Les auteurs remercient le NIH (AI074224 et GM085323) et la NSF (0.712.019 0.924.699 et) de financement pour soutenir des projets dédiés à la biosynthèse hétérologue.

Le texte ci-dessous est spécifique de l&#39;antibiotique érythromycine A, mais les étapes sont généralement conçus pour être applicable à d&#39;autres produits naturels comme candidats pour la biosynthèse hétérologue. 1. Érythromycine A Transfert génétique Cluster <ol><li> Conception des amorces de PCR pour amplifier l&#39;ensemble des gènes associés à l&#39;érythromycine Un cluster dans le S. chromosome erythraea. Cette étape est spécifique à ces produits candidats naturels dont le patrimoine génétique des séquences ont été déterminées. Alternativement, les gènes nécessaires peuvent être synthétisés (par le biais de plusieurs options de fournisseur commercial) avec l&#39;avantage que les gènes nouvellement synthétisées seraient conçues pour une utilisation optimale dans le codon E. nouvelle coli hôte. Si la synthèse d&#39;ADN est poursuivi, un défi actuel est la génération gènes megasynthase qui peuvent dépasser 10 kb de longueur. Techniquement, la synthèse peut être accompli, mais il est difficile et coûteux. Il est prévu que improvem continueents dans la technologie de synthèse de gène abordera inconvénients actuels et valider davantage cette approche pour fournir du matériel génétique hétérologue. </li><li> Effectuer PCR en utilisant fraîchement préparée S. erythraea ADN génomique comme matrice. L&#39;ADN chromosomique peut être préparé à partir de cultures de S. erythraea ou de stocks congelés de la bactérie (figure 3) 25. Les réactions de PCR peuvent bénéficier de l&#39;ajout de DMSO (4 pi sur 50 pi de réactions) pour tenir compte de haute teneur en G+ C dans la cible S. gènes erythraea. Chaque gène amplifié doivent être séquencés pour confirmer que le gène complet a été récupéré et qu&#39;aucune mutation ont été introduites au cours du processus PCR. </li><li> Grâce digestion de restriction et de ligature, insérez chacune des gènes isolés dans des vecteurs d&#39;expression conçus pour E. coli (figure 3). Ce processus est amorcé par la conception de sites de restriction dans les amorces de PCR afin de permettre la digestion et ligation dans l&#39;ex appropriévecteurs Pression (un exemple a été inclus dans la figure 3). Nous avons utilisé à la fois pET21 et pET28 vecteurs. Le vecteur pET28 permet l&#39;inclusion d&#39;une séquence leader 5 &#39;qui a facilité l&#39;expression des gènes dans le cas érythromycine A. Confirmer l&#39;expression des gènes individuels par le biais de RT-PCR, analyse SDS-PAGE (avec fractions protéiques solubles) ou pratiques tests phénotypiques (figure 4). </li><li> Construire opérons sur la base de gènes exprimés avec succès à partir des plasmides d&#39;expression individuels (Figure 3). Nous avons toujours utilisé des combinaisons d&#39;enzymes de restriction compatibles cohésifs (comme Xba I et Spe I) 24 à convertir séquentiellement gènes des opérons, mais les sites de restriction choisis pour la construction opéron ne doit pas résider dans (ou doit être retiré de) l&#39;isolement séquences de gènes (un problème qui peut être évité si la synthèse de gène est utilisé). Cette étape renforce l&#39;érythromycine, 20 A gènes avant E. coli transformation. Actuellement, nous avons utilisé cette méthode pour inclure jusqu&#39;à 20 kb d&#39;ADN étranger dans un vecteur pET standard (deux gènes de ~ 10 ko chacune). En outre, nous avons utilisé cette approche pour générer opérons contenant neuf gènes. On ne sait pas exactement combien d&#39;ADN ou combien de gènes peuvent être intégrés dans pET plasmides de type, mais les mesures citées ci-dessus fournissent une référence pour les systèmes complexes comme la voie de biosynthèse érythromycine. Enfin, la norme aux étapes de ligature in vitro et des étapes ultérieures de transformation réussie de plus en plus difficile, car opéron et augmentation de la taille du plasmide. Température de ligature (12-22 ° C) et le temps (3-24 h) sont variés et électro-transformation est utilisé pour aider le processus de production finales constructions plasmidiques. </li><li> Transformer les plasmides biosynthétiques nouvellement conçus dans E. coli souche BAP1 utilisant l&#39;électro-transformation (figure 5). La procédure peut être tentée avec des plasmides introduits de façon séquentielle ou en collaborationmbination. Lors de la transformation de taille mesure ou de nombreux plasmides, nous avons utilisé traditionnellement électro-transformation (par opposition à la transformation chimique). Une fois transformé, plaque les cellules sur milieu solide LB contenant de la tetracycline (5 mg / l), la carbénicilline (100 mg / l), à la kanamycine (50 mg / l), la streptomycine (50 mg / l), et apramycine (50 mg / l ) pour sélectionner une opération de maintenance plasmide. Il est très inhabituel pour utiliser six choix différent des antibiotiques après la transformation d&#39;un E. cellule coli, mais cela reflète simplement le nombre total de plasmides nécessaires pour permettre à l&#39;érythromycine finale A biosynthèse. Bien que possible, l&#39;approche va limiter les capacités de production du composé fois la culture a commencé (s&#39;il vous plaît voir ci-dessous). </li></ol> 2. E. Reconstitution biosynthétique coli <ol><li> BAP1 souche a été conçu pour fournir les substrats nécessaires pour la biosynthèse et de post-traductionnelle modifier le megasynthase B désoxyérythronolide. Les gènes individuels du erythromycin Une voie ont été testés pour l&#39;expression des gènes et consolidée à compter opérons dans des plasmides d&#39;expression. Cette section est consacrée aux conditions de culture pour tester l&#39;activité concertée de l&#39;érythromycine A pleine voie. </li><li> Prendre 3 colonies séparées de la BAP1 fraîchement transformé et inoculer 1,5 ml des cultures LB contenant les antibiotiques nécessaires sélection plasmidiques (aux mêmes concentrations indiquées ci-dessus pour sélectionner les transformants sur milieu solide), isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 100 uM ) et de l&#39;arabinose (2 mg / ml) pour induire l&#39;expression des gènes, et le propionate de sodium 20 mM à soutenir la formation intracellulaire précurseur biosynthétique. Une fois que la production a été confirmée, les grandes cultures peuvent être menées dans le but d&#39;intensifier et d&#39;optimiser titres pour ce produit. </li><li> Culture des cellules à 22 ° C et 250 rpm pendant 24-48 heures. Dans ce cas, le choix des antibiotiques en sorte que les plasmides requis sont maintenus dans les premiers stades de la culture cellulaire. Cependant, un plasmides peut être facilement perdu dans des niveaux de sélection antibiotique changer au cours de la période de culture. Cela peut conduire à une instabilité plasmidique (c.-à-la perte d&#39;un ou plusieurs plasmides lors de la culture), qui serait alors de limiter la capacité de production. Le problème est exacerbé lorsque les plasmides incompatibles sont utilisés pour mettre en place un groupe de gènes hétérologues complète. Tel est le cas pour l&#39;érythromycine A composé (Figure 5) et devrait être remédié à surproduire vraiment le composé de E. coli. Cependant, dans le but de démontrer la production initiale, ces défauts de conception sont tolérés pour des raisons de célérité établir la faisabilité de l&#39;approche hétérologue. </li><li> Clarifier les cultures par centrifugation à 10000 rpm dans une centrifugeuse Eppendorf. Enlever le surnageant et conserver à 4 ° C pour analyse. </li><li> Dans le cas de l&#39;érythromycine A, le manque de production composé a été adressée par l&#39;inclusion de la chaperonine GroES / EL (en utilisant pGro7spécifiquement pour traiter le manque d&#39;activité des enzymes de la post-expression) et l&#39;inclusion de copies de gènes supplémentaires (pour les gènes soupçonnés de faible expression / activité). Des stratégies similaires peuvent être nécessaires avec d&#39;autres hétérologues naturelles efforts de production des produits. </li></ol> 3. Analyse du produit <ol><li> Pour confirmer et de quantifier l&#39;érythromycine A la formation, injecter le surnageant de culture sur un système LC-MS (Figure 6). Érythromycine A disponible dans le commerce a été utilisée pour confirmer la production et en tant que norme lors de la quantification. Pour les cas sans normes disponibles dans le commerce, analyse LC-MS exigerait une caractérisation chimique supplémentaire par RMN et spectrométrie de masse haute résolution. </li><li> Comparer production entre les 3 colonies / cultures de la transformation BAP1. Choisissez le plus grand producteur et préparer un stock de glycérol à partir de la source de la colonie. Cette étape peut être effectuée en parallèle avec les cultures de production de la section Protocole2 à l&#39;aide d&#39;une petite partie des cultures de préparer des stocks de glycérol. Stocker le stock de glycérol dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Utilisation de la confirmation, le plus élevé des cellules productrices, commencer une culture de production séparée et extraire le surnageant final avec 2x volume d&#39;acétate d&#39;éthyle. Utilisez un système de vide par évaporation pour sécher l&#39;extrait et remettre en suspension dans 100 ul de méthanol. Transférer l&#39;extrait vers un disque de filtre stérile (diamètre ~ 1/4 pouce) et le disque de permettre de sécher. Par ailleurs, la culture B. subtillis à l&#39;état liquide LB pendant la nuit. Ajouter 20 ul de la B. subtilis culture de 20 ml de gélose LB liquide à 45 ° C. Plaque de l&#39;agar-agar et laisser se solidifier. Placez le disque filtre sur la plaque et incuber à 37 ° C (figure 7). En variante, l&#39;extrait peut être ajoutée à des cultures liquides dans une plaque 96-puits pour quantifier l&#39;activité en utilisant un lecteur de plaque (Figure 7). </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes critiques dans la biosynthèse hétérologue sont rencontrés à chacun des trois points de procédure dans le processus: 1) de transfert génétique, analyse des produits et 3), 2) la reconstitution de biosynthèse. Un problème à n&#39;importe quelle étape fera dérailler l&#39;objectif ultime d&#39;établir la biosynthèse hétérologue. Peut-être l&#39;aspect le plus difficile du processus est d&#39;établir la biosynthèse reconstitué, car cela est absolument nécessaire pour permettre une analyse r...

L&#39;érythromycine est un antibiotique A polykétide produite par le Gram positif bactérie du sol Saccharopolyspora erythraea et la production actuelle a été progressivement améliorée à ~ 10 g / L pendant des décennies de mutagenèse traditionnelle et protocoles de dépistage et, plus récemment, grâce à des programmes d&#39;optimisation des processus 1-6. Stratégies de mutagenèse et de criblage sont courantes dans le développement de produits antibiotique naturel en raison des difficultés de culture et / ou manipuler génétiquement hôtes de production indigènes et en raison de l&#39;activité antibiotique ou facilement disponibles phénotypes de croissance améliorées pour faciliter la sélection. Dans le cas de l&#39;érythromycine A, S. erythraea est limitée par un profil de croissance lente et l&#39;absence de plus directs techniques de manipulation génétique (par rapport à des organismes comme E. coli), donc, ce qui entrave l&#39;amélioration rapide de la production et de la biosynthèse de nouveaux produits dérivés. Ayant reconnu les problèmes de production et déverrouillé diversificatisur les possibilités avec des composés tels que l&#39;érythromycine A, la communauté scientifique a commencé à poursuivre l&#39;idée de la biosynthèse hétérologue (Figure 1) 7. Ces efforts ont coïncidé avec des informations de séquence disponible pour l&#39;érythromycine Un cluster 8-11 gène. Il convient de souligner que le nombre de séquences complexes naturels groupes de gènes de produits s&#39;est considérablement élargie 12-16, fournissant l&#39;impulsion de poursuivre les efforts dans la biosynthèse hétérologue d&#39;accès codé potentiel médicinal. Pour ce faire, la reconstitution hétérologue exige que le nouvel hôte de répondre aux besoins de la voie de biosynthèse spécifique. E. coli offre une commodité technique, un ensemble large couvrant des techniques de biologie moléculaire, et des stratégies d&#39;ingénierie métabolique et le processus de développement de produits. Pourtant, lorsqu&#39;on les compare à des hôtes de production indigènes, E. coli ne présentent pas le même niveau de production produit complexe naturel. Il était donc ignore si E. coli pourrait servir comme une option viable pour la biosynthèse hétérologue produit naturel complexe. Cependant, il a été supposé que E. coli serait un organisme hôte idéal si biosynthèse hétérologue pourrait être accompli. Avec cet objectif à l&#39;esprit, les efforts initiaux ont commencé à produire de l&#39;aglycone polycétide 6-désoxyérythronolide B (6dEB) à E. coli. Cependant, natif E. coli métabolisme n&#39;a pas pu fournir des niveaux appréciables de la propionyl-CoA et de (2S)-méthylmalonyl-CoA précurseurs nécessaires pour soutenir la biosynthèse 6dEB ne pouvait le nouvel hôte post-traductionnelle modifier la synthase B désoxyérythronolide (DEBS) enzymes. Pour remédier à ces problèmes, une voie métabolique composé d&#39;enzymes natives et hétérologues a été construite dans E. coli telles que le propionate de manière exogène a été alimenté à une transformation intracellulaire propionyl-CoA et l&#39;acide (2S)-méthylmalonyl-CoA, au cours de l&#39;ingénierie pour effectuer cette voie, un gène sfp a été placé dans the chromosome de E. coli BL21 (DE3) pour produire une nouvelle souche appelée BAP1. L&#39;enzyme est une Sfp capable phosphopantéthéinyle transférase de fixation du cofacteur 4&#39;-phosphopantéthéine aux enzymes DEBS 17,18. Les trois gènes DEBS (chaque ~ 10 kb) ont ensuite été placés sur deux vecteurs d&#39;expression contenant sélectionnables séparément promoteurs inductibles T7. Après un ajustement de la clé après l&#39;induction de la température (de 22 ° C), les gènes DEBS été coordonnée au sein BAP1 exprimé dans un état ​​actif capable de générer 6dEB 19. La poursuite de l&#39;érythromycine A la biosynthèse complète puis a commencé à utiliser un cluster de gènes analogues de Micromonospora megalomicea ou une voie hybride composé de gènes de S. erythraea, S. fradiae et S. venezuelae qui a produit l&#39;érythromycine intermédiaires C et 6-désoxyérythromycine D, respectivement 20-22. Récemment, notre groupe a étendu ces efforts en produisant erythromycin A (la forme la plus cliniquement pertinente de l&#39;érythromycine) à E. coli. Contrairement aux travaux antérieurs, notre stratégie coordonnée exprimé le S. 20 d&#39;origine gènes erythraea nécessaire pour la biosynthèse des polykétides, deoxysugar biosynthèse et de fixation, couture supplémentaire, et l&#39;auto-résistance (figure 2). Au total, 26 (natif et hétérologues) gènes ont été conçus pour permettre E. coli pour produire de l&#39;érythromycine A à 4 mg / L 23,24. Ce résultat place la production complète d&#39;un produit complexe naturel polycétide utilisant E. coli et sert de base pour tirer parti de cette possibilité nouvelle production ou de poursuivre de nouvelles.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Machine à PCR </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler personnelle </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Pêcheur </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporateur </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Pêcheur </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Propionate de sodium </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinose </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Agitateur réfrigéré </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Micro centrifuger </td><td> Eppendorf </td><td> Centrifugeuse 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Set escorte plasmide (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, PCDF Duo-1 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Acétate d&#39;éthyle </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Méthanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse à vide </td><td> Eppendorf </td><td> Concentrateur 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Évaporateur rotatif </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

La production hétérologue de produits naturels complexes est une approche visant à remédier aux limitations actuelles et les possibilités futures. Il est particulièrement utile pour les composés qui possèdent une valeur thérapeutique, mais peut-être pas suffisamment produites ou bénéficieraient d&#39;une forme améliorée de la production. Les procédures expérimentales impliquées peuvent être subdivisés en trois volets: 1) le transfert génétique; 2) la reconstitution hétérologue, et 3) l&#39;analyse du produit. Chaque composante expérimentale est en cours d&#39;optimisation continue pour relever les défis et anticiper les opportunités liées à cette nouvelle approche. Biosynthèse hétérologue commence par l&#39;identification d&#39;une séquence génétique responsable d&#39;un produit naturel précieux. Le transfert de cette séquence à un hôte hétérologue est compliquée par la complexité voie de biosynthèse responsable de la formation du produit. L&#39;antibiotique érythromycine A est un bon exemple. Vingt gènes (un total de&gt; 50 kb) sont nécessaires pour la biosynthèse éventuelle. En outre, trois de ces gènes codent megasynthases, multi-domaines enzymes chacun 300 ~ kDa dans la taille. Ce matériel génétique doit être conçu et transféré à E. coli pour la biosynthèse reconstitué. Le recours à l&#39;isolement PCR, la construction opéron, multi-cystronic plasmides et électro-transformation sera décrite dans le transfert de l&#39;érythromycine Un cluster génétique de E. coli. Une fois transféré, l&#39;E. coli cellule doit prendre en charge la biosynthèse éventuelle. Ce processus est également difficile étant donné les différences substantielles entre E. coli et la plupart des hôtes d&#39;origine responsables de la formation produit naturel complexe. La cellule doit fournir des substrats nécessaires pour soutenir la biosynthèse et coordonnée exprimer le cluster génétique transféré à produire des enzymes actives. Dans le cas de l&#39;érythromycine A, la E. coli cellule a dû être conçu pour fournir les deux précurseurs (RPopionyl-CoA et l&#39;acide (2S)-méthylmalonyl-CoA) nécessaire à la biosynthèse. En outre, des modifications de séquences de gènes, le nombre de copies du plasmide, chaperonine co-expression, de modification post-traductionnelle enzymatique, et la température de processus ont également été nécessaire pour permettre à l&#39;érythromycine finale A de formation. Enfin, la production doit être évaluée avec succès. Pour l&#39;érythromycine A cas, nous présentons deux méthodes. La première est la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) pour confirmer et quantifier la production. La bioactivité de l&#39;érythromycine A seront également confirmés par l&#39;utilisation d&#39;un test biologique dans lequel l&#39;activité antibiotique est testé contre Bacillus subtilis. Les tests d&#39;évaluation établissent la biosynthèse de l&#39;érythromycine A partir de E. coli et préparer le terrain pour les futurs efforts d&#39;ingénierie pour améliorer ou diversifier la production et à la production de nouveaux composés naturels complexes en utilisant cette approche.

Le résultat attendu de cette approche est la production d&#39;un produit entièrement naturel bioactif de l&#39;E. coli hétérologues hôte. Ceci est mieux représenté par les résultats de LC-MS utilisé pour confirmer et quantifier la production (figure 6) et le bio-essai antibactérien utilisé pour confirmer l&#39;activité finale (figure 7). Dans le régime général de la biosynthèse hétérologue, ce résultat définit le succès. Une fois accompli, les efforts de re...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

La biosynthèse hétérologue de l&#39;érythromycine A travers<em&gt; E. coli</em&gt; Comprend les étapes suivantes: 1) expérimentales de transfert génétique, 2) la reconstitution hétérologue, et l&#39;analyse du produit 3). Chaque étape sera expliquée dans le contexte de la motivation, le potentiel et les défis dans la production de produits thérapeutiques naturels à l&#39;aide<em&gt; E. coli</em&gt; Comme un hôte de substitution.

La logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel Avec l&#39;érythromycine complexe de l&#39;antibiotique A produite par<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K vues.  State University of New York at Buffalo. La biosynthèse hétérologue de l'érythromycine A travers E. coli Comprend les étapes suivantes: 1) expérimentales de transfert génétique, 2) la reconstitution hétérologue, et l'analyse du produit 3). Chaque étape sera expliquée dans le contexte de la motivation, le potentiel et les défis dans la production de produits thérapeutiques naturels à l'aide E. coli Comme un hôte de substitution.

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Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformation d&#39;ADN plasmidique dans E. coli en utilisant la méthode du choc thermique

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Recherche

Biologie

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

Traitement du pin taeda PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissection brut de l&#39;estomac du homard, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocoles de sélection mutagenèse et fonctionnelles pour l&#39;évolution dirigée de protéines dans les E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Méthode d&#39;évaluation des effets d&#39;une gamme de longueurs d&#39;onde et des intensités de Luminothérapie Rouge / proche infrarouge sur le stress oxydatif<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

Production de l&#39;homme Norovirus SAILLANTES Domaines dans<em&gt; E. coli</em&gt; Pour X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.