SW et TMV sont soutenus par le NHLBI et NCRR au National Institutes of Health. BSK et HS sont soutenus par le NINDS et NIGMS des Instituts nationaux de la Santé.

Procédures expérimentales La procédure expérimentale (Fig. 2) se compose de quatre parties qui sont décrits d&#39;une manière graduelle ci-dessous. Partie 1: Sous-clonage et l&#39;expression de la partie C-terminale du récepteur P2X2. Nous avons exprimé toute la longueur C-terminale de P2X2 récepteurs dans des bactéries pour identifier les protéines du cerveau à laquelle il se lie. <ol><li> Le C-terminale (résidus 353 à 472) du récepteur P2X2 (Fig 1) a été amplifié par PCR, clonées dans pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) et vérifiées avec le séquençage. </li><li> Le plasmide recombinant a été transformé en E. Coli (BL21) pour l&#39;expression de protéines recombinantes. </li><li> Stocks de glycérol de bactéries (E. coli BL21) contenant le CT-P2X2 TPS plasmides ont été grattées avec une pipette stérile et inoculé dans 5 ml de milieu Luria-Bertani (LB) des médias avec un marqueur sélectif approprié (50 g / ml d&#39;ampicilline) et incubée pendant une nuit dans un agitateur orbital à 37C. </li><li> Les cultures ont été inoculées cultivées pendant une nuit dans 250 ml de milieu LB avec un antibiotique approprié (50 pg / ml d&#39;ampicilline) et incubées dans un agitateur orbital à 250 rpm pendant 2-3 heures à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la densité optique à 600 nm atteint ~ 0,6 au 0,7. </li><li> La culture a été induite avec 1 mM d&#39;IPTG et encore incubées à 37 ° C pendant 3 heures pour l&#39;expression protéique. </li><li> La culture a été ensuite centrifugé à 5000 g pendant 15 min à 4 ° C (1ml de la culture a été sauvé pour analyser le niveau d&#39;expression et étiquetés comme «induite»). Le surnageant a été jeté et le culot a été resuspendu dans 20 ml de solution saline Tris-EDTA (STE) tampon (10 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). </li><li> La suspension a été centrifugé à 5000 g pendant 15 min dans un tube Falcon de 50 ml. Le surnageant est écarté et le culot semi-sec a été congelée à-70C la nuit. </li><li> Le 70C-culot a été resuspendu dans 40 ml de tampon de lyse glacée (2% (p / v) sarkosyl, 15 mg de lysozyme, NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5, 5 mM de DTT et complète comprimé d&#39;inhibiteur de protéase) , et la suspension a été incubé sur glace pendant 30 min. Pendant cette incubation, 3 ml de glutathion-Sépharose 4B perles ont été lavées avec 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) et 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) TritonX-100 dans le PBS), suivie par PBS. Les perles ont été remises en suspension dans 1 ml de PBS. </li><li> La suspension bactérienne a été congelé-décongelé 3 fois dans de l&#39;azote liquide et soniqué (1s on / off, 30 microns pendant 3 min sur la glace) et encore incubées pendant 30 min à 4% (v / v) de Triton X-100, 10 mM de MgSO 4 et 2 mM d&#39;ATP sur la glace. </li><li> Le lysat a été centrifugé à 20000 g pendant 15 min à 4 ° C et de culot a été mis au rebut (un échantillon de granulés et 1 ml de surnageant a été sauvé par SDS-PAGE de tester les quantités de protéines dans le cytosol et les membranes). Le surnageant a été incubé avec les billes pendant 1 heure (ou une nuit) à 4C. </li><li> Les perles ont été centrifugés à 500 g pendant 5 min et le surnageant a été éliminé (échantillon a été sauvé de la fraction non liée). Les billes ont été lavées avec du PBS-T à cinq reprises (lavages ont été enregistrés pour les contrôles de lavage). </li><li> Les billes sont ensuite remises en suspension dans du PBS pour donner 50% (p / v) lisier et stockées dans un réfrigérateur à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. La concentration en protéine a été estimée par dosage de Bradford (selon les instructions du fabricant). </li></ol> Partie 2: Préparation des lysats ensemble du cerveau P2X2 récepteurs sont connus pour être abondamment exprimé dans le cerveau 8. Dans les présentes analyses, nous avons cherché à identifier les protéines interagissant avec les récepteurs P2X2 à partir de lysats de cerveau de rat entier (Fig. 3). <ol><li> Cerveau de rat adulte a été récolté (animaux ont été sacrifiés selon une UCLA IAACUC approuvé le protocole et selon les NIH Guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire) et rincés immédiatement PBS glacé (3X). </li><li> Pour lyser les cellules de 10 ml (~ 5 fois le poids humide du cerveau récoltés) de tampon de lyse glacée contenant 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, EDTA 10 mM, EGTA 1 mM, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, PMSF 1 mM, 5 ug / ml de leupeptine, 1% (v / v) NP-40, et un comprimé de cocktail inhibiteur de protéase a été ajouté au cerveau récoltés. </li><li> Tissu cérébral a été homogénéisé sur la glace avec un homogénéiseur Dounce en verre jusqu&#39;à obtenir un mélange homogène de consistance a été atteint. </li><li> Lysat cellulaire a été centrifugé à 2000 g pendant 5 minutes pour éliminer les cellules ininterrompue. Le surnageant a été recueilli et filé à nouveau à 29000 g pendant 60 minutes pour enlever les organites intacts et les agrégats de membrane. </li><li> Immédiatement après la centrifugation, le surnageant a été transféré dans un tube propre. La concentration en protéines du lysat ensemble du cerveau a été mesurée par dosage de Bradford (généralement ~ 15 mg / ml). </li><li> Le lysat a été aliquote et conservé à-70C. </li></ol> Partie 3: Isolement des protéines P2X2 C-queue associés Afin d&#39;identifier les partenaires de liaison de P2X2 CT-TPS à partir de lysats ensemble du cerveau, un menu déroulant dosage a été effectué en utilisant CT-GST immobilisées sur billes de glutathion-sépharose 4B comme appât. Pour les contrôles, la GST seule liés à des billes a été utilisé. <ol><li> Cerveau lysat a été prédédouanés avec des perles de la TPS pour 1 h à 4C. Le culot a été jeté et le surnageant a été utilisé pour d&#39;autres analyses. </li><li> Des quantités égales de la TPS et P2X2 CT-TPS (10 ug) lié au glutathion sépharose 4 billes B ont été incubées pendant la nuit avec 100 g de protéines solubilisées prédédouanés partir d&#39;un lysat cerveau de rat entier, avec une rotation à 4 ° C dans le tampon de lyse. </li><li> Perles ont été centrifugés à 1000 g pendant 5 min et le surnageant a été jeté. </li><li> Les billes ont été lavées une fois avec le tampon de lyse et bouilli dans modifiés Laemli buffer [4% (p / v) de SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoéthanol, 2% (v / v) de glycérol, 0,004% (p / v) de bleu de bromophénol et 0,125 M pH 6,8 TrisCl] pendant 5 min. </li><li> Les échantillons ont été centrifugés à 5000 g pendant 5 min et le surnageant séparés par 10% SDS-PAGE (figure 4). Les gels ont été colorés avec du gel SYPRO Ruby protéines tache (selon les instructions du fabricant) et visualisées sous lumière ultraviolette. P2X2 CT-protéines associées ont été comparés avec ceux récupérés en utilisant la TPS nul comme appât. Quatre répliques ont été réalisées biologiques (soit quatre cerveaux et quatre menus déroulants indépendants). </li></ol> Partie 4: Identification des protéines. Les protéines séparées par électrophorèse sur gel ont été excisée du gel et identifiés par spectrométrie de masse 12. Remarque: l&#39;absence de poussière au long du processus est essentielle pour réduire la contamination de kératine. L&#39;expérimentateur doit porter un masque, filet à cheveux et des gants en tout temps et ne jamais toucher la région de gel d&#39;intérêt sans l&#39;utilisation de gants. <ol><li> Toutes les bandes de protéines visibles récupéré de l&#39;attraction P2X2 bas ont été excisées avec une lame de rasoir propre et coupée en dés (Fig. 4). Régions correspondantes du gel de la TPS-nulle déroulant voies ont également été excisées de la même manière sans égard aux taches bande (bandes spécifiques pour l&#39;appât TPS-nulle ont également été excisée et identifiés) pour s&#39;assurer que la présence de protéines en dessous du niveau de la sensibilité coloration n&#39;a pas été manquée. </li><li> Les morceaux de gel ont été incubées avec 200 pl de 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium dans 50% (v / v) d&#39;acétonitrile (ACN) et les tubes vortex pendant 15 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage. </li><li> Les morceaux de gel ont été déshydratés par addition de 200 ul d&#39;acétonitrile (morceaux de gel devrait diminuer et deviennent opaques en couleur). </li><li> Acétonitrile a été enlevé et les morceaux de gel séché dans un speedvac pour ~ 10 min. </li><li> Les morceaux de gel sont ensuite incubées avec 30 pl de l&#39;fraîchement préparés Tris 10 mM DTT/10 mm (2-carboxy-éthyl) chlorhydrate de phosphine (PTCE) d&#39;un volume suffisant pour immerger les pièces. Cela a été laissé pendant 30 min à bain d&#39;eau 56C. </li><li> Suivant la solution la TNT a été remplacé par 100 ul de bicarbonate d&#39;ammonium 500 mM en solution d&#39;acétonitrile 50% et les tranches de gel lavée avec du bicarbonate ammounium. </li><li> La solution de lavage a été aspirée et 200 ul d&#39;acétonitrile ajouté à déshydrater les gels. </li><li> L&#39;acétonitrile a ensuite été enlevé et 100 ul fraîchement préparés solution 100 mM iodoacétamide a été ajouté à alkylat sulfhydryls libre. Cette étape a procédé pendant 25 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Solution iodoacétamide a été enlevé et les morceaux de gel sont lavées avec 200 ul de 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium dans acétonitrile à 50% (pH 8,0) pendant 2 min tout en vortex. Cette étape de lavage a été répété. </li><li> Après avoir retiré la solution de lavage, les morceaux de gel ont été incubées avec 200 ul d&#39;acétonitrile, qui est ensuite éliminé par speedvac pour ~ 10min. </li><li> À cette étape, les morceaux de gel sont prêtes pour la digestion de trypsine. Morceaux de gel ont été incubés dans 30 ul solution de trypsine (20 ng / uL concentration de travail) et placé sur la glace pendant 10 min pour les gels d&#39;être bien gonflés. Trypsine en excès est éliminé et réhydratés particules de gel recouvert de 30 ul avec 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium pour les maintenir immergés tout au long de digestion qui a été autorisé à procéder pendant 12 à 16 heures à 37C. </li><li> Cinq ul de 5% (v / v) d&#39;acide formique est ajouté pour désactiver la digestion par la trypsine et d&#39;arrestation. </li><li> Les tubes ont été vortexés pour ~ 15 min et centrifugé brièvement pour amener le liquide au fond du tube qui a ensuite été transféré à un endroit propre et étiqueté flacon de 0,5 ml. </li><li> Suivant 30 ul de 0,1% (v / v) d&#39;acide formique dans l&#39;acétonitrile à 50% a été ajouté à des morceaux de gel de sorte qu&#39;ils étaient juste couverte suivie par deux vortex pendant 10-15 min, séparées par une brève centrifugation. Cette étape a été répétée une fois, en remplacement de l&#39;acide formique-acétonitrile entre les étapes. </li><li> Le liquide final a été enlevé et toutes les solution d&#39;extraction combinés dans un seul flacon. Ce volume a été réduit à environ 30 uL dans le speedvac. L&#39;échantillon était maintenant prêt pour la phase de nano-chromatographie liquide inverse et l&#39;identification des protéines par spectrométrie de masse. Dans cet exemple précis, cette étape est réalisée sur un spectromètre Orbi-piège de masse en tandem à partir ThermoFIsher (choisi pour sa précision de la masse élevée, cycle rapide pour la détection de protéines et généralement robustes fonctionnalités d&#39;exploitation), bien que d&#39;autres modèles et d&#39;instruments de fabricants pourraient facilement être couplé avec l&#39;approche décrite à ce point. </li><li> Les détails et les critères pour l&#39;analyse par spectrométrie de masse sont maintenant brièvement présentées. Tous les peptides ont été séparés par phase inverse nano-LC (Eksigent) et des peptides ont été chargés sur une phase inverse C18 colonne à un débit de 3 l / min. Une phase mobile était de 0,1% d&#39;acide formique et ACN 2% dans de l&#39;eau; phase mobile B était de 0,1% d&#39;acide formique et 20% d&#39;eau dans l&#39;ACN. Les peptides ont été élues de la colonne à un débit de 220 nl / min en utilisant un gradient linéaire de 5% de B à B 50% plus de 90 min, puis à B 95% en 5 min, et enfin maintenir constante B de 95% pendant 5 min . Les spectres ont été acquis en dépendant des données avec le mode d&#39;Orbi-piège utilisé pour les analyses MS et LTQ pour MS / MS scans. Les peptides ont été identifiés par une recherche des spectres avec la base des rats IPI v.3.53 en utilisant l&#39;algorithme SEQUEST intégrée dans le logiciel Bioworks. Chaque peptide a rencontré les critères suivants: XCorr ≥ 2 (1), ≥ 3 (2), ≥ 4 (3), et DeltaCN&gt; 0,1. Tous les spectres utilisés pour l&#39;identification des protéines étaient contrôlées manuellement et aucune protéines acceptées lorsque moins de deux peptides ont été identifiés. Seuls les protéines présentes après chacune des quatre menus déroulants et P2X2 absent pendant menus déroulants TPS-nulle ont été considérés pour d&#39;autres analyses. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentation schématique d&#39;une sous-unité du récepteur P2X2. A. La caricature illustre la topologie d&#39;un sous-unité du récepteur P2X2. Le domaine cytosolique constitué de N et C terminales. Le C-terminale de récepteurs P2X2 (rouge) a été utilisé comme appât pour tirer vers le bas dosage. Séquence d&#39;acides aminés B. du récepteur P2X2 C-terminale utilisée dans cette étude. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> Figure 2. Diagramme et la ligne de temps du protocole utilisé pour l&#39;expression, la purification, déroulez et l&#39;identification des protéines. Nous montrons le contour du protocole avec la ligne du temps. Lysat cerveau adulte de rat a été fraîchement préparés immédiatement avant l&#39;utilisation pour la tirer vers le bas dosages. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> Figure 3. Représentation schématique de l&#39;analyse protéomique des binaires P2X2 C-terminale du réseau dans le cerveau du rat. Le C-terminale de récepteurs P2X2 fusionné avec la protéine liée à la TPS perles TPS a été utilisée pour tirer vers le bas dosages. Cerveau lysat a été préparé et les protéines ont été incubées avec les protéines recombinantes immobilisées. Fraction libre est lavée avec le tampon de lyse. Les protéines ont été identifiées par spectrométrie de masse. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> Figure 4. Identification des partenaires de liaison de l&#39;extrémité C-terminale P2X2 récepteurs. Sypro gel coloré montrant un spectre de protéines putatives qui interagissent avec le C-terminale des récepteurs fusionné avec TPS (boîte bleue). Contrôles voies pour la TPS seulement (boîte jaune) et le glutathion billes de sépharose seuls sont également représentées. Les flèches indiquent des exemples de bandes uniques qui ont été excisées pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion channels of excitable membranes. , (2001).</li><li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses.">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li><li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses.">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li><li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels.">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease.">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li><li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding.">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li><li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+P2X+receptors.">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li><li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits..">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits..</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li><li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shape,+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy.">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li><li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription/translation-related+proteins:+complimentary+separation+techniques+with+LC/MS/MS.">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li><li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors.">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li></ol>

Les canaux ioniques sont une classe importante de protéines membranaires intégrales. Ils contiennent des pores remplis d&#39;eau que de manière sélective permettre la circulation des ions bas leurs gradients électrochimiques travers la membrane plasmique. Canaux ioniques porte entre ouverte et les états fermé. L&#39;étape de déclenchement est déclenché par les émetteurs (par exemple l&#39;ATP) en cas de canaux ioniques ligand P2X gated, ou il peut être régulé par des interactions avec d&#39;autres protéi...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>Reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>9829-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0156</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ampicillin</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1507-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>09830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulphate (APS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3678</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine Triphosphate (ATP)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bradford reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>500-0006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>B-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Commassie blue R-250</td>
<td>Reagent</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>Sc-24972</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotritol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>3860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR</td>
<td>VW1474-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E8145</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>11670-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-5132-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>15502</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iodoacetamide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luria-Bertani (LB) Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>1.00547.5007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>62971</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Sulphate (MgSO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Flouride (NaF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P40</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>74385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor tablet</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein standard </td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>161-0305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sarkosyl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros</td>
<td>61207</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screw top vial</td>
<td>Tool</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5182-0866</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYPRO&#174; Ruby protein gel stain</td>
<td>Reagent</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>170-3125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Promega</td>
<td>V5111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5927</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>Reagent</td>
<td>Burdick&Jackson</td>
<td>365-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nano Liquid Chromatography System</td>
<td>Tool</td>
<td>Eksigent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-Mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

proteomics to identify proteins interacting with p2x2 ligand-gated cation channels

Canaux ioniques ligand-dépendants sous-tendent la communication synaptique dans le système nerveux 1. Chez les mammifères, il existe trois familles de canaux ligand-dépendants: la boucle Cys, le glutamate-dépendants et les canaux récepteurs P2X 2. Dans chaque cas de liaison de l&#39;émetteur conduit à l&#39;ouverture d&#39;un pore à travers lequel les ions couler leurs gradients électrochimiques. Beaucoup de canaux ligand-dépendants sont aussi perméables aux ions calcium 3, 4, qui ont des rôles de signalisation en aval 5 (régulation des gènes par exemple) qui peut dépasser la durée d&#39;ouverture des canaux. Ainsi canaux ligand-dépendants peuvent signal sur des échelles de temps allant de larges quelques millisecondes à quelques jours. Compte tenu de ces rôles importants, il est nécessaire de comprendre comment ligand-mêmes canaux ioniques sont régulés par des protéines, et comment ces protéines peuvent syntoniser la signalisation. Des études récentes suggèrent que beaucoup, sinon toutes, les chaînes peuvent faire partie des complexes de protéines de signalisation 6. Dans cet article, nous expliquons comment identifier les protéines qui se lient à des aspects C-terminale du domaine P2X2 récepteur cytosolique. Récepteurs P2X sont des canaux cationiques ATP-dépendants et se compose de sept sous-unités (P2X1-P2X7). Récepteurs P2X sont largement exprimés dans le cerveau, où ils servent de médiateurs excitateurs transmission synaptique et la facilitation présynaptique de libération des neurotransmetteurs 7. Récepteurs P2X sont trouvés dans les cellules excitables et non excitables et arbitrer un rôle clé dans la signalisation neuronale, l&#39;inflammation et la fonction cardiovasculaire 8. P2X2 récepteurs sont abondants dans le système nerveux 9 et font l&#39;objet de cette étude. Chaque sous-unité P2X est censé posséder deux segments transmembranaires (TM1 et TM2) séparés par une région extracellulaire et intracellulaire 7 N et C terminales (figure 1a) 7. Sous-unités P2X 10 (P2X1-P2X7) montrent une homologie de séquence de 30-50% au niveau des acides aminés 11. Récepteurs P2X contenir que trois sous-unités, qui est la plus simple parmi les récepteurs ionotropiques stoechiométrie. Le P2X2 C-terminale composée de 120 acides aminés (Fig 1b) et contient plusieurs sites d&#39;accueil pour des protéines de consensus, soutenant l&#39;hypothèse que des récepteurs P2X2 peut-être partie des complexes de signalisation. Cependant, bien que plusieurs fonctions ont été attribuées à l&#39;extrémité C-terminale des récepteurs P2X2 9 aucune étude n&#39;a décrit les partenaires moléculaires qui se couplent à la face intracellulaire de cette protéine par l&#39;intermédiaire de la longueur totale C-terminale. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d&#39;une approche protéomique pour identifier les protéines qui interagissent avec la pleine longueur C-terminale de P2X2 récepteurs.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels at JoVE.com

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Nous décrivons un protocole simple pour identifier les protéines du cerveau qui se lient à l&#39;extrémité C-terminale pleine longueur de l&#39;ATP-dépendants P2X2 récepteurs. L&#39;extension et l&#39;application systématique de cette approche à tous les récepteurs P2X devrait conduire à une meilleure compréhension de la signalisation des récepteurs P2X.

Protéomique pour identifier les protéines interagissant avec P2X2 canaux cationiques ligand-dépendants

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

proteomics-to-identify-proteins-interacting-with-p2x2-ligand-gated

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K vues.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. Nous décrivons un protocole simple pour identifier les protéines du cerveau qui se lient à l'extrémité C-terminale pleine longueur de l'ATP-dépendants P2X2 récepteurs. L'extension et l'application systématique de cette approche à tous les récepteurs P2X devrait conduire à une meilleure compréhension de la signalisation des récepteurs P2X.

Vidéo: Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Recherche

Biologie

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and motif position preference1. Each component algorithm is optimized to find a different kind of motif. By taking the best of these three approaches, SCOPE performs better than any single algorithm, even in the presence of noisy data1. In this article, we utilize a web version of SCOPE2 to examine genes that are involved in telomere maintenance. SCOPE has been incorporated into at least two other motif finding programs3,4 and has been used in other studies5-8. 
The three algorithms that comprise SCOPE are BEAM9, which finds non-degenerate motifs (ACCGGT), PRISM10, which finds degenerate motifs (ASCGWT), and SPACER11, which finds longer bipartite motifs (ACCnnnnnnnnGGT). These three algorithms have been optimized to find their corresponding type of motif. Together, they allow SCOPE to perform extremely well.
Once a gene set has been analyzed and candidate motifs identified, SCOPE can look for other genes that contain the motif which, when added to the original set, will improve the motif score. This can occur through over-representation or motif position preference. Working with partial gene sets that have biologically verified transcription factor binding sites, SCOPE was able to identify most of the rest of the genes also regulated by the given transcription factor.
Output from SCOPE shows candidate motifs, their significance, and other information both as a table and as a graphical motif map. FAQs and video tutorials are available at the SCOPE web site which also includes a "Sample Search" button that allows the user to perform a trial run. 
Scope has a very friendly user interface that enables novice users to access the algorithm's full power without having to become an expert in the bioinformatics of motif finding. As input, SCOPE can take a list of genes, or FASTA sequences. These can be entered in browser text fields, or read from a file. The output from SCOPE contains a list of all identified motifs with their scores, number of occurrences, fraction of genes containing the motif, and the algorithm used to identify the motif. For each motif, result details include a consensus representation of the motif, a sequence logo, a position weight matrix, and a list of instances for every motif occurrence (with exact positions and "strand" indicated). Results are returned in a browser window and also optionally by email. Previous papers describe the SCOPE algorithms in detail1,2,9-11.

A straight-forward and robust method to identify potential regulatory motifs in co-regulated genes is presented. SCOPE does not require any user parameters and returns motifs that represent excellent candidates for regulatory signals. The identification of such regulatory signals helps to understand the underlying biology.

Aide de la portée d&#39;identifier le potentiel Motifs de la réglementation dans les gènes co-régulés

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

Mise à jour de levure-système à deux hybrides pour identifier les protéines qui interagissent avec le facteur de croissance progranuline

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Inverser levure système à deux hybrides pour identifier les mammifères Nuclear Receptor résidus qui interagissent avec des ligands et / ou antagonistes

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that transduce the mechanical energy of sound into an electro-chemical energy processed by the peripheral and central nervous systems. Several proteomic techniques have been developed to study the cochlear inner ear, such as two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), antibody microarray, and mass spectrometry (MS). MS is the most comprehensive and versatile tool in proteomics and in conjunction with separation methods can provide an in-depth proteome of biological samples. Separation methods combined with MS has the ability to enrich protein samples, detect low molecular weight and hydrophobic proteins, and identify low abundant proteins by reducing the proteome dynamic range. Different digestion strategies can be applied to whole lysate or to fractionated protein lysate to enhance peptide and protein sequence coverage. Utilization of different separation techniques, including strong cation exchange (SCX), reversed-phase (RP), and gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (GELFrEE) can be applied to reduce sample complexity prior to MS analysis for protein identification.

Proteome analysis of the cochlear sensory epithelium can be challenging due to its small size and because membrane proteins are difficult to isolate and identify. Both membrane and soluble proteins can be identified by combining multiple preparative methods and separation techniques along with high-resolution mass spectrometry.

Bottom-up et de fusil de chasse protéomique pour identifier une complète Cochlear protéome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, differentiation, and proliferation. A comprehensive characterization of these proteins provides rich information for biomarker discovery, cell-type identification, and drug-target selection, as well as helping to advance our understanding of cellular biology and physiology. Surface proteins, however, pose significant analytical challenges, because of their inherently low abundance, high hydrophobicity, and heavy post-translational modifications. Taking advantage of the prevalent glycosylation on surface proteins, we introduce here a high-throughput glycopeptide-capture approach that integrates the advantages of several existing N-glycoproteomics means. Our method can enrich the glycopeptides derived from surface proteins and remove their glycans for facile proteomics using LC-MS. The resolved N-glycoproteome comprises the information of protein identity and quantity as well as their sites of glycosylation. This method has been applied to a series of studies in areas including cancer, stem cells, and drug toxicity. The limitation of the method lies in the low abundance of surface membrane proteins, such that a relatively large quantity of samples is required for this analysis compared to studies centered on cytosolic proteins.

Cell surface proteins are biologically important and widely glycosylated. We introduce here a glycopeptide-capture approach to solubilize, enrich, and deglycosylate these proteins for facile LC-MS based proteomic analyses.

Glycopeptides Capture pour protéomique de surface cellulaire

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.