Test douleur chaleur utilisant la Thermostimulator TSA II 1. Présentation <ol><li> Cette procédure utilise la Seconde TSA, une commercialement disponibles thermo-sensorielles analyseur qui délivre des stimuli chaleur à la peau avec un thermode (Médoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Une unité centrale génère et transmet le signal à la thermode. Ce signal est contrôlé par un logiciel propriétaire généralement stockés sur un ordinateur portable connecté à l&#39;unité centrale. Aussi attaché à l&#39;unité centrale est un contrôle à main qui permet à un sujet d&#39;étude pour arrêter le chauffage de la thermode. </li><li> Sept des stimuli thermiques séquentiel et identiques sont livrés, avec des intervalles inter-stimulus de 30s. La température basale thermode est fixé à un confortable 35 ° C. La vitesse à laquelle la thermode réchauffe est fixé à 1 º C / s, tandis que la vitesse à laquelle il se refroidit est fixé à 10 º C / s. La température maximale thermode est fixée à 52 º C. </li></ol> 2. Préparation et formation des Sujets <ol><li> Pour préparer des sujets pour le siège de test thermique douleur les confortablement dans un fauteuil inclinable qui offre un soutien adéquat pour la tête, des bras et des jambes. Le président doit également permettre un accès facile aux sites du corps examiné. </li><li> L&#39;installation d&#39;essai doit être à une température ambiante agréable, et de fournir un environnement calme et neutre sans distraction. </li><li> Avant de commencer l&#39;expérience, tous les participants doivent être bien formés dans tous les aspects de l&#39;essai la douleur de la chaleur. La formation peut avoir lieu n&#39;importe quand avant l&#39;expérience. </li><li> Les interactions entre les sujets de l&#39;étude et les enquêteurs devraient être limités à ceux nécessaires pour la collecte des données. Blague et de petit entretien sont découragés parce qu&#39;ils peuvent compromettre la cohérence des données. Sujets d&#39;étude sont informés que les interactions seront volontairement être un peu monotone et neutre pendant les expériences. </li><li> Conserver les instructions claires, simples et cohérents. Souligner que la douleur est subjective, et il n&#39;ya pas de bonnes ou mauvaises réponses. Il est le plus important d&#39;être cohérent. Définir le seuil de la douleur de la chaleur comme le point entre être &quot;au sujet d&#39;être douloureux&quot; et &quot;juste devenu douloureux.&quot; </li><li> Il est essentiel que le sujet sait précisément à quoi s&#39;attendre lors d&#39;une session de test. Toute «surprises» peut donner lieu à moins de données cohérentes, parce que les facteurs confondants tels que l&#39;anxiété peut être générée. Par exemple, si sept stimuli de la douleur thermique sont utilisés pour déterminer le seuil de douleur de la chaleur, le sujet doit le savoir. </li><li> A tout moment, le sujet peut arrêter le thermode d&#39;obtenir plus chaud en poussant le bouton d&#39;un contrôle manuel. Être en contrôle permettra de réduire l&#39;anxiété d&#39;un sujet et de rendre les données plus fiables. </li><li> La session de formation offre une occasion de juger la performance d&#39;un sujet étude. Il peut être préférable de former des sujets pendant deux à quatre cycles d&#39;essai de sorte que leurs seuils de douleur individuels varient pas de plus de 0,8 ° C, et idéalement d&#39;au plus 0,6 ° C entre les deux derniers cycles d&#39;essai. Les sujets qui ne parviennent pas à performer de façon constante sont généralement exclus de l&#39;étude. </li></ol> 3. Déterminer le seuil de douleur <ol><li> Pour commencer les cycles de tests seuil de douleur marque l&#39;emplacement de la thermode sur la peau du sujet. Dans cette expérience, la lésion cutanée inflammatoire utilisé pour la même microdialyse sera testé pour la douleur d&#39;apprendre biochimiques libérés en réponse à l&#39;essai la douleur. </li><li> Puis, départ de chaque cycle en plaçant le thermode sur la zone de la peau marquée. Correspondre à la position de l&#39;thermode avec les marques d&#39;aussi près que possible. Laisser la température entre la peau et la thermode s&#39;équilibrer à 35 ° C - une température qui ne causera pas de façon sécuritaire la douleur. Cela va prendre environ 5 secondes et sera indiqué par une lecture de 35 ° C sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. </li><li> Avant de commencer, donner le contrôle à main pour le sujet. </li><li> Utiliser une pression constante et douce pour garder toute la surface de la thermode en plein contact avec la peau du sujet pendant le test. </li><li> Maintenant lancer l&#39;algorithme de test pré-programmé. Le thermode commencera échauffement à 1 ° C / s. Dès que le sujet éprouve des douleurs, ils vont appuyer sur l&#39;appareil portatif. </li><li> Après la presse bouton sur l&#39;appareil portatif, la douleur de température provoquant thermode sera automatiquement enregistrée et commencera à diminuer à un taux de 10 ° C / s jusqu&#39;à sa température de référence de 35 ° C. </li><li> La sonde de température sera automatiquement maintenu à 35 ° C pendant 30 s avant qu&#39;il ne commence à augmenter à nouveau à 1 ° C / s, jusqu&#39;à ce que le sujet pousse à nouveau sur le bouton de l&#39;appareil portatif. Juste avant que la température est d&#39;environ thermode à augmenter à nouveau, rappeler le sujet que ce qui va se passer. Cela permet de garder le sujet centré. </li><li> Cette séquence sera répétée jusqu&#39;à sept enregistrements de température ont été enregistrés. Calculer la moyenne de ces Tempelectures rature, ce qui est le seuil de douleur de la chaleur. </li></ol> Test douleur mécanique avec des sondes de pression Ponctué 1. Présentation <ol><li> Nous utilisons sur mesure calibré des sondes de pression rythmée, parce qu&#39;ils fournissent des résultats plus cohérents que les cheveux traditionnellement utilisées et disponibles dans le commerce de von Frey. Les sondes sont identiques en cylindriques fils en acier inoxydable (240 um de diamètre) montés sur des tiges de cuivre de différents poids (1, 2, 4, 8, 16, 32, 49, 64 et 81 grammes) qui se déplacent librement dans une large main tenu tube en aluminium. </li><li> Les mêmes conditions expérimentales générales décrites pour tester la douleur de la chaleur aux essais sur la douleur mécanique. Les sujets doivent être bien préparés et formés. Il est particulièrement important de rassurer les sujets que les sondes sont émoussées et ne seront pas percer la peau. Cela aidera les sujets pour se détendre et de fournir des données cohérentes. </li></ol> 2. Déterminer le seuil de douleur mécanique <ol><li> Pour déterminer le seuil de la douleur mécanique, appliquer d&#39;abord l&#39;extrémité du fil d&#39;acier le plus léger de sonde perpendiculairement à la peau au centre de la lésion expérimentale enflammée. </li><li> Le tube en aluminium à main est alors descendu vers la peau sans la toucher. De cette façon, tout le poids de la tige de cuivre à l&#39;intérieur du tube en aluminium repose sur la pointe de fil d&#39;acier. </li><li> Le sujet d&#39;étude indique alors si la sonde provoque une douleur en disant «oui» ou «non». </li><li> Si les réponses soumises &quot;non&quot;, alors soit la sonde même ou le lendemain de sonde plus lourd sera utilisé prochaine. Cet algorithme est appelé une séquence de stimulation ascendant. Au hasard de déterminer si la sonde suivante est plus lourd ou du même poids. Cela permet de garder un sujet aveuglé à l&#39;algorithme. </li><li> Appliquer les sondes dans l&#39;ordre croissant jusqu&#39;à une réserve réponses «oui». Le poids moyen des deux dernières sondes de cette série est enregistré comme point de première déviation. </li><li> Après les réponses soumises &quot;oui&quot;, de commencer à utiliser une séquence de stimulation en descendant, et utiliser un briquet sonde ou la sonde comme avant. Au hasard de déterminer si la sonde suivante est plus léger ou du même poids. Cela permet de garder un sujet aveuglé l&#39;algorithme. </li><li> Appliquer les sondes dans une séquence descendante jusqu&#39;à ce que le sujet répond «non». Le poids moyen des deux dernières sondes dans cette séquence constitue le point de déviation seconde. </li><li> Lorsque les réponses soumises &quot;non&quot;, revenir à une séquence de stimulation ascendant. Alterner entre ascendant et descendant jusqu&#39;au séquences sept points de déviation sont enregistrées. La moyenne de ces sept points est le seuil de la douleur mécanique. </li></ol>

<ol>
	<li>Angst, M. S., Clark, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comment+on+Koltzenburg+et+al.:+Differential+sensitivity+of+three+experimental+pain+models+in+detecting+the+analgesic+effects+of+transdermal+fentanyl+and+buprenorphine.">Comment on Koltzenburg et al.: Differential sensitivity of three experimental pain models in detecting the analgesic effects of transdermal fentanyl and buprenorphine.</a> Pain. 126, 165-174 (2006).</li><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation,+noxious+stimulation,+and+administration+of+a+COX-inhibitor:+A+microdialysis+study.">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation, and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. , (2008).</li><li>Angst, M. S., Koppert, W., Pahl, I., Clark, J. D., Schmelz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+infusion+of+the+mu-opioid+agonist+remifentanil+in+humans+causes+hyperalgesia+during+withdrawal.">Short-term infusion of the mu-opioid agonist remifentanil in humans causes hyperalgesia during withdrawal.</a> Pain. 106, 49-57 (2003).</li><li>Lotsch, J., Angst, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mu-opioid+agonist+remifentanil+attenuates+hyperalgesia+evoked+by+blunt+and+punctuated+stimuli+with+different+potency:+a+pharmacological+evaluation+of+the+freeze+lesion+in+humans.">The mu-opioid agonist remifentanil attenuates hyperalgesia evoked by blunt and punctuated stimuli with different potency: a pharmacological evaluation of the freeze lesion in humans.</a> Pain. 102, 151-161 (2003).</li></ol>

Cette vidéo montre des algorithmes pour évaluer la chaleur et le seuil de douleur mécanique dans la peau enflammée des volontaires humains. La perception de la douleur est subjective. La collecte de données adéquat de la douleur nécessite une installation d&#39;essai appropriés (p. ex calme et rassurant), la formation approfondie des participants à l&#39;étude avec des mesures données dans construite contrôle qualité (fiabilité test-retest), le strict respect d&#39;un protocole d&#39;étude standardisée, et l&#39;évitement des facteurs confondants (stress, anxiété). Fiable données subjectives sur la sensibilité à la douleur, couplé à des interventions telles que l&#39;administration d&#39;un médicament analgésique et la collecte de données mécanistes tels que la libération locale de médiateurs nociceptifs de fournir des informations précieuses sur les mécanismes de la douleur, et des moyens pour prévenir ou atténuer elle.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>TSA-II Neuro Sensory Analyzer</td>
<td>Tool</td>
<td>Medoc Advanced Medical Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puntuated Pressure Probes</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alternatively, commercially available von Frey Hairs can be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Dans un article précédent dans le Journal of Experiments visualisé nous avons démontré les techniques de microdialyse cutanée pour la collecte de tissu-spécifique biochimiques nociceptives et inflammatoires chez les humains. Dans cet article nous allons montrer la douleur tests paradigmes qui sont souvent utilisés en tandem avec les procédures de microdialyse. Combinant les tests douleur avec microdialyse fournit le lien essentiel entre les données comportementales et biochimiques qui permet d&#39;identifier les principaux produits biochimiques responsables de la génération et la propagation de la douleur. Deux modèles de douleur dans la peau enflammée évoquant des participants à l&#39;étude humaine sont présentés. Le premier modèle évoque la douleur avec l&#39;aide de stimuli thermiques. Chauffer la douleur évoquée comme décrit ici est principalement médiée par des petits, non myélinisées périphériques fibres nerveuses nociceptives (fibres C). Le second modèle évoque la douleur via des stimuli de pression rythmée. Douleur de pression Ponctué évoquée est principalement médiée par de petites myélinisées périphériques fibres nerveuses nociceptives (A-delta fibres). Les deux modèles sont mécanistiquement distinctes et indépendantes d&#39;examiner le traitement nociceptif par les deux principaux périphériques populations de fibres nerveuses impliquées dans la signalisation douleur. Chauffer la douleur est évoquée avec l&#39;aide de la Seconde TSA, une commercialement disponibles thermo-sensorielles analyseur (Médoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Configuration de stimulation et la livraison est assurée avec l&#39;aide de logiciels spécifiques. Thermodes varient en taille et en forme, mais en principe, d&#39;une plaque de métal qui peuvent être chauffés ou refroidis à des taux différents et pour des périodes de temps différentes. Algorithmes d&#39;évaluer la chaleur évoqué la douleur sont multiples. Dans les expériences montré ici, participants à l&#39;étude sont invités à indiquer à quel moment ils commencent à ressentir de la douleur tandis que le thermode en contact avec la peau est chauffée à un taux prédéterminé de départ à une température qui ne provoque pas de douleur. La température à laquelle thermode un sujet éprouve de la douleur commence constitue le seuil de la douleur de la chaleur. La douleur mécanique est évoqué avec des sondes ponctué. Ces sondes sont disponibles commercialement auprès de plusieurs fabricants (von Frey poils). Cependant, l&#39;exactitude des poils de von Frey a été critiqué et de nombreux chercheurs utilisent des sondes de pression sur mesure ponctuée. Dans les expériences montré ici huit sur-mesure des sondes ponctué de poids différents sont appliqués dans l&#39;ordre consécutif, une procédure appelée algorithme de haut en bas, à identifier les points de déviation perceptive, c&#39;est à dire, un changement de sentiment aucune douleur à ressentir la douleur ou vice versa. Le poids moyen provoquant une déviation perceptive constitue le seuil de la douleur mécanique.

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Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Algorithmes d&#39;évaluer les seuils de douleur thermique et mécanique de la peau enflammée expérimentalement des sujets de l&#39;étude humaine sont présentés. Les deux modèles de test douleurs nociceptives examiner séparément le traitement par les deux principaux périphériques populations de fibres nerveuses de transmettre la douleur, c&#39;est à dire, non myélinisées de fibres myélinisées C et petites fibres A-delta.

Déterminer la chaleur et le seuil de douleur mécanique dans la peau enflammée des sujets humains

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

determining-heat-mechanical-pain-threshold-inflamed-skin-human

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K vues.  Stanford University School of Medicine. Algorithmes d'évaluer les seuils de douleur thermique et mécanique de la peau enflammée expérimentalement des sujets de l'étude humaine sont présentés. Les deux modèles de test douleurs nociceptives examiner séparément le traitement par les deux principaux périphériques populations de fibres nerveuses de transmettre la douleur, c'est à dire, non myélinisées de fibres myélinisées C et petites fibres A-delta.

Vidéo: Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utiliser Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) pour développer des outils diagnostiques

Recherche

Biologie

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Transplantation de peau murine

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantation de l&#39;ingénierie tissulaire dans le coeur de rat

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

Démonstration de L&#39;allodynie cutanée En association avec la douleur pelvienne chronique

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Numérique Inline Holographic Microscopy (SMIH) de faiblement diffusant Sujets

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Culture de la peau de souris embryonnaires et Live-imagerie de la migration mélanoblaste

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional intercellulaire Communication: Un biomarqueur fonctionnelle pour évaluer les effets néfastes des substances toxiques et les toxines, et bienfaits pour la santé des produits naturels

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Here we present a method to measure organismal fat levels in the third instar (L3) larval stage of Drosophila melanogaster. This method exploits the comparatively low density of fat tissue to differentiate between larvae with altered fat stores. Buoyancy-based analysis is a valuable tool for rapid, reproducible, and economical screening.

Une méthode de détermination des niveaux de graisse dans la base Flottabilité-<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...