leucocytes TH17 souris qui sécrètent activement l&#39;IL-17 après stimulation.

Détection et isolement des cellules de souris viables T IL-17-sécrétrices

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

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ChineseVersion
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JapaneseVersion
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Research

JoVE Journal

Biology

11.1K vues.  Miltenyi Biotec,GmbH.  ChineseVersion JapaneseVersion 

Vidéo: Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolement des cellules T CD4 + des ganglions lymphatiques de souris en utilisant Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Recherche

Biologie

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

L&#39;isolement des cellules endothéliales valvulaires

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris Trachée

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.