Name: detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
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Preparar os Reagentes <ol><li> Faça um buffer contendo PBS com BSA (0,5%), e 2 mM EDTA. Porque as bolhas de ar podem bloquear colunas de separação MACS, o buffer deve ser desgaseificado e armazenado a 2-8 ° C antes do uso. </li><li> Usamos meio RPMI 1640 contendo soro do mouse 5%. O meio de cultura não deve conter BSA ou FCS, uma vez que estes compostos irão alterar a especificidade de estimulação celular. </li><li> A IL-17 Rato Ensaio Secreção - Enriquecimento Celular e Kit de Detecção da Miltenyi Biotec-. O kit contém os seguintes componentes: a IL-17 Reagente Catch, a IL-17 anticorpo de detecção (Biotina), o Anti-Biotina-PE, e as microesferas de Anti-PE. </li></ol> Estimulando a esplenócitos <ol><li> Este protocolo é realizado na presença de um controle negativo e positivo, como esplenócitos unstimulated e um contracoloração para células T. Este protocolo é realizado utilizando técnica estéril. </li><li> Preparar uma suspensão única célula de esplenócitos de camundongo que foram isolados usando o gentleMACS Dissociator ™. A concentração de células deve ser determinada através de contagem das células. Agregar as células em 200 × g por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após centrifugação, aspirar o sobrenadante fora do pellet utilizando uma pipeta. Não decantar o tubo para evitar a perda de sedimento. </li><li> Agora, voltar a suspender as células em meio de cultura e, em seguida, adicionar a um poço. Adicionar média suficiente para uma concentração de 10 milhões de células por mL e cinco milhões de células por centímetro quadrado. </li><li> Para estimular uma resposta imune em nossas células ressuspenso, acrescentamos ionomicina (1 mg / mL) e PMA (10 ng / mL) para a amostra e misture delicadamente a solução pipetando para cima e para baixo. Em seguida, os poços são rotulados em conformidade. </li><li> Agora, vamos incubar nossas células durante 3 horas a 37 ° C sem mistura para iniciar o período de estimulação. Proceder à análise de IL-17 três horas desde o início da estimulação, de modo plano nesse sentido. </li><li> Para interromper a secreção, as células são colocadas em gelo e coletamos as células estimuladas por delicadamente pipetando para cima e para baixo com tampão de frio. Células são então transferidos do bem a um tubo e são lavados uma segunda vez. </li><li> Para garantir que todas as células são coletadas, é uma boa idéia para verificar o seu prato sob um microscópio. Se as células ainda permanecem conectados, você pode coletar as células restantes lavando o prato com tampão de frio. Qualquer aglomerados de células na sua suspensão de células pode ser removido usando os filtros de pré-separação. </li></ol> Rotulagem as células com reagente Trave <ol><li> É fundamental notar, que este teste funciona perfeitamente se inferior a 2% de IL-17 são células secretoras de presente. </li><li> Se a concentração de IL-17 células secretoras deverá ser superior a 2% ajustar volumes em conformidade. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="figura 8" width="500" height="162" /></li><li> Uma armadilha potencial deste procedimento é a contaminação cruzada do Reagente Catch, que pode ocorrer durante a rotulagem quando o anticorpo bi-específico liga-se a uma célula T não secretores e armadilhas IL-17 secretada a partir de um linfócito vizinhos, gerando falsos positivos. </li><li> A fim de contornar este problema, é fundamental para as células esfriar antes de rotulagem e trabalhar com buffer de frio para lenta difusão de IL-17 e evitar essa contaminação cruzada. Além de manter as células frio, eles devem ser mantidos a uma concentração definida. </li><li> Para iniciar o procedimento de rotulagem, usamos 10 milhões de células em um tubo de 15 ml que pode ser fechado. Se os números mais altos de células têm de ser utilizados, simplesmente escala de todos os volumes em conformidade. Uma vez que a concentração celular ideal foi obtida, lave as células, adicionando 10 ml de tampão frio. </li><li> Girar as células em 300 × g por 10 minutos em centrífuga refrigerada (2-8 ° C). </li><li> Após centrifugação, aspirar o sobrenadante completamente usando uma pipeta. Não decantar o sobrenadante, pois isso levará a perda de células e volumes imprecisa. Repita o passo de lavagem, que consiste na adição de 10ml de solução de frio, a centrifugação, e aspiração. </li><li> Agora que temos uma pelota de pureza desejado, ressuspender as células em 80 mL de meio de cultura frio. Para classificá-los, vamos agora adicionar 20 mL de Reagente rato Pegue IL-17. </li><li> Incubar as células por 5 minutos no gelo. </li><li> Após o período de incubação 5 minutos no gelo, retire o tubo e diluir as células em 10 ml de 37 C ° média morna. Em seguida, prenda o tubo na Rotator Tubo MACSmix e incubar os tubos a 37 ° C por 45 min em movimento contínuo. Aumentando a temperatura para 37 ° C vai re-iniciar a secreção de citocinas. </li></ol> Rotulagem as células com IL-17 anticorpo de detecção (Biotina) e Anti-Biotina-PE <ol><li> Após o período de secreção de 45 minutos a 37 ° C, colocar o tubo imediatamente em gelo. Isto irá parar a secreção de citocinas. A partir daqui é fundamental para manter as células no gelo.Trabalhando com tampão frio vai evitar a contaminação cruzada do Reagente Catch. </li><li> Encha o tubo com tampão de frio e centrifugar a 300xg a 2-8 ° C por 10 min. Aspirar o sobrenadante completamente. Repita o passo lavar mais uma vez. </li><li> O pellet celular é ressuspenso em 80 mL de tampão frio eo tubo é colocado sobre o gelo. </li><li> Para evitar a ligação inespecífica do anticorpo, recomendamos a adição de 10μl Reagente FcR Bloqueio e incubar no gelo por 5 min. Então adicionar 20 mL de anticorpo de detecção do rato IL-17 (Biotina), que é conjugado a biotina e incubar por 10 minutos no gelo. </li><li> Mais uma vez, lave as células como fizemos antes, adicionando 10 mL de tampão frio e centrifugar a 300xg a 2-8 ° C por 10 min. </li><li> Agora aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 80 mL de tampão frio. </li><li> Adicionar 20 mL de nosso anticorpo secundário, Anti-Biotina-PE. </li><li> Misture as células e solução de anticorpo secundário, e novamente incubar os tubos durante 10 minutos no gelo. </li><li> Uma vez que esta segunda incubação é completa, lavar as células com 10 mL de tampão fria e centrifugação. </li><li> O pellet pode agora ser ressuspendida em 500 mL de tampão frio. </li><li> Se as células têm que ser separados para análise a jusante, podem ser rotulados com magneticamente Anti-PE-micro e separada manualmente ou automatizado usando MACS Colunas e Separadores de MACS. </li><li> Completamos agora a rotulagem dos esplenócitos e estão prontos para análise. </li></ol> Análise FACS <ol><li> Para nossa análise, vamos comparar os esplenócitos estimulados e desestimulados por citometria de fluxo. </li><li> Antes da análise de citometria de fluxo, as células são coradas com iodeto de propídio a 0,5 mcg / mL para deixar de fora as células mortas. O Analyzer ™ MACSQuant estava carregado com 200.000 células para cada amostra e agora estamos indo olhar os gráficos de dispersão de reatividade de anticorpos relativa nas amostras. Duas considerações importantes para a análise de células raras - como a IL-17 células positivas - por citometria de fluxo são: <ul><li> definição de um portão em linfócitos na dispersão frontal versus gráfico de dispersão lado </li><li> gating e as células mortas (coradas com iodeto de propídio) e células-B (que pode causar coloração de fundo inespecífica) para aumentar ainda mais a sensibilidade de detecção </li></ul></li><li> Usamos CD4-APC anticorpos para detectar células T e os anticorpos CD45R/B220-PerCP de detectar as células B. Nós vemos as propriedades de dispersão para frente e laterais das amostras e aplicar um portão sobre a população de linfócitos. </li><li> Um segundo portão foi aplicada a ver as células mortas e as células manchadas manchado B (eixo Y). Estas células são excluídos da análise de células T. </li><li> Neste exemplo, que é essencialmente nosso controle negativo, podemos ver que há muito poucos IL-17 CD4 T secretoras de células positivas em amostras não estimuladas - cerca de 0,003% (Figura 4). Olhando para a população de células T estimuladas, podemos ver um grande número de células CD4 positivas T que secretam IL-17 - cerca de 0,367% (Figura 5A) antes da separação e 60,76% após a separação magnética com MACS Tecnologia (Figura 5B). </li></ol>

Todos os protocolos e fichas de dados estão disponíveis em www.miltenyibiotec.com. Advertências Os reagentes contêm azida de sódio. Sob condições ácidas azida de sódio produz ácido hidrazóico, que é extremamente tóxico. Os compostos de azida deve ser diluído com água corrente antes de descartar. Estas precauções são recomendadas para evitar depósitos nas canalizações onde se podem desenvolver condições explosivas.

Células TH17 desempenhar um papel integral na imunidade adaptativa e da resposta inflamatória e são um componente fundamental na condução inflamação auto-imune. Este vídeo documenta como usar mouse Miltenyi de IL-17 Assay Secreção - Enriquecimento Celular e Kit de Detecção (PE). Ao fazer este procedimento é importante ter uma estimativa da freqüência de IL-17 em células secretoras de sua preparação célula inicial. A concentração de célula apropriada durante o período de rotulagem e secreção de citoquinas evita a contaminação cruzada por outras células em sua suspensão e garante resultados confiáveis.

<table><tbody><tr><td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent, mouse </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Starting Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Columns</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

O MACS citocinas tecnologia Assay Secreção permite a detecção de citocinas secretadas no nível única célula e isolamento sensível viável células secretoras de citocinas. Para rotular IL-17 células secretoras de uma suspensão única célula de esplenócitos mouse está preparado e estimulado a 37 ° C com PMA / ionomicina para induzir a secreção de citocinas. Para parar células secreção são então colocados em gelo e são expostos à IL-17 Reagente Catch a anticorpos bi-específicos que se liga ao CD45 na superfície celular dos leucócitos e IL-17, uma vez que é secretada e pegou perto da superfície da célula. Secreção é então re-iniciados, aumentando a temperatura para 37 ° C e IL-17 é preso pelo reagente Catch. Secreção é, então, parou de novo, colocando as células no gelo. Para detectar a IL-17 presos, as células são incubadas com IL-17 específicos segundo anticorpo conjugado a biotina e um anticorpo anti-biotina-PE. Células podem agora ser analisadas diretamente por citometria de fluxo ou preparados para isolamento e enriquecimento através da rotulagem posterior com Anti-PE microesferas conjugados.

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Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Este procedimento descreve a detecção e isolamento de leucócitos do mouse TH17 que ativamente secretam IL-17 com a estimulação.

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

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Research

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Biology

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Vídeo: Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Imunologia e Infecção

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Decifrando o comprometimento precoce de células T auxiliares foliculares na infecção aguda por LCMV

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

Autor em destaque: Elucidando as vias de diferenciação de células TFH em desafios agudos de LCMV

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

Detecção e isolamento de células viáveis rato IL-17 Secretoras de T

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Capítulos neste vídeo

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

Acesso à diferenciação precoce de células T ^CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Acesso à diferenciação precoce de células T ^CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Acesso à diferenciação precoce de células T ^CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

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Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Detecção e isolamento de células viáveis rato IL-17 Secretoras de T

Acesso à diferenciação precoce de células T ^CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Acesso à diferenciação precoce de células T ^CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Acesso à diferenciação precoce de células T ^CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo