Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Machen Sie einen Puffer mit PBS mit BSA (0,5%) und 2 mM EDTA. Da Luftblasen MACS Trennsäulen Block kann, muss der Puffer entgast und bei 2-8 ° C vor Gebrauch gespeichert werden. </li><li> Wir verwenden RPMI 1640 Medium mit 5% Maus-Serum. Das Kulturmedium sollte nicht enthalten BSA oder FCS, da diese Verbindungen wird die Besonderheit des Zell-Stimulation verändern. </li><li> Die Maus IL-17 Sekretion Assay - Cell Enrichment and Detection Kit von Miltenyi-Biotec. Das Kit enthält folgende Komponenten: der IL-17 Catch-Reagenz, das IL-17 Detection Antibody (Biotin), die Anti-Biotin-PE, und die Anti-PE MicroBeads. </li></ol> Förderung der Milzzellen <ol><li> Dieses Protokoll ist in der Gegenwart eine negative und positive Kontrolle, wie unstimulierten Splenozyten und eine Gegenfärbung für T-Zellen durchgeführt. Dieses Protokoll wird mit einer sterilen Technik durchgeführt. </li><li> Bereiten Sie eine einzelne Zelle Aussetzung der Maus-Splenozyten, dass isolierte Verwendung des gentleMACS ™ Dissociator wurden. Die Konzentration der Zellen sollte über Zellzählung vorgegeben werden. Pellet die Zellen bei 200 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen der Überstand der Pellet mit einer Pipette. Nicht dekantieren das Rohr, um den Verlust des Pellets zu vermeiden. </li><li> Nun, die Zellen in das Kulturmedium und fügen Sie dann zu einem Brunnen. Fügen Sie ausreichend Medium für eine Konzentration von 10 Millionen Zellen pro ml und fünf Millionen Zellen pro Quadratzentimeter. </li><li> Zur Stimulierung einer Immunantwort in unserer resuspendierten Zellen, fügen wir Ionomycin (1 pg / ml) und PMA (10 ng / mL) zur Probe und mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Dann wird der Brunnen sind entsprechend gekennzeichnet. </li><li> Jetzt werden wir unsere Zellen für 3 Stunden bei 37 ° C ohne Mischen auf die Stimulation Periode beginnen. Fahren Sie mit IL-17-Analyse 3 Stunden ab Einsetzen der Stimulation, so entsprechend planen. </li><li> So stoppen Sie die Sekretion werden die Zellen auf Eis gelegt, und wir sammeln die stimulierten Zellen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit kaltem Puffer. Die Zellen werden dann aus dem Brunnen zu einem Röhrchen überführt und gewaschen werden, ein zweites Mal. </li><li> Um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt sind, ist es eine gute Idee, Ihr Gericht unter einem Mikroskop zu überprüfen. Wenn Zellen immer noch verbunden bleiben, können Sie die restlichen Zellen durch Spülen der Teller mit kaltem Puffer zu sammeln. Jede Zellklumpen in ihrer Zellsuspension kann mit Hilfe der Pre-Trennfilter werden. </li></ol> Labeling der Zellen mit Catch Reagent <ol><li> Es ist äußerst wichtig zu beachten, dass dieser Test optimal funktioniert, wenn weniger als 2% der IL-17-sezernierenden Zellen vorhanden sind. </li><li> Wenn die Konzentration von IL-17 sezernierenden Zellen wird erwartet, dass mehr als 2% einstellen Volumina entsprechend. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="Abbildung 8" width="500" height="162" /></li><li> Eine mögliche Fehlerquelle dieses Verfahrens ist eine Kreuzkontamination von der Catch Reagent, die beim Etikettieren auftreten können, wenn die bi-spezifische Antikörper bindet an ein nicht-sezernierenden T-Zellen und Fallen IL-17 aus einem benachbarten Lymphozyten sezerniert wird, um dadurch Fehlalarme. </li><li> Um dieses Problem zu umgehen, ist es wichtig, kühlen Zellen nach unten vor der Markierung und die Arbeit mit kaltem Puffer zur Verbreitung von IL-17 langsam und vermeiden Kreuzkontamination. Zusätzlich zu halten die Zellen kalt, müssen sie bei einer definierten Konzentration gehalten werden. </li><li> Zu Beginn der Kennzeichnung Verfahren verwenden wir 10 Millionen Zellen in einer 15 ml Tube verschließbar. Werden höhere Zellzahlen verwendet werden müssen, einfach skalieren alle Volumes entsprechend. Sobald die optimale Zellkonzentration erhalten worden ist, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml kaltem Puffer. </li><li> Spin down die Zellen bei 300 × g für 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge (2-8 ° C). </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen Überstand vollständig mit einer Pipette. Nicht Dekantieren des Überstandes, da dies zu Zellverlust und ungenau Volumina führen wird. Wiederholen Sie den Waschvorgang, die der Zugabe von 10 ml kaltem Puffer, Zentrifugation und Aspiration besteht. </li><li> Jetzt, da wir ein Pellet der gewünschten Reinheit haben, die Zellen in 80 ul der kalten Kulturmedium. Um beschriften, werden wir nun mit 20 ul der Maus IL-17 Catch-Reagenz. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 5 Minuten auf dem Eis. </li><li> Nach der 5 Minuten Inkubationszeit auf Eis, entfernen Sie den Schlauch und verdünnen die Zellen in 10 ml 37 ° C warmen Medium. Dann sichern Sie den Schlauch auf den MACSmix Tube Rotator und inkubieren das Rohr bei 37 ° C für 45 min unter ständiger Bewegung. Eine Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C wird neu gestartet Zytokinsekretion. </li></ol> Labeling der Zellen mit IL-17 Detection Antibody (Biotin) und Anti-Biotin-PE <ol><li> Nach dem 45 Minuten-Sekretion Zeitraum bei 37 ° C wird das Reagenzglas sofort auf Eis. Dieser stoppt Zytokinsekretion. Von hier aus ist es wichtig, die Zellen auf Eis zu halten.Arbeiten mit kaltem Puffer wird verhindert Kreuzkontaminationen des Catch Reagent. </li><li> Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem Puffer und Zentrifuge bei 300xg bei 2-8 ° C für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. </li><li> Das Zellpellet wird in 80 ul kaltem Puffer resuspendiert und die Röhre wird auf Eis gelegt. </li><li> Um zu vermeiden, unspezifische Bindung des Antikörpers, empfehlen wir die Zugabe von 10 &amp;mgr; l FcR Blockierungsreagenz und auf Eis inkubieren für 5 min. Dann fügen wir 20 uL Maus IL-17 Detection Antibody (Biotin), die konjugierte Biotin und für 10 Minuten auf Eis inkubieren ist. </li><li> Wieder einmal waschen Sie die Zellen wie wir schon früher durch Zugabe von 10 ml kaltem Puffer und Zentrifuge bei 300xg bei 2-8 ° C für 10 min durchgeführt. </li><li> Jetzt saugen Sie den Überstand und Zellpellet in 80 ul kaltem Puffer. </li><li> Add 20 uL unserer sekundären Antikörper, Anti-Biotin-PE. </li><li> Mischen Sie die Zellen und sekundären Antikörper-Lösung, und wieder inkubieren Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis. </li><li> Nach dieser zweiten Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen mit 10 ml kaltem Puffer und Zentrifuge. </li><li> Das Pellet kann nun in 500 ul kaltem Puffer resuspendiert werden. </li><li> Wenn die Zellen für weitere Downstream-Analyse getrennt werden müssen, können sie magnetisch mit Anti-PE-MicroBeads beschriftet werden und manuell oder automatisiert mittels MACS-Säulen und MACS-Separatoren getrennt. </li><li> Wir haben nun die Beschriftung der Splenozyten abgeschlossen und sind für die Analyse bereit. </li></ol> FACS-Analyse <ol><li> Für unsere Analyse werden wir die stimulierten und unstimulierten Splenozyten mittels Durchflusszytometrie zu vergleichen. </li><li> Vor durchflusszytometrischen Analyse werden die Zellen mit Propidiumiodid bei 0,5 pg / mL zu Tor aus toten Zellen gefärbt. Die MACSQuant ™ Analyzer wurde mit 200.000 Zellen pro Probe geladen und wir werden in Zukunft an die Streudiagramme der relativen Antikörperreaktivität in den Proben zu suchen. Zwei wichtige Aspekte für die Analyse von seltenen Zellen - wie IL-17-positiven Zellen - mittels Durchflusszytometrie sind: <ul><li> Einstellung ein Tor auf Lymphozyten in der Vorwärtsstreuung gegenüber Seite Streudiagramm </li><li> und Ausblendung toten Zellen (gefärbt mit Propidiumiodid) und B-Zellen (die unspezifische Hintergrundfärbung führen) zur weiteren Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit </li></ul></li><li> Wir verwendeten CD4-APC-Antikörper gegen T-Zellen und die CD45R/B220-PerCP Antikörper gegen den B-Zellen erkennen zu erkennen. Wir sehen die Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht Eigenschaften der Proben und wenden ein Tor auf der Lymphozyten-Population. </li><li> Ein zweites Tor wurde angewandt, um die bunten abgestorbenen Zellen und gefärbte B-Zellen (Y-Achse) zu sehen. Diese Zellen sind von der T-Zell-Analyse ausgeschlossen. </li><li> In diesem Beispiel, der im Wesentlichen unsere Negativ-Kontrolle, können wir sehen, dass es nur sehr wenige IL-17 sezernierenden CD4-positiven T-Zellen in unstimulierten Proben - etwa 0,003% (Abbildung 4). Mit Blick auf die stimulierten T-Zell-Population, können wir sehen, eine beträchtliche Anzahl von CD4-positiven T-Zellen, die Sekretion von IL-17 - über 0,367% (Abbildung 5A) vor der Trennung und 60,76% nach magnetischer Separation mit MACS Technology (Abbildung 5B). </li></ol>

Alle Protokolle und Datenblätter finden Sie unter www.miltenyibiotec.com. Warnungen Die Reagenzien enthalten Natriumazid. Unter sauren Bedingungen Natriumazid zu Stickstoffwasserstoffsäure, die extrem giftig ist. Azid-Verbindungen sollten mit fließendem Wasser vor dem Wegwerfen verdünnt werden. Diese Vorsichtsmaßnahmen werden empfohlen, um Ablagerungen in Abflussrohren explosive Bedingungen einstellen können vermieden werden.

TH17-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der adaptiven Immunität und die Entzündungsreaktion und sind eine Schlüsselkomponente beim Vorantreiben autoimmune Entzündung. Dieses Video dokumentiert, wie Miltenyi die Maus verwenden IL-17 Sekretion Assay - Cell Enrichment and Detection Kit (PE). Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, eine Abschätzung der Häufigkeit von IL-17-sezernierenden Zellen in Ihrem Ausgangspunkt Zellpräparation haben. Die entsprechende Zellkonzentration während der Etikettierung und Zytokinsekretion Zeitraum verhindert Kreuzkontaminationen durch andere Zellen in Ihrem Aufhängung und sorgt für zuverlässige Ergebnisse.

<table><tbody><tr><td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent, mouse </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Starting Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Columns</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

Das MACS Zytokinsekretion Assay-Technologie ermöglicht die Erkennung von sezernierten Zytokine auf die einzelne Zelle Ebene und empfindliche Trennung von lebensfähigen Zytokin-sezernierenden Zellen. Um Label IL-17-sezernierenden Zellen, eine einzelne Zelle Aussetzung der Maus Milzzellen präpariert und bei 37 ° C stimuliert mit PMA / Ionomycin zu Zytokinsekretion zu induzieren. So stoppen Sie die Sekretion Zellen werden dann auf Eis gelegt und an den IL-17 Catch-Reagenz ausgesetzt waren, eine bi-spezifische Antikörper, der an CD45 bindet an der Zelloberfläche von Leukozyten und IL-17, wie es ist ausgeschieden und gefangen in der Nähe der Zelloberfläche. Sekretion wird dann durch eine Erhöhung der Temperatur auf 37 neu gestartet ° C und IL-17 wird durch die Catch Reagent gefangen. Sekretion wird dann wieder, indem Zellen auf Eis gestoppt. Zum Nachweis der gefangen IL-17 werden die Zellen mit einem zweiten IL-17-spezifischen Antikörper, konjugiert mit Biotin und ein Anti-Biotin-PE-Antikörper inkubiert. Die Zellen können nun direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden oder hergerichtet für die Isolierung und Anreicherung von spätere Kennzeichnung mit Anti-PE konjugierte MicroBeads.

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Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Dieses Verfahren beschreibt die Detektion und Isolation von Maus-TH17 Leukozyten, die sich aktiv sezernieren IL-17 nach Stimulation.

Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Bildgebung der In Situ Interferon Gamma Produktion in der Maus Milz nach Listeria monocytogenes Infektion

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 aus der Nasenschleimhaut der Maus zum Nachweis der Expression von CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Entschlüsselung der frühen Bindung follikulärer Helfer-T-Zellen bei akuter LCMV-Infektion

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

Autor im Rampenlicht: Aufklärung der Wege der TFH-Zelldifferenzierung bei akuten LCMV-Herausforderungen

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen

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Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Bildgebung der In Situ Interferon Gamma Produktion in der Maus Milz nach Listeria monocytogenes Infektion

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 aus der Nasenschleimhaut der Maus zum Nachweis der Expression von CD226

Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4⁺ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

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