Les auteurs tiennent à remercier l&#39;Università degli Studi di Milano pour le soutien aux Eliana Di Cairano (post-doctorat) et Stefania Moretti (Ph.D. bourse). Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche de l&#39;Université PUR CP Nous tenons à remercier le professeur Jeremy M. Henley, École de biochimie, Université de Bristol, Royaume-Uni, pour la pHluorin construire et le Dr Francesco Dotti d&#39;assistance dans l&#39;analyse de données, et Silvia Marsicano pour l&#39;assistance technique.

1. Culture cellulaire et transfection <ol><li> Culture de cellules SH-SY5Y REMARQUE: Les expériences ont été effectuées en utilisant le neuroblastome humain SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y grandir comme un mélange de grappes flottantes et les cellules adhérentes. Suivez les instructions figurant dans le protocole (de densité cellulaire, rapport de division, etc.) D&#39;avoir des cellules qui se développent fermement attachés à couvercle en verre, qui est crucial pour TIRFM. <ol><li> Avant de commencer, sous le poste de sécurité microbiologique à flux laminaire, de porter le volume opportun de solution de phosphate stérile de solution saline tamponnée (PBS) et un milieu de culture. <ol><li> Ajouter 50 ml de PBS à la concentration de 150 mM de NaCl, 24 mM de tampon phosphate, pH 7,4. Filtrer la solution. </li><li> Ajouter 50 ml de milieu cellulaire à partir du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec haute teneur en glucose, 10% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (FBS), de la pénicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), L-glutamine ( 2 mM), etpyruvate de sodium (1 mM). Filtrer la solution. </li></ol></li><li> Éliminer le milieu de croissance complet et laver les cellules avec 3 ml de PBS. </li><li> Incuber les cellules avec 2 ml de 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (par boîte de Petri de 6 cm) pendant 5 min à 37 ° C, 5% CO 2 et détacher les cellules en utilisant une pipette. </li><li> Inactiver la trypsine en ajoutant 2 ml de DMEM, et de recueillir les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min. </li><li> Eliminer le surnageant, ajouter 1 ml de DMEM à la pastille et pipeter la solution de haut en bas suffisamment pour disperser les cellules dans une suspension cellulaire unique. </li><li> Diviser les 1: 4 dans une nouvelle boîte de diamètre de 6 cm de Pétri contenant 3 ml de milieu complet. Maintenir les cellules en culture dans des boîtes de Pétri de diamètre 6 cm, à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Sous-culture une fois par semaine ou quand ils ont couvert 80 - 90% de la superficie de la surface. </li></ol></li><li> SH-SY5Y placage pour l&#39;imagerie de cellules <ol><li> Pour les expériences de TIRFM, plaquecellules sur les couvercles de verre. Employer verre couvre de 0,17 ± 0,005 mm d&#39;épaisseur et un indice de réfraction 1,5255 ± 0,00015. Avant de commencer, préparer les lamelles de verre comme suit: <ol><li> Nettoyez le verre couvre de 90% d&#39;éthanol, O / N. </li><li> Rincez-les soigneusement à l&#39;eau distillée (trois changements d&#39;eau distillée). Verre couvre sec dans un four de séchage. </li><li> Lieu couvre en verre boîtes de Pétri et stériliser dans un four préchauffé à 200 ° C pendant 3 heures. </li></ol></li><li> Le jour avant la transfection, placer chaque lamelle dans un plat 3,5 cm Petri, ajouter 1 ml de milieu de culture et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 de 5%. </li><li> Trypsiniser cellules comme décrit dans les étapes 1.1.3 - 1.1.5, suspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu complet et compter. Calculer le volume correct de la suspension cellulaire à ajouter à chaque boîte de Petri pour obtenir 3 x 10 5 cellules / puits. Cette densité est nécessaire pour une croissance cellulaire optimale et une transfection efficace. Incuber à 37 ° Cen 5% de CO 2 incubateur O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection par polyéthylènimine (PEI) REMARQUE: Pour visualiser les vésicules synaptiques dynamique, vecteur pCB6 contenant synapto-pHluorin a été utilisé. Le synapto-pHluorin a été générée par fusion dans le cadre d&#39;une variante sensible au pH de la protéine fluorescente verte (GFP) 16 et la protéine de membrane vésiculaire synaptobrévine 2. La construction a été largement utilisé pour étudier les propriétés des vésicules synaptiques dans les neurones 9. <ol><li> Avant de commencer la transfection, faire 10 ml des solutions suivantes. Conserver les solutions que maximale que 1 mois. <ol><li> Faire une solution 150 mM de NaCl. Ajuster le pH à 5,5 avec du HCl 0,01. </li><li> Faire une solution de PEI à 10% de polyéthylènimine (PEI; 25 kDa linéaire) en solution 150 mM de NaCl. Le pH de la solution se élève à 8,8. Ajuster le pH à 7,8 avec du HCl 0,01. </li></ol></li><li> 24 heures après l&#39;étalement, éliminer le milieu et rafraîchir avec 1,5 ml demilieu complet. Maintenir les cellules à 37 ° C, dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Sous l&#39;enceinte de sécurité biologique à flux laminaire, dans un tube à microcentrifugation de 1,5 ml, ajouter 3 pg d&#39;ADN de plasmide à 25 ul d&#39;une solution 150 mM de NaCl et 100 ul de solution de PEI 3,5 cm par boîte de Pétri. </li><li> Vortex pendant 10 secondes, puis incuber le mélange ADN / PEI pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Ajouter délicatement le mélange ADN / PEI à la boîte de Petri contenant des lamelles avec des cellules et secouez doucement pour répartir équitablement le réactif dans la boîte de Pétri. </li><li> Après 4 h changer le milieu et on incube les cellules O / N à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Réaliser des expériences d&#39;imagerie 24-48 heures après transfection. </li></ol></li></ol> 2. imagerie cellulaire par réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) <ol><li> Imagerie set-up <ol><li> Effectuer imagerie de la FRBR avec le set-up décrit à la figure 1. Il comprend un moteur inversémicroscope (Figure 1, encart A), la source laser (figure 1, encadré B) et la TIRF-coulisseau (Figure 1, encart C). Atteindre l&#39;illumination TIRFM à travers une ouverture numérique élevée (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar) d&#39;huile 100X, objectif à immersion. </li><li> Pour l&#39;éclairage de TIRFM, employer un multi-ligne (458/488/514 nm) 100 mW laser argon-ion. Utilisation d&#39;une fibre en mode mono, introduire la lumière laser polarisée linéairement dans le trajet du faisceau, par l&#39;intermédiaire du coulisseau TIRF. Insérez le curseur TIRF dans le plan de la membrane champ lumineux de la trajectoire du faisceau de lumière réfléchie. <ol><li> Pour l&#39;éclairage à grand champ, connectez le microscope à un HBO lumière blanche de la lampe au mercure à court d&#39;arc classique. Un double prisme à maintien de polarisation dans le coulisseau assure la combinaison simultanée de TIRF illumination et la lumière blanche. </li></ol></li><li> On filtre la lumière laser avec un filtre d&#39;excitation (largeur bande de 488/10 nm) monté sur une roue de filtre, introduit dans le trajet du laser. Employerune vitesse élevée, l&#39;obturateur commandé par logiciel, afin de permettre un contrôle rapide de l&#39;illumination laser. Pour l&#39;analyse pHluorin, monter un passe-bande 525/50 nm filtre d&#39;émission. Capturez des images numériques (512 x 512 pixels) sur une caméra CCD rapide refroidi avec l&#39;image ProPlus logiciel. </li></ol></li><li> La réalisation de l&#39;éclairage de la FRBR (Figure 2) <ol><li> Tourner sur les lasers, l&#39;ordinateur, l&#39;appareil photo, la roue de filtre, et les contrôleurs d&#39;obturation; puis, attendez 20 minutes avant de commencer l&#39;expérience que les lasers ont besoin pour se réchauffer et se stabiliser. </li><li> Avant imagerie, rendre le volume opportun des solutions suivantes. <ol><li> Ajouter 50 ml de Krebs (KRH) solution à 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 25 mM de l&#39;acide 4- (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) (tamponnée à pH 7,4), 2 mM de CaCl2 et 6 mM de glucose. </li><li> Ajouter 10 ml de solution KRH-KCl (pH 7,4) à 80 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 25 mM de HEPES (tamponnée à pH 7,4), 2 mM de CaCl2 et 6 mM de glucose. </li></ol></li><li> Retirer le couvercle en verre avec des cellules transfectées et l&#39;insérer dans la chambre d&#39;imagerie approprié. Monter la chambre et ajouter 500 ul de solution KRH dans le centre de la vitre. </li><li> Ajouter l&#39;huile sur l&#39;objectif. Placer la chambre d&#39;imagerie sur la platine du microscope et la position de l&#39;objectif sous la lamelle couvre-objet en verre. Positionner le couvercle sécuritaire sur l&#39;échantillon. </li><li> En mode épifluorescence, se concentrer sur la lamelle (surface supérieure) et choisissez cellules transfectées placés dans le centre de la chambre. Sélectionnez les cellules dont le signal fluorescent peut être clairement enregistrée en utilisant un temps d&#39;exposition inférieure à 80 ms. </li><li> Sous le contrôle du logiciel, passer à l&#39;éclairage FRBR en mode direct. </li><li> Pour définir la configuration de la FRBR, vérifier la position de la poutre qui émerge de l&#39;objectif, sur la couverture de l&#39;échantillon (figure 2B). Lorsque le faisceau est positionné dans le centre de til objectif (figure 2A, à gauche), un endroit est visible au centre de la couverture de l&#39;échantillon de la FRBR (figure 2B, à gauche) et la cellule est imagé en mode épifluorescence (plusieurs avions de discussion, une forte fluorescence de fond; la figure 2C, gauche) . </li><li> Pour atteindre l&#39;angle critique, déplacer le point focalisé dans la direction Y (avant ou arrière; Figure 2B, centre) en utilisant l&#39;angle vis de réglage sur le curseur de la FRBR (figure 1C). Lorsque le faisceau converge sur le plan de l&#39;échantillon à un angle supérieur à l&#39;angle critique (figure 2A, à droite), le spot disparaît et une droite, mince ligne axé est évident dans le milieu de la couverture de l&#39;échantillon (figure 2B, à droite). </li><li> Pour affiner l&#39;angle FRBR utiliser l&#39;échantillon de cellules (figure 2C). Regarder l&#39;image de fluorescence sur la vidéo, à ce stade, une image à épifluorescence-like est encore visible. Doucement, déplacer la vis jusqu&#39;à la FRBR concondition est atteint: un seul plan optique de la cellule est au point (ce est à dire, la membrane plasmique en contact avec la lamelle), il en résulte une image plate avec un contraste élevé (figure 2C, à droite). </li></ol></li><li> imagerie de l&#39;échantillon <ol><li> Réglez l&#39;expérience time-lapse à canal unique. Pour minimiser photoblanchiment, capturer l&#39;image en utilisant à faible temps d&#39;exposition et gain élevé. Temps d&#39;exposition appropriées sont entre 40 à 80 msec. Acquérir des images à 1-2 Hz fréquence d&#39;échantillonnage. cinétique de vésicules échantillonnage peuvent être mieux appréciée à plus haute fréquence (10 Hz). Le temps d&#39;observation régulière est généralement de 2 min. </li><li> Ajouter 500 pi de cellules de solutions et d&#39;enregistrer KRH en mode TIRFM. Ce est la condition de repos. Enregistrez les images séquentielles de temps. </li><li> Concentrez-vous sur la même cellule et enregistrer dans les mêmes conditions de repos (de puissance laser, exposition de temps, le numéro de châssis). Après cinq cadres, ajouter 500 pi de solution KCl-KRH et de garder KCl dans la chambre.Ce est la condition stimulée; enregistrer les images séquentielles de temps. </li></ol></li></ol> 3. Analyse de l&#39;image et de traitement des données REMARQUE: Pour analyser les images, les macros ont été développées dans le laboratoire, basée sur des fonctions existantes du logiciel d&#39;analyse d&#39;image; macros similaires sont disponibles en ligne (URL fournie dans le tableau des matériaux et équipements). <ol><li> quantification de l&#39;intensité de fluorescence <ol><li> Utiliser une macro &quot;Séquence d&#39;intensité de fluorescence&quot; pour la quantification de l&#39;intensité de fluorescence dans une région d&#39;intérêt (ROI) de l&#39;image, au cours de la séquence. </li><li> Ouvrir les images séquentielles dans le temps. Allez dans le menu macro et sélectionnez «Séquence intensité de fluorescence. Dans la fenêtre &quot;Analyse de apparaît&quot; sélectionner le ROI &quot;. </li><li> Choisissez l&#39;un des outils de sélection dans le menu pour créer le ROI. Placez 3 Rois dans les régions de la membrane cellulaire sans taches (fond ROI). Employer this &quot;background ROI&quot; pour évaluer le photoblanchiment et de fixer le seuil pour l&#39;analyse des événements de fusion (figure 3A). </li></ol></li><li> Photobleaching correction et la détermination de seuil (figure 3B) <ol><li> Pour évaluer le photoblanchiment, ouvrir les lignes de fluorescence d&#39;intensité &quot;de fond&quot;, ROI (Figure 3ba). Normaliser les valeurs d&#39;intensité de fluorescence dans chaque trame à la valeur d&#39;intensité initiale (F0) (F / F0) (figure 3Bb). La moyenne des valeurs. </li><li> Mettez en surbrillance les données moyennes et de créer un terrain de ligne en utilisant les options de menu de graphique. </li><li> Dans le menu d&#39;analyse de données, sélectionnez &quot;Trendline&quot; pour ouvrir la boîte de dialogue d&#39;analyse de la parcelle. Sélectionnez le type de régression. Réglez la régression &quot;exponentielle&quot;. Ensuite, sélectionnez &quot;équation d&#39;affichage sur le tableau&quot;. Dans la fenêtre graphique, l&#39;équation exponentielle apparaît et les valeurs des paramètres sont automatiquement attribué, (Figure 3bc </strong&gt;). </li><li> Appliquer la correction exponentielle pour les valeurs d&#39;intensité dans chaque trame comme suit: Fn (corrigé) = Fn / exp (-n * a) Fn = expérimentale intensité de fluorescence mesurée à la trame n; n = le nombre de trames; a = facteur de blanchiment (constante exprimant le taux de perte d&#39;intensité en raison de photoblanchiment; &#160; Figure 3BD). </li><li> Pour définir le seuil, ouvrir un &quot;background ROI&quot; normalisée et corrigée, calculer le signal de fluorescence moyenne et son écart type (SD). La valeur moyenne plus 3 SD représente le seuil (Figure 3BE). Utilisez ce seuil pour l&#39;analyse des données. </li></ol></li><li> La sélection des événements de fusion en utilisant une procédure semi-automatique <ol><li> Ouvrir les images séquentielles dans le temps avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Application d&#39;un filtre gaussien à la séquence d&#39;image active. </li><li> Analyser les images à l&#39;aide de la fonction &quot;compter des objets&quot; ou une macro qui permet la sélectiond&#39;un objet dont les pixels ont une intensité de fluorescence moyenne dans une plage définie. Réglez l&#39;intensité gamme manuellement, en utilisant la fonction de seuil (aller à la barre de menu, réglez le seuil de mesure → pour sélectionner la zone d&#39;intérêt). Un seuil adéquat est de 30% sur le signal de fond fluorescent locale. </li><li> Appliquer une macro &quot;Filtres objets&quot; pour sélectionner uniquement les objets répondant aux critères suivants: <ol><li> Appliquer l&#39;option gammes (min et max inclus) pour l&#39;aspect. Aspect indique le rapport entre le grand axe et le petit axe de l&#39;ellipse équivalente à l&#39;objet. Aspect est toujours ≥1. Les valeurs adéquates sont min = 1, max = 3. </li><li> Appliquer gammes de diamètre. Diamètre rapporte la longueur moyenne des diamètres mesurés à intervalles de deux degrés joignant deux points de contour et passant par le centre de gravité de l&#39;objet. Définissez la plage de pixels (ou en pm, si vous utilisez un système calibré). </li><li> Définir la gamme optimale dans preliminexpériences aires: sélectionner manuellement les points d&#39;intérêt, puis de mesurer leur diamètre en utilisant la fonction de profil de la parcelle. </li></ol></li><li> Sélectionnez «objets d&#39;affichage&quot;: objets sélectionnés apparaîtront superposée à l&#39;image de TIRFM (figure 4B). </li><li> Inclure dans l&#39;analyse que les taches qui montrent une courte durée (de une à trois cadres) augmentation transitoire de l&#39;intensité de fluorescence, immédiatement suivie d&#39;une perte marquée de signaux transitoires (taches). Employer la sélection circulaire pour créer un retour sur investissement de diamètre environ une place radialement autour des vésicules / spots sélectionnés (ROI expérimental). Effectuez cette étape manuellement. </li><li> Avec les ROI sélectionné, calculer l&#39;intensité de fluorescence moyenne de chaque ROI au cours du film. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des données (figure 3C-D) <ol><li> Exporter le décours temporel de l&#39;évolution de fluorescence mesurés dans chaque &quot;ROI expérimentale» dans un tableur; (Figure 3da). Normaliser la valeur d&#39;intensité dans chaque trame à l&#39;intensité de fluorescence initiale (F / F0), (figure 3dB). </li><li> Appliquer la correction exponentielle pour les valeurs d&#39;intensité dans chaque trame comme indiqué à l&#39;étape 3.2.4 (Figure 3Dc). </li><li> Pour calculer le nombre total d&#39;événements de fusion (nombre crête), le temps que chaque fusion se produit (largeur de pic) et l&#39;amplitude du pic fluorescent (hauteur de pic et l&#39;ASC) appliquer des fonctions logiques en utilisant des tableurs ou mathématiques. Un exemple d&#39;analyse d&#39;événement de fusion en utilisant des formules logiques est rapporté dans la Figure 3DD et 3De. </li><li> Supposons que l&#39;augmentation de l&#39;intensité de fluorescence supérieure au seuil (intensité moyenne de fluorescence de fond ± 3SD) comme la fusion des vésicules à la membrane plasmique et le pic résultant comme un événement de fusion. </li><li> Calculer la largeur du pic en tant que différence entre la dernière et la première valeur x de chaque pic. Multipliez cette valeur pour 1 / (fréquence d&#39;échantillonnage). Considérez cette valeur uns Le temps de fusion des vésicules et l&#39;adhérence à la membrane plasmique vésiculaire avant ré-acidification et recyclage (Figure 3DD). </li><li> Calculer la CUA cellule entière comme une somme de valeurs sur le seuil. Considérer cette valeur comme la variation nette fluorescente pendant la durée d&#39;enregistrement en raison de la spontanée (repos) ou évoquée (stimulé) l&#39;activité synaptique. </li><li> Calculer la hauteur de pic comme la différence entre la valeur y de chaque pic maximal et le seuil. Considérer cette valeur comme indicative du type de fusion (un ou de fusion séquentielle / simultanée ou transitoire vs pleine fusion). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle.">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li><li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+deep-layer+cortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+non+bioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).</li><li>Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurements+of+activity-dependent+membrane+recycling+in+motor+nerve+terminals+of+mammalian+skeletal+muscle.">Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle.</a> Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).</li><li>Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+transmission,+vesicle+dynamics,+and+transmitter+release+machinery+at+NCAM-deficient+neuromuscular+junctions.">Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions.</a> Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).</li><li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+with+FM+dyes.">Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity.">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Wyatt, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balice-Gordon+R.J.+Heterogeneity+in+Synaptic+Vesicle+Release+at+Neuromuscular+Synapses+of+Mice+Expressing+SynaptopHluorin.">Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin.</a> J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+&#34;kiss-and-run&#34;+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy.">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13, 563-567 (2003).</li><li>Miloso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid-Induced+Neuritogenesis+of+Human+Neuroblastoma+SH-SY5Y+Cells+Is+ERK+Independent+and+PKC+Dependent.">Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent.</a> J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+Membrane+Drift+Recruits+AMPA+Receptors+to+Dendritic+Spines.">Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines.</a> J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).</li><li>Treccani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+corticosterone+rapidly+increase+the+readily+releasable+pool+of+glutamate+vesicles+in+synaptic+terminals+of+prefrontal+and+frontal+cortex.">Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex.</a> Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).</li><li>D'Amico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+density+of+the+glutamate+transporter+EAAC1+is+controlled+by+interactions+with+PDZK1+and+AP2+adaptor+complexes.">The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes.</a> Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).</li><li>Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells.">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li><li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique.">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758 (2014).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated,+neutrophic+factor-dependent,+human+neuron-like+cells.">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Cet article présente un protocole à l&#39;image et à analyser la dynamique des vésicules dans les cellules sécrétant, utilisant des vecteurs et TIRFM ADNc codé fluorescentes. Les éléments clés de l&#39;imagerie par TIRFM succès sont la sélection du modèle cellulaire et transfection de cellules avec des indicateurs optiques génétiquement codés de la libération des vésicules et le recyclage. TIRFM est idéal pour la croissance des cellules adhérentes à un couvercle de verre...

La transmission synaptique chimique entre les neurones est un mécanisme majeur de la communication dans le système nerveux. Elle se appuie sur la libération de neurotransmetteurs par un cycle dynamique de la fusion des vésicules et la récupération sur le site présynaptique. Un grand nombre de protéines impliquées dans la dynamique des vésicules ont été identifiés; Toutefois, leur contribution spécifique au phénomène reste à préciser une. Notre compréhension est en partie limitée par le fait que les tests les plus largement utilisés pour exo / endocytose ne sont pas toujours les plus appropriées. Plusieurs études relatives à la fusion des vésicules et la dynamique reposent sur des techniques électrophysiologiques. Cette technique fournit une résolution temporelle optimale et est excellent pour enquêter sur la fusion initiale des vésicules à la membrane plasmique, mais est incapable de détecter la plupart des événements moléculaires sous-jacents qui soutiennent la fonction présynaptique. La microscopie électronique, de l&#39;autre côté, fournit le meilleur morphological description de chaque étape singulière, mais l&#39;aspect dynamique de l&#39;événement ne peut pas être capturé, parce que les échantillons doivent être fixés de façon à être analysé. L&#39;avènement de nouvelles techniques d&#39;enregistrement optique 2,3, en combinaison avec les progrès de la fluorescence des sondes moléculaires développement 4-6, permet la visualisation des processus d&#39;exocytose dans les cellules vivantes, fournissant ainsi de nouveaux niveaux d&#39;information sur la structure et la fonction synaptique. Les premières études exploitées colorants dépendants de l&#39;activité styryliques (FM1-43 et colorants organiques connexes) 7,8. State-of-the-art techniques d&#39;imagerie utilisent des variantes sensibles au pH de la protéine fluorescente verte (GFP) (pHluorin) attaché à vésicules luminal protéines neuf. Ces sondes sont normalement désactivés lorsqu&#39;ils sont présents dans les vésicules en raison du faible pH luminal. Après la fusion avec la membrane plasmatique, l&#39;intérieur des vésicules est exposée à l&#39;espace extracellulaire neutre, le pH<html> brusquement augmente, soulage la trempe de protons dépend de pHluorin et le signal fluorescent apparaît rapidement. Comme la variation de pHluorin est plus rapide que l&#39;événement de fusion, en contrôlant la fluorescence augmente, la fusion des vésicules avec la membrane peut être mesurée et analysée. Étant donné que les molécules d&#39;pHluorin surface sont marqués endocytose, le signal de fluorescence retourne ensuite au niveau de base, par conséquent la même construction peut également être utilisée pour contrôler le recyclage des vésicules 9. Bien que le capteur de pH des vésicules à marquage assure uniquement la visualisation de ces vésicules qui fusionnent vraiment avec la membrane plasmique, l&#39;imagerie à résolution spatiale et temporelle élevée est nécessaire de décrire en détail les étapes intervenant dans les processus d&#39;endocytose exo /. La technique optique qui fournit la résolution spatio-temporelle est nécessaire microscopie de réflexion totale interne de fluorescence (TIRFM), une demande de 10 microscopie à fluorescence. &quot;&gt; La réflexion interne totale se produit à l&#39;interface entre le verre lamelle et l&#39;échantillon. Lorsque le trajet de la lumière atteint la lamelle de avec un angle d&#39;incidence supérieur à l&#39;angle critique, la lumière d&#39;excitation ne est pas transmise dans l&#39;échantillon, mais est complètement réfléchie. Dans ces conditions, un évanescentes formes d&#39;onde de la lumière à l&#39;interface et se propage dans le milieu avec moins de densité optique (l&#39;échantillon). Comme l&#39;intensité du champ évanescent décroît exponentiellement avec la distance de l&#39;interface (avec une profondeur de pénétration environ 100 nm) que les fluorophores à proximité la plus proche de la lamelle couvre-objet peut être excité, tandis que ceux plus éloignés de la limite sont pas. Dans les cellules transfectées avec GFP-assemblage, cette profondeur correspond à des protéines exprimés sur la membrane plasmique ou dans des structures vésiculaires approcher. Comme fluorophores dans l&#39;intérieur de la cellule ne peuvent pas être excités, la fluorescence de fond est minimisée, et une image avec un signal très élevé / fond ratio est formée 11. Plusieurs caractéristiques font TIRFM la technique de choix pour la surveillance de la dynamique des vésicules. Le contraste parfait et le rapport signal-bruit ratio élevé permettent la détection de très faibles signaux découlant de vésicules simples. acquisition d&#39;image à base de puce dans chaque trame fournit la résolution temporelle nécessaire pour détecter des processus hautement dynamiques. Enfin, l&#39;exposition minimal de cellules à la lumière à tout autre plan dans l&#39;échantillon réduit fortement phototoxicité et permet l&#39;enregistrement longue durée time-lapse 12. L&#39;analyse des données reste l&#39;aspect le plus difficile et crucial de cette technique. La façon la plus simple de contrôler la fusion des vésicules est de mesurer l&#39;accumulation de protéines fluorescentes reporter à la surface de la cellule, au fil du temps 13. Comme fusion augmente, le signal de fluorescence augmente ainsi nettes. Cependant, cette méthode peut sous-estimer le processus, en particulier dans les grandes cellules et dans des conditions de repos,parce que les processus d&#39;endocytose et photoblanchiment compensé l&#39;augmentation de l&#39;intensité de fluorescence due à la vésicule exocytose. Une autre méthode consiste à suivre chaque événement de fusion unique 14. Cette dernière méthode est très sensible et peut révéler des détails importants sur les mécanismes de fusion. Cependant, il nécessite la sélection manuelle des événements uniques, parce que les procédures à suivre complètement automatisés vésicules et d&#39;enregistrer la fluctuation de leurs signaux fluorescents sont pas toujours disponibles. L&#39;observation de la dynamique des vésicules nécessite cellules d&#39;échantillonnage à haute fréquence. Cela génère une grande quantité de données qui peuvent difficilement être analysée manuellement. La proposition de ce document est d&#39;optimiser la technique d&#39;imagerie de TIRFM de surveillance de la base et la libération de neurotransmetteurs stimulée dans la lignée de cellules de neuroblastome SH-5YSY, et de décrire, étape par étape, une procédure développée dans le laboratoire pour analyser les données, à la fois à des niveaux de cellules entières et unique vésicules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Les vésicules synaptiques libèrent des neurotransmetteurs au niveau des synapses chimiques à travers un cycle dynamique de la fusion et la récupération. Suivi de l&#39;activité synaptique en temps réel et disséquer les différentes étapes de exo-endocytose au niveau d&#39;une seule vésicule sont cruciales pour comprendre les fonctions synaptiques dans la santé et la maladie. Génétiquement codés sondes sensibles au pH visant directement les vésicules synaptiques et réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) fournissent la résolution spatio-temporelle nécessaire de suivre la dynamique de vésicules. Le champ évanescent généré par réflexion interne totale ne peut exciter des fluorophores placés dans une couche mince (&lt;150 nm) au-dessus du couvercle de verre sur lequel les cellules adhèrent, exactement là où les processus de exo-endocytose ont lieu. Les images à contraste élevé qui en résultent sont parfaitement adaptés pour des vésicules suivi et l&#39;analyse quantitative des événements de fusion. Dans ce protocole, SH-SY5Y n humainecellules euroblastoma sont proposées comme un modèle précieux pour étudier la libération de neurotransmetteurs au niveau d&#39;une seule vésicule par TIRFM, en raison de leur surface plane et la présence de vésicules dispersées. Les méthodes pour la culture de SH-SY5Y comme cellules adhérentes et pour leur transfection avec synapto-pHluorin sont fournis, ainsi que la technique pour effectuer l&#39;imagerie et TIRFM. Enfin, une stratégie visant à sélectionner, compter et analyser les événements de fusion au niveau des cellules entières et unique vésicules est présenté. Pour valider la procédure d&#39;imagerie et l&#39;analyse des données approche, la dynamique de vésicules pHluorin-marqués sont analysés en vertu de repos et stimulés (dépolarisants concentrations de potassium) conditions. Dépolarisation membranaire augmente la fréquence des événements de fusion et provoque une augmentation parallèle du signal de fluorescence nette enregistrée dans la cellule ensemble. Analyse d&#39;un seul vésicules révèle modifications de comportement fusion-événement (hauteur accrue de pointe et la largeur). Ces données suggèrent eà la dépolarisation de potassium non seulement induit une libération de neurotransmetteurs massive, mais modifie également le mécanisme de la fusion des vésicules et le recyclage. Avec la sonde fluorescente approprié, cette technique peut être utilisée dans différents systèmes cellulaires pour disséquer les mécanismes de sécrétion constitutive et stimulée.

Les procédures de la FRBR imagerie et analyse des données décrites sont conçus pour étudier la dynamique des vésicules dans les systèmes cellulaires. Cette technique peut être utilisée pour déterminer les effets de molécules de signalisation et des médicaments sur les événements de fusion et de la dynamique des vésicules 17 neurotransmetteur. Utilisation de protéines de membrane de plasma GFP étiqueté, l&#39;analyse de la TIRFM a été utilisée pour caractériser le trafic constitutive de t...

Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K vues.  Università degli Studi di Milano. This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

Vidéo: TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Recherche

Neurosciences

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

La transplantation de cellules olfactives engainantes à évaluer la récupération fonctionnelle après des nerfs périphériques blessures

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d&#39;imagerie par fluorescence

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

Essai d’imagerie quantitative in vitro pour la phagocytose des cellules mortes du neuroblastome par iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized cells use this process to execute vital body functions such as insulin secretion from &#946; cells and neurotransmitter release from chemical synapses. Owing to its physiological significance, exo-/endocytosis has been one of the most studied topics in cell biology. Many tools have been developed to study this process at the gene and protein level, because of which much is known about the protein machinery participating in this process. However, very few methods have been developed to measure membrane lipid turnover, which is the physical basis of exo-/endocytosis.
This paper introduces a class of new fluorescent lipid analogs exhibiting pH-dependent fluorescence and demonstrates their use to trace lipid recycling between the plasma membrane and the secretory vesicles. Aided by simple pH manipulations, those analogs also allow the quantification of lipid distribution across the surface and the intracellular membrane compartments, as well as the measurement of lipid turnover rate during exo-/endocytosis. These novel lipid reporters will be of great interest to various biological research fields such as cell biology and neuroscience.

This protocol presents a fluorescence imaging method that uses a class of pH-sensitive lipid fluorophores to monitor lipid membrane trafficking during cell exocytosis and the endocytosis cycle.

Mesure du renouvellement lipidique membranaire avec l’analogue lipidique fluorescent ND6 sensible au pH

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...