Les récepteurs P2X7 sont extrêmement polyvalents et fonctionnent différemment selon la quantité d’agonistes présents. De cette façon, P2X7 a des fonctions différentes et peut réguler la physiologie de nombreux systèmes différents. Ce protocole permet d’étude des trois fonctions principales du récepteur P2X7.
Il s’agit d’une méthode rapide, reproductible et quantifiable pour comprendre sa fonction. Nous nous concentrons sur la façon dont les récepteurs P2X7 peuvent moduler dans les cellules progénitrices neurales. Toutefois, cette méthode peut être facilement adaptée à n’importe quel type de cellule.
Les étudiants qui ont lu suffisamment de littérature avant d’essayer cette procédure peuvent apprendre qu’en une seule journée et être en mesure de courir tout seul après deux ou trois essais. Commencez cette procédure en obtenant des cellules progénitrices neurales de la zone sous-ventriculaire et de l’hippocampe de souris adultes comme décrit dans le protocole de texte. Maintenir les cultures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.
Les neurosphères devraient se former après sept à dix jours est le passage zéro culture de zone subventriculaire et après 15 à 20 jours dans la culture hippocampale. Après la phase initiale de passage zéro culture, passer tous les sept à dix jours au besoin à l’aide d’un cabinet de sécurité biologique et de pratiques standard de culture tissulaire. Passer les sphères quand elles atteignent 150 à 200 microns de diamètre.
Recueillir les sphères et le milieu dans un tube de 15 millilitres et tourner à basse vitesse pendant deux minutes. Retirer le milieu et incuber les cellules avec le réaccente de dissociation pendant sept à 10 minutes à 37 degrés Celsius selon la taille des sphères. Enfin, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatiques.
Nous suspendons les cellules individuelles dans un millilitre de milieu de sodium sans calcium. Chargez ensuite les cellules avec deux ninigrammes par millilitre de colorant indicateur de calcium et 10 microlitres d’acide pluronique à 5 %. Incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Lavez les cellules en ajoutant de trois à cinq millilitres de sodium sans calcium moyen et en centrifugant doucement. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau les cellules dans un milieu de sodium sans calcium, en le lavant une deuxième fois. Suspendre à nouveau les cellules dans un millilitre de milieu de sodium sans calcium.
Placez ensuite les cellules sur la glace et laissez-les se désestérifier pendant 30 minutes. Lavez les cellules une fois de plus en ajoutant trois à cinq millilitres de potassium moyen et centrifugeuse comme avant. Après avoir re-suspendre les cellules dans le milieu de potassium, les élit dans le tri cellulaire activé par fluorescence ou tubes FACS à une concentration d’un million de cellules par 500 microlitres par tube FACS.
Placez les tubes FACS sur la glace jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être analysées. Ne laissez pas les cellules sur la glace pendant une période prolongée, mais commencez l’analyse dès que possible. Pour certains échantillons, pré-incubation des cellules avec inhibiteur spécifique aux récepteurs P2X7 tel que décrit dans le protocole texte.
Quelques minutes avant de faire fonctionner le premier échantillon, ajouter le chlorure de calcium à une concentration finale d’un millimolaire et placer le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pour récupérer. Déposez un petit agitateur magnétique propre dans le tube FACS et placez le tube dans le module de temps qui est relié à un bain d’eau circulant à 37 degrés Celsius pour contrôler la température de l’échantillon. Sélectionnez une faible vitesse d’agitation pour assurer le mouvement de l’échantillon sans introduire d’effet vortex.
Placez la cruche d’eau et l’adaptateur de tube sur la plate-forme d’échantillon et fermez le bras de levier de la machine facs. Lancez l’acquisition de l’échantillon et exécutez l’échantillon pendant trois minutes à environ 1000 événements par seconde. À la marque de 40 secondes, retirez rapidement le tube et ajoutez l’agoniste P2X7.
Soit un millimolar ATP ou 300 micromolar BzATP. Remplacez ensuite le tube pour poursuivre l’acquisition. Pendant que le premier échantillon enregistre, préparez le deuxième échantillon avec du chlorure de calcium.
Placez-le dans 37 degrés Celsius pour laisser suffisamment de temps pour que les cellules se réchauffent avant l’analyse. Une fois le premier échantillon terminé, nettoyez la prise en faisant fonctionner un échantillon d’eau. Ensuite, l’acquisition du deuxième échantillon peut commencer comme avant.
Nettoyez toujours l’apport entre les échantillons. Créez une suspension à cellule unique comme avant et économisez quelques millilitres du milieu conditionné. Utilisez le milieu pour re-suspendre les cellules à une concentration d’un million de cellules par 100 microlitres par tube FACS et placer les cellules sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes.
Avant d’exécuter l’essai, ajouter 900 microlitres de potassium moyen pour un volume final d’un millilitre. Placez les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour récupérer. Le cas échéant, pré-incubation des cellules avec des traitements, y compris les inhibiteurs spécifiques au P2X7.
Immédiatement avant d’exécuter l’essai, ajouter 25 bromure d’éthidium micromolaire au tube FACS. Ajouter ensuite l’agitateur magnétique, placer le tube sur la machine FACS et commencer l’acquisition comme avant. Pour induire la formation de pores dans la membrane cellulaire, ajouter un millimolaire ATP ou 100 micromolaire BzATP 40 secondes après le début de l’acquisition.
Exécutez les échantillons à environ 1000 événements par seconde pendant six minutes. Pendant que le premier échantillon est en cours d’exécution, prenez le deuxième échantillon de la glace et placez-le dans le bain d’eau de 37 degrés Celsius pour laisser suffisamment de temps aux cellules pour récupérer avant l’analyse. Une fois la première acquisition de l’échantillon terminée et l’admission nettoyée, le deuxième échantillon peut être placé sur la machine pour commencer l’enregistrement.
Nous suspendons les cellules individuelles dans un milieu conditionné et les élit dans des tubes FACS à une concentration d’au moins un million de cellules par 100 microlitres par tube FACS. Diluer les cellules à une concentration finale d’un million de cellules par millilitre avec un milieu de sodium et placer les cellules sur la glace jusqu’à ce que l’analyse soit effectuée. Utilisez un micron large G-perles comme cibles phagocytiques pour les analyses phagocytosis en temps réel.
Avant d’exécuter le premier échantillon, transférez les cellules dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius et incubez-les pendant environ sept à dix minutes pour permettre aux cellules de se rétablir. Ajouter tous les traitements nécessitant une pré-incubation à leurs tubes respectifs, y compris l’ATP, l’ATP oxydé, la cytokelisine D et 4% le paraformaldéhyde. Aucune pré-incubation n’est nécessaire pour 5% sérum humain.
Si des traitements sont ajoutés à peu près en même temps, les échantillons peuvent être exécutés consécutivement tandis que d’autres continuent d’incuber parce que leurs temps d’incubation varient. Placez l’échantillon sur le cytomètre avec l’agitateur magnétique et lancez l’acquisition de l’échantillon comme avant. Retirez le tube d’échantillon de la machine 15 à 20 secondes après le début de l’acquisition et ajoutez cinq microlitres de perles YG non diluées.
Retournez le tube FACS de l’échantillon à l’instrument et poursuivez l’acquisition. Exécutez les échantillons pendant sept à huit minutes à environ 1000 événements par seconde. Pendant que le premier échantillon est en cours d’exécution, prenez le deuxième échantillon de la glace et placez-le dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pour laisser suffisamment de temps aux cellules pour récupérer avant l’analyse.
Une fois le premier échantillon terminé et l’admission nettoyée, commencez l’acquisition sur le deuxième échantillon. Une fois tracé au fil du temps, l’afflux de calcium était généralement semblable dans les cellules progénitrices neurales de zone hippocampale et sous-ventriculaire. Les agonistes ont été ajoutés à la 42e marque.
BzATP active rapidement les récepteurs P2X7, ouvrant le canal iion et permettant l’afflux de calcium qui se lie au fluo-8 et aux fluoresces. L’application d’ATP a généralement comme conséquence un afflux plus graduel de calcium. Il a une affinité plus faible avec P2X7 par rapport à BzATP et se traduira également par l’activation des récepteurs couplés aux protéines G.
Après l’application de l’ATP et du BzATP de l’agoniste, la cytométrie de flux de résolution du temps capture le bromure d’éthidium entrant dans les cellules par des pores transmembranes en temps réel. Cet effet a été atténué par l’inhibiteur P2X7-spécifique. Les analyses de réponse de concentration d’ATP illustrent les effets de la concentration agoniste sur la formation de pore de P2X7 utilisant le changement dans la fluorescence de bromure d’éthidium au fil du temps.
Ici, la phagocytose p2X7 impliquant des récepteurs par des cellules progénitrices neuronales de zone hippocampale et sous-ventriculaire est montrée en temps réel. Des niveaux décomplexés de phagocytose des perles de latex de YG ont été établis comme contrôle positif. L’ATP a inhibé la phagocytose des perles de YG dans la même mesure que les inhibiteurs non spécifiques, à savoir la fixation de paraformaldéhyde et l’inhibiteur de polymérisation d’actin cytokelisine D.5%sérum a aboli toute phagocytose innée.
Le maintien d’une population cellulaire saine et la réduction du temps passé sur la glace sont essentiels pour obtenir des résultats reproductibles. La variabilité peut être minimisée en utilisant le même lot d’ATP pour l’analyse complète de la cellule. Notre résultat expiré de la cytométrie de flux démontré ici est le seul message qui peut continuer à sélectionner des quantités pour les flux et les changements dans une sous-population ciblée.
La méthode alternative est un microscope fluorescent et un lecteur fluorescent de plateau. Toutefois, cette méthode ne peut pas mesurer continuellement les changements fluorescents en raison du programme d’affinité fluorescente. P2X7 est unique multimodal.
La découverte de son expression sur une cellule d’intérêt ouvre une série de questions uniques à explorer pour les chercheurs.
