Name: detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
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Preparazione dei reagenti <ol><li> Fai un buffer contenente PBS con BSA (0,5%), e 2 mM EDTA. Perché le bolle d&#39;aria in grado di bloccare colonne di separazione MACS, il buffer deve essere degassata e conservato a 2-8 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Noi usiamo RPMI 1640 medium contenente siero del mouse 5%. Il terreno di coltura non deve contenere BSA o FCS, in quanto questi composti alterano la specificità della stimolazione delle cellule. </li><li> L&#39;IL-17 mouse Assay secrezione - Arricchimento delle cellule e Detection Kit-da Miltenyi Biotec. Il kit contiene i seguenti componenti: l&#39;IL-17 reagente di cattura, la IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina), l&#39;anti-biotina-PE, e l&#39;Anti-PE microsfere. </li></ol> Stimolare il splenociti <ol><li> Questo protocollo è eseguita in presenza di un controllo negativo e positivo, come splenociti non stimolate e di contrasto per le cellule T. Questo protocollo è eseguita con tecnica sterile. </li><li> Preparare una sospensione singola cella di splenociti mouse che sono stati isolati utilizzando il dissociatore gentleMACS ™. La concentrazione di cellule devono essere predeterminati attraverso il conteggio delle cellule. Agglomerare le cellule a 200 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante fuori il pellet con una pipetta. Non decantare il tubo per evitare la perdita del pellet. </li><li> Ora, risospendere le cellule nel mezzo di coltura e quindi aggiungere ad un pozzo. Aggiungere mezzo sufficiente per una concentrazione di dieci milioni di cellule per mL e cinque milioni di cellule per centimetro quadrato. </li><li> Per stimolare una risposta immunitaria nelle nostre cellule risospese, aggiungiamo ionomicina (1 mg / mL) e PMA (10 ng / ml) al campione e mescolare la soluzione pipettando gentilmente su e giù. Poi i pozzi sono debitamente etichettati. </li><li> Ora, noi incubare le nostre cellule per 3 ore a 37 ° C senza miscelazione per iniziare il periodo di stimolazione. Procedere alla IL-17 analisi 3 ore dalla comparsa dei stimolazione, in modo da pianificare di conseguenza. </li><li> Per interrompere la secrezione, le cellule sono immessi sul ghiaccio e raccogliamo le cellule stimolate pipettando gentilmente su e giù con il tampone a freddo. Le cellule sono poi trasferiti dal bene a un tubo e vengono lavati una seconda volta. </li><li> Per garantire che tutte le cellule vengono raccolte, è una buona idea controllare il vostro piatto al microscopio. Se le cellule sono ancora attaccato, è possibile raccogliere le cellule rimanenti risciacquando il piatto con il tampone a freddo. Eventuali grumi di cellule in sospensione cellulare può essere rimosso utilizzando il pre-separazione filtri. </li></ol> Etichettare le cellule con reagente Cattura <ol><li> E &#39;fondamentale notare che questo test funziona in modo ottimale se meno del 2% di IL-17-secernenti cellule sono presenti. </li><li> Se la concentrazione di IL-17 le cellule secernenti dovrebbe essere superiore al 2% regolare i volumi di conseguenza. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="figura 8" width="500" height="162" /></li><li> Un potenziale problema di questa procedura è la contaminazione incrociata dei reagenti Catch, che può verificarsi durante l&#39;etichettatura quando il bi-specifico anticorpo si lega ad un non-secernenti delle cellule T e le trappole IL-17 secreta da un linfocita vicini, generando falsi positivi. </li><li> Per aggirare questo problema, è fondamentale per le cellule raffreddare prima dell&#39;etichettatura e lavorare con tampone a freddo per rallentare la diffusione di IL-17 e di evitare la contaminazione incrociata. Oltre a mantenere le celle frigorifere, devono essere mantenuti ad una concentrazione definita. </li><li> Per iniziare la procedura di etichettatura, si usa 10.000.000 cellule in una provetta da 15 ml richiudibili. Se il numero di cellule superiore devono essere utilizzati, semplicemente scala di tutti i volumi di conseguenza. Una volta che la concentrazione cellulare ottimale è stata ottenuta, lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 10 ml di tampone a freddo. </li><li> Spin giù le cellule a 300 × g per 10 minuti in una centrifuga refrigerata (2-8 ° C). </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante completamente con una pipetta. Non decantare il sopranatante come questo porterà alla perdita di cellule e volumi impreciso. Ripetere la fase di lavaggio, che consiste di aggiungere 10 ml di tampone a freddo, centrifugazione, e aspirazione. </li><li> Ora che abbiamo un pellet di purezza desiderato, risospendere le cellule in 80 ml di terreno di coltura a freddo. Etichettarli, noi ora aggiungere 20 ml di mouse IL-17 reagente Catch. </li><li> Incubare le cellule per 5 minuti in ghiaccio. </li><li> Dopo il periodo di incubazione di 5 minuti sul ghiaccio, rimuovere il tubo e diluire le cellule in 10 ml di 37 ° C di media caldi. Poi fissare il tubo sul Tubo Rotator MACSmix e incubare il tubo a 37 ° C per 45 minuti sotto continuo movimento. L&#39;aumento della temperatura a 37 ° C ripartirà secrezione di citochine. </li></ol> Etichettare le cellule con IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina) e anti-biotina-PE <ol><li> Dopo il periodo di secrezione 45 minuti a 37 ° C, mettere il tubo immediatamente in ghiaccio. Questo fermerà la secrezione di citochine. Da qui in poi è fondamentale per mantenere le cellule in ghiaccio.Lavorare con tampone freddo evitare la contaminazione crociata dei reagenti Catch. </li><li> Riempire il tubo con tampone a freddo e centrifugare a 300xg a 2-8 ° C per 10 min. Aspirare il surnatante completamente. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> Il pellet cellulare è risospeso in 80 ml di tampone a freddo e il tubo è posto su ghiaccio. </li><li> Per evitare il legame non specifico degli anticorpi, si consiglia l&#39;aggiunta di reagente FCR 10μl di blocco e incubare in ghiaccio per 5 min. Poi si aggiungono 20 l di mouse IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina) che è coniugato con biotina e incubare per 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Ancora una volta, lavare le cellule come abbiamo fatto prima con l&#39;aggiunta di 10 mL di tampone a freddo e centrifugare a 300xg a 2-8 ° C per 10 min. </li><li> Ora aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 80 ml di tampone a freddo. </li><li> Aggiungere 20 ml di nostro anticorpo secondario, anti-biotina-PE. </li><li> Mescolare le cellule e la soluzione di anticorpo secondario, incubare e di nuovo il tubo per 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Una volta che questa seconda incubazione è completa, lavare le cellule con 10 mL di tampone fredda e centrifuga. </li><li> Il pellet può essere risospeso in 500 ml di tampone a freddo. </li><li> Se le cellule devono essere separati per ulteriori analisi a valle, possono essere magneticamente etichettati con Anti-PE-microsfere e separati manualmente o automatizzati con colonne MACS e separatori MACS. </li><li> Ora abbiamo completato l&#39;etichettatura del splenociti e sono pronti per l&#39;analisi. </li></ol> FACS analisi <ol><li> Per la nostra analisi, metteremo a confronto i splenociti stimolati e non stimolate mediante citometria a flusso. </li><li> Prima di citometria a flusso, le cellule sono colorate con ioduro di propidio a 0,5 mg / ml per escludere le cellule morte. L&#39;analizzatore MACSQuant ™ è stato caricato con 200.000 cellule per ogni campione e che ora stanno andando a guardare le trame dispersione di reattività anticorpale relativa nei campioni. Due considerazioni importanti per l&#39;analisi di cellule rare - come IL-17 cellule positive - mediante citometria di flusso sono: <ul><li> impostazione di un cancello sulla linfociti nel scatter in avanti rispetto a scatter plot lato </li><li> gating e fuori le cellule morte (colorate con ioduro di propidio) e B-cellule (che possono provocare colorazione aspecifica di fondo) per migliorare ulteriormente la sensibilità di rilevazione </li></ul></li><li> Abbiamo usato CD4-APC anticorpi per rilevare le cellule T e l&#39;anticorpo CD45R/B220-PerCP per rilevare le cellule B. Vediamo le proprietà scatter in avanti e laterale dei campioni e applicare un gate sulla popolazione linfocitaria. </li><li> Una seconda porta è stata applicata per vedere le cellule colorate le cellule morte e B colorate (asse Y). Queste cellule sono esclusi dall&#39;analisi delle cellule T. </li><li> In questo esempio, che è essenzialmente negativo del nostro controllo, possiamo vedere che ci sono pochissimi IL-17 CD4 cellule che secernono positivo T nei campioni non stimolata - circa il 0,003% (Figura 4). Guardando alla popolazione di cellule T stimolate, possiamo vedere un numero consistente di cellule T CD4 positive che secernono IL-17 - circa 0,367% (Figura 5A) prima della separazione e 60,76% dopo la separazione magnetica con MACS Technology (Figura 5B). </li></ol>

Tutti i protocolli e le schede tecniche sono disponibili presso www.miltenyibiotec.com. Avvertenze I reagenti contengono sodio azide. In condizioni di acidità sodio azide produce acido idrazoico, che è estremamente tossico. I composti devono essere diluiti con acqua corrente prima di smaltimento. Queste precauzioni sono raccomandate per evitare depositi nelle tubazioni che esplosivo può sviluppare.

Cellule TH17 giocano un ruolo fondamentale nel immunità adattativa e la risposta infiammatoria e sono una componente chiave nel guidare l&#39;infiammazione autoimmune. Questo video documenta come utilizzare il mouse Miltenyi di IL-17 Assay secrezione - Arricchimento cellulare e kit di rilevamento (PE). Nel fare questa procedura è importante avere una stima della frequenza di IL-17-cellule che secernono nella vostra preparazione delle cellule di partenza. La concentrazione cella appropriata durante l&#39;etichettatura e la secrezione di citochine periodo impedisce la contaminazione incrociata da altre cellule in sospensione e assicura risultati affidabili.

<table><tbody><tr><td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent, mouse </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Starting Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Columns</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

La secrezione delle citochine MACS tecnologia di analisi permette di individuare i citochine secrete a livello di singola cellula e l&#39;isolamento sensibile di valide cellule che secernono citochine. Al fine di etichetta IL-17-cellule che secernono, una sospensione singola cella di splenociti mouse è preparato e stimolato a 37 ° C con PMA / ionomicina per indurre la secrezione di citochine. Per arrestare la secrezione delle cellule vengono poi immessi sul ghiaccio e sono esposti al IL-17 reagente Catch a bi-anticorpo specifico che si lega al CD45 sulla superficie cellulare dei leucociti e di IL-17 come è secreta e catturato vicino alla superficie della cellula. Secrezione è poi ri-iniziata aumentando la temperatura a 37 ° C e IL-17 è intrappolato dal reagente Catch. Secrezione è poi fermato di nuovo, mettendo cellule su ghiaccio. Per rilevare l&#39;IL-17 intrappolati, le cellule vengono incubate con un secondo IL-17-anticorpo specifico coniugato con biotina e un anti-biotina-PE anticorpi. Le cellule possono ora essere analizzati direttamente mediante citometria di flusso o preparati per l&#39;isolamento e l&#39;arricchimento per l&#39;etichettatura successive con Anti-PE microsfere coniugate.

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Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Questa procedura descrive l&#39;individuazione e isolamento di mouse leucociti TH17 che attivamente secernono IL-17 sulla stimolazione.

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

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Research

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Biology

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Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Decifrare l'impegno precoce delle cellule T helper follicolari nell'infezione acuta da LCMV

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

Autore in primo piano: Chiarire i percorsi di differenziazione delle cellule TFH nelle sfide acute di LCMV

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

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Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l'isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4⁺ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4⁺ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4⁺ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

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Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

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Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

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Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

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