Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Machen Sie einen Puffer mit PBS mit BSA (0,5%) und 2 mM EDTA. Da Luftblasen MACS Trennsäulen Block kann, muss der Puffer entgast und bei 2-8 ° C vor Gebrauch gespeichert werden. </li><li> Wir verwenden RPMI 1640 Medium mit 5% Maus-Serum. Das Kulturmedium sollte nicht enthalten BSA oder FCS, da diese Verbindungen wird die Besonderheit des Zell-Stimulation verändern. </li><li> Die Maus IL-17 Sekretion Assay - Cell Enrichment and Detection Kit von Miltenyi-Biotec. Das Kit enthält folgende Komponenten: der IL-17 Catch-Reagenz, das IL-17 Detection Antibody (Biotin), die Anti-Biotin-PE, und die Anti-PE MicroBeads. </li></ol> Förderung der Milzzellen <ol><li> Dieses Protokoll ist in der Gegenwart eine negative und positive Kontrolle, wie unstimulierten Splenozyten und eine Gegenfärbung für T-Zellen durchgeführt. Dieses Protokoll wird mit einer sterilen Technik durchgeführt. </li><li> Bereiten Sie eine einzelne Zelle Aussetzung der Maus-Splenozyten, dass isolierte Verwendung des gentleMACS ™ Dissociator wurden. Die Konzentration der Zellen sollte über Zellzählung vorgegeben werden. Pellet die Zellen bei 200 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen der Überstand der Pellet mit einer Pipette. Nicht dekantieren das Rohr, um den Verlust des Pellets zu vermeiden. </li><li> Nun, die Zellen in das Kulturmedium und fügen Sie dann zu einem Brunnen. Fügen Sie ausreichend Medium für eine Konzentration von 10 Millionen Zellen pro ml und fünf Millionen Zellen pro Quadratzentimeter. </li><li> Zur Stimulierung einer Immunantwort in unserer resuspendierten Zellen, fügen wir Ionomycin (1 pg / ml) und PMA (10 ng / mL) zur Probe und mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Dann wird der Brunnen sind entsprechend gekennzeichnet. </li><li> Jetzt werden wir unsere Zellen für 3 Stunden bei 37 ° C ohne Mischen auf die Stimulation Periode beginnen. Fahren Sie mit IL-17-Analyse 3 Stunden ab Einsetzen der Stimulation, so entsprechend planen. </li><li> So stoppen Sie die Sekretion werden die Zellen auf Eis gelegt, und wir sammeln die stimulierten Zellen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit kaltem Puffer. Die Zellen werden dann aus dem Brunnen zu einem Röhrchen überführt und gewaschen werden, ein zweites Mal. </li><li> Um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt sind, ist es eine gute Idee, Ihr Gericht unter einem Mikroskop zu überprüfen. Wenn Zellen immer noch verbunden bleiben, können Sie die restlichen Zellen durch Spülen der Teller mit kaltem Puffer zu sammeln. Jede Zellklumpen in ihrer Zellsuspension kann mit Hilfe der Pre-Trennfilter werden. </li></ol> Labeling der Zellen mit Catch Reagent <ol><li> Es ist äußerst wichtig zu beachten, dass dieser Test optimal funktioniert, wenn weniger als 2% der IL-17-sezernierenden Zellen vorhanden sind. </li><li> Wenn die Konzentration von IL-17 sezernierenden Zellen wird erwartet, dass mehr als 2% einstellen Volumina entsprechend. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="Abbildung 8" width="500" height="162" /></li><li> Eine mögliche Fehlerquelle dieses Verfahrens ist eine Kreuzkontamination von der Catch Reagent, die beim Etikettieren auftreten können, wenn die bi-spezifische Antikörper bindet an ein nicht-sezernierenden T-Zellen und Fallen IL-17 aus einem benachbarten Lymphozyten sezerniert wird, um dadurch Fehlalarme. </li><li> Um dieses Problem zu umgehen, ist es wichtig, kühlen Zellen nach unten vor der Markierung und die Arbeit mit kaltem Puffer zur Verbreitung von IL-17 langsam und vermeiden Kreuzkontamination. Zusätzlich zu halten die Zellen kalt, müssen sie bei einer definierten Konzentration gehalten werden. </li><li> Zu Beginn der Kennzeichnung Verfahren verwenden wir 10 Millionen Zellen in einer 15 ml Tube verschließbar. Werden höhere Zellzahlen verwendet werden müssen, einfach skalieren alle Volumes entsprechend. Sobald die optimale Zellkonzentration erhalten worden ist, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml kaltem Puffer. </li><li> Spin down die Zellen bei 300 × g für 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge (2-8 ° C). </li><li> Nach der Zentrifugation absaugen Überstand vollständig mit einer Pipette. Nicht Dekantieren des Überstandes, da dies zu Zellverlust und ungenau Volumina führen wird. Wiederholen Sie den Waschvorgang, die der Zugabe von 10 ml kaltem Puffer, Zentrifugation und Aspiration besteht. </li><li> Jetzt, da wir ein Pellet der gewünschten Reinheit haben, die Zellen in 80 ul der kalten Kulturmedium. Um beschriften, werden wir nun mit 20 ul der Maus IL-17 Catch-Reagenz. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 5 Minuten auf dem Eis. </li><li> Nach der 5 Minuten Inkubationszeit auf Eis, entfernen Sie den Schlauch und verdünnen die Zellen in 10 ml 37 ° C warmen Medium. Dann sichern Sie den Schlauch auf den MACSmix Tube Rotator und inkubieren das Rohr bei 37 ° C für 45 min unter ständiger Bewegung. Eine Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C wird neu gestartet Zytokinsekretion. </li></ol> Labeling der Zellen mit IL-17 Detection Antibody (Biotin) und Anti-Biotin-PE <ol><li> Nach dem 45 Minuten-Sekretion Zeitraum bei 37 ° C wird das Reagenzglas sofort auf Eis. Dieser stoppt Zytokinsekretion. Von hier aus ist es wichtig, die Zellen auf Eis zu halten.Arbeiten mit kaltem Puffer wird verhindert Kreuzkontaminationen des Catch Reagent. </li><li> Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem Puffer und Zentrifuge bei 300xg bei 2-8 ° C für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. </li><li> Das Zellpellet wird in 80 ul kaltem Puffer resuspendiert und die Röhre wird auf Eis gelegt. </li><li> Um zu vermeiden, unspezifische Bindung des Antikörpers, empfehlen wir die Zugabe von 10 &amp;mgr; l FcR Blockierungsreagenz und auf Eis inkubieren für 5 min. Dann fügen wir 20 uL Maus IL-17 Detection Antibody (Biotin), die konjugierte Biotin und für 10 Minuten auf Eis inkubieren ist. </li><li> Wieder einmal waschen Sie die Zellen wie wir schon früher durch Zugabe von 10 ml kaltem Puffer und Zentrifuge bei 300xg bei 2-8 ° C für 10 min durchgeführt. </li><li> Jetzt saugen Sie den Überstand und Zellpellet in 80 ul kaltem Puffer. </li><li> Add 20 uL unserer sekundären Antikörper, Anti-Biotin-PE. </li><li> Mischen Sie die Zellen und sekundären Antikörper-Lösung, und wieder inkubieren Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis. </li><li> Nach dieser zweiten Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen mit 10 ml kaltem Puffer und Zentrifuge. </li><li> Das Pellet kann nun in 500 ul kaltem Puffer resuspendiert werden. </li><li> Wenn die Zellen für weitere Downstream-Analyse getrennt werden müssen, können sie magnetisch mit Anti-PE-MicroBeads beschriftet werden und manuell oder automatisiert mittels MACS-Säulen und MACS-Separatoren getrennt. </li><li> Wir haben nun die Beschriftung der Splenozyten abgeschlossen und sind für die Analyse bereit. </li></ol> FACS-Analyse <ol><li> Für unsere Analyse werden wir die stimulierten und unstimulierten Splenozyten mittels Durchflusszytometrie zu vergleichen. </li><li> Vor durchflusszytometrischen Analyse werden die Zellen mit Propidiumiodid bei 0,5 pg / mL zu Tor aus toten Zellen gefärbt. Die MACSQuant ™ Analyzer wurde mit 200.000 Zellen pro Probe geladen und wir werden in Zukunft an die Streudiagramme der relativen Antikörperreaktivität in den Proben zu suchen. Zwei wichtige Aspekte für die Analyse von seltenen Zellen - wie IL-17-positiven Zellen - mittels Durchflusszytometrie sind: <ul><li> Einstellung ein Tor auf Lymphozyten in der Vorwärtsstreuung gegenüber Seite Streudiagramm </li><li> und Ausblendung toten Zellen (gefärbt mit Propidiumiodid) und B-Zellen (die unspezifische Hintergrundfärbung führen) zur weiteren Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit </li></ul></li><li> Wir verwendeten CD4-APC-Antikörper gegen T-Zellen und die CD45R/B220-PerCP Antikörper gegen den B-Zellen erkennen zu erkennen. Wir sehen die Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht Eigenschaften der Proben und wenden ein Tor auf der Lymphozyten-Population. </li><li> Ein zweites Tor wurde angewandt, um die bunten abgestorbenen Zellen und gefärbte B-Zellen (Y-Achse) zu sehen. Diese Zellen sind von der T-Zell-Analyse ausgeschlossen. </li><li> In diesem Beispiel, der im Wesentlichen unsere Negativ-Kontrolle, können wir sehen, dass es nur sehr wenige IL-17 sezernierenden CD4-positiven T-Zellen in unstimulierten Proben - etwa 0,003% (Abbildung 4). Mit Blick auf die stimulierten T-Zell-Population, können wir sehen, eine beträchtliche Anzahl von CD4-positiven T-Zellen, die Sekretion von IL-17 - über 0,367% (Abbildung 5A) vor der Trennung und 60,76% nach magnetischer Separation mit MACS Technology (Abbildung 5B). </li></ol>

Alle Protokolle und Datenblätter finden Sie unter www.miltenyibiotec.com. Warnungen Die Reagenzien enthalten Natriumazid. Unter sauren Bedingungen Natriumazid zu Stickstoffwasserstoffsäure, die extrem giftig ist. Azid-Verbindungen sollten mit fließendem Wasser vor dem Wegwerfen verdünnt werden. Diese Vorsichtsmaßnahmen werden empfohlen, um Ablagerungen in Abflussrohren explosive Bedingungen einstellen können vermieden werden.

TH17-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der adaptiven Immunität und die Entzündungsreaktion und sind eine Schlüsselkomponente beim Vorantreiben autoimmune Entzündung. Dieses Video dokumentiert, wie Miltenyi die Maus verwenden IL-17 Sekretion Assay - Cell Enrichment and Detection Kit (PE). Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, eine Abschätzung der Häufigkeit von IL-17-sezernierenden Zellen in Ihrem Ausgangspunkt Zellpräparation haben. Die entsprechende Zellkonzentration während der Etikettierung und Zytokinsekretion Zeitraum verhindert Kreuzkontaminationen durch andere Zellen in Ihrem Aufhängung und sorgt für zuverlässige Ergebnisse.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-094-213</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx</a>
</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Medium</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-440</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>CD4-APC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-611</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>CD8a-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-605</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-093-233</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>FcR Blocking reagent, mouse </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-575</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MACSmix Tube Rotator</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-753</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>gentleMACS&#x2122; Dissociator</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-093-235</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>autoMACS Pro Starting Kit</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec </td>
<td>130-092-545</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACS Columns</td>
<td>Tool</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACS Separator</td>
<td>Tool</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

Das MACS Zytokinsekretion Assay-Technologie ermöglicht die Erkennung von sezernierten Zytokine auf die einzelne Zelle Ebene und empfindliche Trennung von lebensfähigen Zytokin-sezernierenden Zellen. Um Label IL-17-sezernierenden Zellen, eine einzelne Zelle Aussetzung der Maus Milzzellen präpariert und bei 37 ° C stimuliert mit PMA / Ionomycin zu Zytokinsekretion zu induzieren. So stoppen Sie die Sekretion Zellen werden dann auf Eis gelegt und an den IL-17 Catch-Reagenz ausgesetzt waren, eine bi-spezifische Antikörper, der an CD45 bindet an der Zelloberfläche von Leukozyten und IL-17, wie es ist ausgeschieden und gefangen in der Nähe der Zelloberfläche. Sekretion wird dann durch eine Erhöhung der Temperatur auf 37 neu gestartet ° C und IL-17 wird durch die Catch Reagent gefangen. Sekretion wird dann wieder, indem Zellen auf Eis gestoppt. Zum Nachweis der gefangen IL-17 werden die Zellen mit einem zweiten IL-17-spezifischen Antikörper, konjugiert mit Biotin und ein Anti-Biotin-PE-Antikörper inkubiert. Die Zellen können nun direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden oder hergerichtet für die Isolierung und Anreicherung von spätere Kennzeichnung mit Anti-PE konjugierte MicroBeads.

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells at JoVE.com

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Dieses Verfahren beschreibt die Detektion und Isolation von Maus-TH17 Leukozyten, die sich aktiv sezernieren IL-17 nach Stimulation.

Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

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ChineseVersion
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JapaneseVersion
</a>

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K Aufrufe.  Miltenyi Biotec,GmbH.  ChineseVersion JapaneseVersion 

Serie: Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Forschung

Biologie

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolierung von Basalzellen und Submuköse Gland Duct Zellen aus Maus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...