Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de la santé (1 R01 GM095384-01) décerné Forest Rohwer. Nous remercions Epicentre, une société Illumina pour fournir un accès précoce aux kits Ribo-Zero Epidémiologie. Nous remercions Mark Hatay pour la conception et la production du support de tube d&#39;ultracentrifugation. Nous remercions Andreas Haas et Benjamin Knowles pour des lectures critiques et discussions du manuscrit, et Lauren Paul pour aider le processus de tournage.

The authors have nothing to disclose.

La métagénomique virales Les particules virales sont concentrées en utilisant du polyethylene glycol (PEG) ou de petits concentrateurs de volume. Dans certains cas, la concentration peut ne pas être nécessaire, mais pré-filtration ou étapes de centrifugation basse vitesse sont utilisés pour éliminer les cellules eucaryotes et microbiennes. Lysats viraux seront enrichis et purifiés par gradient de densité 9,41 ultracentrifugation ou des filtres de petite taille (par exemple, 0,45 um) pour éliminer les cellules microbiennes eucaryotes et grandes 25. ultracentrifugation en gradient de densité est généralement effectuée avec des solutions denses mais inertes, tels que saccharose ou du chlorure de césium pour isoler et concentrer les particules virales 41. La séparation physique est basée sur la taille et la densité de flottaison des particules virales. Par conséquent, un choix approprié de la taille des pores du filtre et la préparation rigoureuse des gradients sont essentielles pour isoler les communautés viraux spécifiques, comme le succès de la récupération physique deVLP détermine la communauté isolé 41 (c.-à-particules virales qui ne passent pas par le filtre ou relèvent de la densité de l&#39;extraction ne sera pas détecté dans le métagénome). Après l&#39;isolement du virus et de la concentration, il peut y avoir contamination de matériau non viral génomique présent dans l&#39;échantillon à la fois sous la forme d&#39;acides nucléiques libres et microbiennes et des cellules eucaryotes. Par conséquent, il est essentiel de vérifier la pureté des particules virales dans des échantillons (figures 1A et 1B). Un traitement au chloroforme est généralement utilisé pour lyser les cellules restantes, suivi par traitement à la nuclease pour dégrader les acides nucléiques libres avant l&#39;extraction d&#39;acide nucléique. Une mise en garde au flux de travail présenté était l&#39;utilisation de gradient de densité de séparation pour isoler des particules virales comme il peut exclure particules virales enveloppées qui peuvent être trop soutenue pour entrer dans le gradient de CsCl. Une alternative &quot;fourre-tout&quot; méthode consiste à omettre le separ de gradient de densitéation et d&#39;isoler l&#39;ADN de la communauté des 0,45 um - filtrats traités avec du chloroforme et DNase I. Cette approche est également approprié pour accueillir petits volumes d&#39;échantillons tels que ceux de tampons ou plasma sanguin. Toutefois, cela peut entraîner la contamination bactérienne du chloroforme et résistant montant plus élevé de l&#39;ADN extracellulaire DNase I résistant. Protocoles de séquençage actuelles exigent une ng à 1 ug d&#39;acides nucléiques pour la préparation de la bibliothèque de séquençage lequel des rendements plus élevés d&#39;ADN fournissent un plus grand choix d&#39;options de séquençage. La concentration d&#39;ADN de viromes générés varie souvent en dessous de la limite de détection à plus de 200 ng / ul. La quantité d&#39;acides nucléiques viraux récupérés peut être insuffisant pour la préparation de la bibliothèque de séquençage direct. Dans de tels cas, l&#39;amplification de l&#39;acide nucléique est essentielle. Linker amplification shotgun bibliothèques (LASLs) 2,42,43 et l&#39;amplification du génome entier basé sur l&#39;amplification par déplacement multiple (MDA) sont les deuxméthodes les plus couramment utilisées pour générer suffisamment d&#39;ADN pour le séquençage. MDA méthodes telles que celles basées sur l&#39;ADN polymerase Phi29 sont connus pour souffrir d&#39;biais d&#39;amplification, et peuvent amplifier préférentiellement ADNsb et d&#39;ADN circulaire, d&#39;où la non-taxonomique quantitative et la caractérisation fonctionnelle 44,45. Une version optimisée de l&#39;approche LASLs a été montré à introduire seulement biais minimes, favorise une plus grande sensibilité (pour de petites quantités de matière première), et est facilement adapté pour différentes plates-formes de séquençage 43. Cependant, l&#39;approche comporte de nombreuses étapes, nécessite un équipement spécialisé pour minimiser la perte de l&#39;ADN, et est limitée à des modèles de ADNdb. Dans notre laboratoire, cette approche a été adaptée avec succès pour amplifier quantité détectable et indétectable de l&#39;ADN extrait de lavage- broncho, VLP coral- et maritimes provenant de l&#39;eau (non publiées et de Hurwitz et al. 46). Développer pipelines d&#39;analyse de données a classically été l&#39;un des aspects les plus difficiles de l&#39;analyse virale métagénomique en raison de la nature très diverse et largement inconnu des communautés virales. Bien qu&#39;il existe environ 10 huit génotypes viraux dans la biosphère, à ce jour des bases de données virales actuelles contenir ~ 4000 génomes viraux, soit environ 1 / 100.000ème de cette diversité virale total approximatif. Par conséquent, les recherches par similarité (telles que BLAST 47) pour l&#39;affectation taxonomique et fonctionnelle dans métagénomes virales possèdent défis inhérents. De nombreuses séquences manquer d&#39;avoir des similitudes importantes avec génomes dans la base de données, et par conséquent, sont classés comme inconnu. Bien que les recherches reposant sur ​​l&#39;homologie sont les applications les plus importantes pour l&#39;attribution taxonomie et fonctionnent de séquencer les données, des approches alternatives basées sur l&#39;analyse de base de données indépendante ont été développés 48- 50. Fancello et al. 51 fournissent un examen complet des outils informatiques et des algorithmes utilisés dans viral métagénomique. Microbienne métagénomique Typiquement, la quantité totale d&#39;ADN extrait de communautés microbiennes de lyse traité hypotonique (HL-ADN) vont de 20 ng à 5 ug. Le rendement est fortement tributaire de l&#39;état de santé du patient et de la quantité d&#39;échantillon d&#39;expectorations recueilli, ce qui explique les variations observées dans la production totale de HL-ADN extrait dans cette étude (tableau 2). Les étapes essentielles pour générer des données de séquences de bonne qualité se appuient sur ​​la qualité des bibliothèques de séquençage générées. La figure 2 montre une gamme typique de taille pour les bibliothèques de séquençage générées par ADN microbien FC crachats dérivé en utilisant une procédure de fragmentation de l&#39;ADN à base enzymatique. La taille optimale de la bibliothèque dépend du choix de la plateforme de séquençage et d&#39;application, et par conséquent, la procédure de fragmentation peut être optimisé, si nécessaire, par des approches alternatives, telles que la sonication et la nébulisation. En plus deles résultats représentatifs présentés, le succès de la méthode présentée sur crachats FC recueillies auprès de plusieurs patients à travers de multiples points dans le temps est également illustrée dans Lim et al. (2012) 9 et Lim et al. (2014) 10. Des études antérieures suggèrent que 9,10 chaque patient abrite un ensemble unique de communauté microbienne qui se déplace dans le temps, reflétant ainsi la persistance des acteurs majeurs au sein de la communauté tout fluctuations sont probablement dues à des perturbations telles que les traitements antibiotiques. Que ces fluctuations se produisent quotidiennement, même sans perturbations externes ou en raison de la procédure d&#39;échantillonnage et le traitement de l&#39;échantillon, est toujours en question. Sur la base de la metagénomique HL-ADN et analyse de l&#39;ADNr 16S de l&#39;amplicon, l&#39;échantillonnage longitudinal 7 jours montre que la variation journalière de profils microbiens sans perturbation antibiotique (jour 1, 2 et 3) a été minime (figures 3A et 3B). Dès l&#39;introproduction d&#39;antibiotiques par voie orale immédiatement après l&#39;échantillonnage Jour 3, les changements dans le profil de la communauté est devenu évident lors de la Journée 4. Alors que le antibiotique ciprofloxacine cible un large spectre de bactéries pathogènes connus tels que P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus et la pneumonie, le traitement a augmenté l&#39;abondance relative de P. aeruginosa tout en diminuant le Streptococcus spp. et P. melaninogenica. Par Jour 6, la communauté récupéré lentement à la structure de la communauté de départ initial. Les résultats suggèrent que les fluctuations de profils microbiens dans un seul patient sont plus probablement due à des perturbations de la communauté dans les voies respiratoires. Compte tenu de la cohérence entre les profils microbiens des bibliothèques et métagénomes ADNr 16S de l&#39;ADN HL dérivés, nous nous sommes prononcés sur les biais provenant des amorces 16S ARNr utilisées dans cette étude. Une explication possible pour les différences observées dans l&#39;ADNr 16S taxonomiqueal profils générés à partir d&#39;ADN et l&#39;ADN total de HL-dérivé (figure 3B) peut être la présence de quantités élevées de Pseudomonas spp. ADN extracellulaire après le traitement antibiotique. Ceci est soutenu par les résultats que ces différences étaient plus apparent au Jour 7, trois jours après le traitement aux antibiotiques, qui vise Pseudomonas spp. en plus des autres. La ciprofloxacine est couramment utilisé comme traitement de première ligne chez les patients atteints de mucoviscidose et P. chronique aeruginosa l&#39;infection, même si son spectre d&#39;activité inclut la plupart des agents pathogènes des FC associée. Nous émettons l&#39;hypothèse que le traitement antibiotique éradique communautés sensibles en incluant Streptococcus spp. et donc la création d&#39;un créneau rempli par P. résistant aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa peut gagner la résistance en augmentant ses communautés des biofilms et de l&#39;ADN extracellulaire a été démontré que le principal soutien structurel de son architecture de biofilm 52. Même en tant que til structure de la communauté récupéré, l&#39;ADN extracellulaire soit restée dans les expectorations FC. Par conséquent, ces données suggèrent que la lyse hypotonique et les étapes de lavage présentés dans ce flux de travail potentiellement bénéficier non seulement de retirer l&#39;ADN d&#39;origine humaine, mais l&#39;ADN extracellulaire également origine microbienne qui peuvent déformer les profils microbiens réels. Metatranscriptomics Une haute qualité metatranscriptome doit contenir relativement peu de séquences ARN ribosomique (ARNr) et représentent un échantillonnage biaisé des transcriptions communautaires (ARNm). En raison de la courte demi-vie et de la quantité limitée de l&#39;ARNm, il est essentiel que le protocole, tel que présenté ici, réduit au minimum la manipulation des échantillons de maximiser le nombre de transcrits récupérés. Au cours des dernières années, plusieurs approches pour l&#39;ARNr épuisement ont été développés et adaptés dans des kits disponibles dans le commerce. Il se agit notamment MICROB Enrich, Ribo-Zero, et spécifique échantillon h soustractiveybridizations 53 qui sont basées sur l&#39;hybridation d&#39;oligonucléotides, et l&#39;ARNm-ONLY kit qui est basée sur l&#39;activité enzymatique de l&#39;ARN exonucléase de ciblage contenant une &#39;monophosphate 5. En outre, plusieurs approches pour enrichissements ARNm tels que le Kit II-bactéries MessageAmp que polyadenylates préférentiellement et amplifie l&#39;ARN linéaire sont également disponibles. Certaines de ces méthodes (par exemple, ARNm-ONLY, MICROB E xpress et MessageAmp) sont utilisés en même temps pour une efficacité optimale. Cependant, l&#39;efficacité de toutes ces approches sont limitées, en particulier lorsque vous travaillez avec partiellement dégradée ARNr, aussi souvent observé dans l&#39;ARN total extrait à partir d&#39;échantillons FC. Polyadénylation de l&#39;ARN-dépendante amplification ne peut pas être utilisé pour générer metatranscriptomes constitués à la fois de l&#39;ARNm eucaryote et procaryote. En outre, le poly (A) ajouté à la queue les séquences peuvent réduire la quantité de données de séquences utiles. Régions avec des étendues d&#39;homopolymère auront tendance à avoir des scores de qualité inférieure, cAUtilisation un nombre important de lit à filtrer par séquençage et logiciel de post-séquençage, et la durée moyenne de lecture utile après rogner poly (A) queues seront réduits de manière significative 54. Traiter avec les communautés microbiennes du FC complexes et ARN partiellement dégradé (figures 4A et 4C), notre étude précédente a montré que la méthode d&#39;hybridation de capture par le kit Ribo-Zero or était plus efficace pour éliminer à la fois ARNr humaine et microbienne par rapport aux traitements combiner à l&#39;aide d&#39;autres kits 9 (tableau 3). Les données résultantes permet l&#39;analyse simultanée de deux hôte humain et les transcriptions microbiennes. Selon le rendement et la qualité de l&#39;ARN, ainsi que le choix final de la plate-forme de séquençage, beaucoup de ces procédés comprenant l&#39;étape de synthèse d&#39;ADNc peut être simplifié avec la génération de la bibliothèque de séquençage. Par exemple, l&#39;ARN traité Ribo-Zero peut être utilisé pour faire le séquençage de metatranscriptome libraRies utilisant le kit ScriptSeq ARN-Seq Bibliothèque Préparation. Analyse métagénomique des communautés animales associées fournit une représentation globale de l&#39;entité fonctionnelle globale qui comprend l&#39;hôte et ses communautés associées. Le flux de travail présenté ici peut être adapté à une variété d&#39;échantillons d&#39;origine animale associée complexes, en particulier ceux qui contiennent du mucus épais, de grandes quantités de débris cellulaires, de l&#39;ADN extracellulaire, les protéines et les complexes glycoprotéiques, ainsi que des cellules hôtes, en plus de la microbienne virale et souhaitée particules. Bien que les particules virales et microbiennes peuvent être perdues à chaque étape, les particules isolement et la purification sont essentiels pour réduire au minimum la quantité d&#39;ADN de l&#39;hôte. Bien que les données de la métagénomique fournit potentiels métaboliques des communautés examinés, metatranscriptomics compléter ce en révélant l&#39;expression différentielle des fonctions codées 9. Une évaluation complète de la génomique et les transcriptions des données a donné de nouvelles insDROITS à la dynamique des interactions communautaires et facilite le développement d&#39;améliorer les thérapies 9,10,55.

<html> Communautés virales et microbiennes associées avec le corps humain ont été étudiés en détail dans la dernière décennie grâce à l&#39;application des technologies de séquençage 1,2. Les résultats ont conduit à la reconnaissance des microbes d&#39;importance en matière de santé humaine et la maladie. La principale initiative est venue du projet humain de microbiome qui décrit les bactéries (et certains archées) résidant sur ​​la peau humaine, et à l&#39;intérieur des cavités orales, les voies respiratoires, tractus urogénital, tractus gastro-intestinal et 3. D&#39;autres études sur le microbiome de voies respiratoires humains sains par lavage broncho-alvéolaire (LBA) 4,5 et 4 prélèvements nasopharyngés ont montré que le poumon peut servir de dispositif d&#39;échantillonnage de l&#39;environnement, les résultats dans la colonisation microbienne transitoire dans les voies respiratoires. Toutefois, l&#39;incidence de la colonisation microbienne de surfaces des voies aériennes aveugles peut conduire à des infections pulmonaires sévères et chroniques, telles que celles observées dans la fibrose kystique (CF) patients. t &quot;&gt; CF est une maladie génétique létale provoquée par la mutation dans la fibrose kystique régulateur transmembranaire (CFTR) 6. Ces mutations donnent lieu à des protéines CFTR défectueux qui à son tour affecte le transport des ions transépithélial sur la surface apicale de l&#39;épithélium. La maladie affecte systèmes d&#39;organes multiples, mais la majorité de la mortalité et de la morbidité est imputable à la maladie pulmonaire CF 7. Le FC poumon fournit un écosystème unique pour la colonisation microbienne. Le défaut de transport d&#39;ions provoque le mucus à se accumuler dans les voies aériennes des FC, la création des micro-environnements constitués d&#39;aérobie , microaérophiles ou des compartiments anaérobies ancrés par une surface muqueuse riche en éléments nutritifs statique. Cet environnement facilite la colonisation et la prolifération des microbes, notamment virales, des bactéries et des champignons. aiguë et les infections microbiennes pulmonaires chroniques conduisent à des réponses immunitaires constants mais inefficaces, d&#39;où vaste remodelage des voies respiratoires, perte de capacité pulmonaire, et, finalement, pulmoéchec naire. Les communautés bactériennes associées au poumon CF ont été bien décrits en utilisant deux approches de la culture-dépendantes et indépendante de la culture, qui comprennent l&#39;aide de l&#39;ARN ribosomal 16S (ARNr) de séquençage des gènes 8 et métagénomique de fusil de chasse 9,10. L&#39;approche fondée sur les ARNr 16S est capable de caractériser un large éventail d&#39;espèces microbiennes et de capturer de vastes changements dans la diversité de la communauté. Toutefois, il est limité dans sa résolution en définissant les collectivités (résumé dans Claesson et al. 2010 11) et les prédictions des potentiels métaboliques sont limités aux fonctions générales connues pour la taxons identifiés. Par conséquent, ARNr 16S méthodes de séquençage de gènes sont insuffisantes pour l&#39;exactitude taxonomique et fonctionnelle analytique nécessaire des diverses communautés microbiennes présentes dans les poumons des FC. L&#39;approche métagénomique décrit ici complète l&#39;approche fondée sur les ARNr 16S, surmonte ses limites, et permet une manière relativement efficaced&#39;analyser à la fois la taxonomie de la communauté microbienne et contenu génétiques dans les poumons des FC. ADN isolé à partir d&#39;échantillons microbiens d&#39;origine animale associé contient souvent une grande quantité d&#39;ADN de l&#39;hôte. Échantillons d&#39;expectorations ou de tissus du poumon CF contiennent généralement une grande quantité d&#39;ADN humain libérée par les neutrophiles dans la réponse immunitaire, souvent supérieure à 99% de l&#39;ADN total de 12 à 14. Bien que certaines cellules humaines intactes peuvent être présents, plus de cet ADN est libre en solution ou adsorbé à la surface des microbes. En outre, la présence de bouchons de mucus visqueux exceptionnellement, les débris cellulaires et d&#39;autres contaminants inconnus compliquent encore l&#39;isolement de cellules microbiennes. Plusieurs procédés ont été testés pour appauvrissant ces échantillons d&#39;ADN humain, y compris les gradients de Percoll à humain distinct de cellules microbiennes 15, le traitement par la DNase I, du bromure d&#39;éthidium à monoazoture dégrade sélectivement l&#39;ADN humain 16, et le kit MolYsis, le tout avec un succès limité.<html> A ce jour, le procédé de purification plus efficace de l&#39;ADN microbien pour expectorations CF a été une modification du procédé décrit par Breitenstein et coll. (1995) 17. Cette approche, appelée ici méthode de lyse hypotonique (HL), utilise une combinaison de β-mercaptoéthanol pour réduire les liaisons disulfures de mucine, une lyse hypotonique des cellules eucaryotes, et le traitement de l&#39;ADN de la DNase I soluble 9. Malgré l&#39;absence de solutions de rechange la méthode de HL a soulevé certaines préoccupations en raison de (i) de biais possibles résultant de lyse indésirable de microbes et (ii) si les fluctuations observées dans la composition des communautés 9,10 sont un artefact de variations associées avec le traitement des échantillons. En plus de la génération de métagénomes de fusil de chasse, nous abordons ces questions en comparant les profils de gènes ARNr 16S de l&#39;ADN total et de l&#39;ADN microbien extrait de la méthode de HL en utilisant le même ensemble d&#39;échantillons de crachats prélevés chez un seul patient sur sept jours consécutifs. ent &quot;&gt; Comparé aux communautés microbiennes, la caractérisation des communautés virales associé avec des animaux est limitée 18,19 Les communautés virales dans les voies respiratoires des FC ne ont été caractérisé minimalement 20 -.. 22 La première étude métagénomique caractériser l&#39;ADN des communautés virales des voies respiratoires FC ont montré que la plupart des virus associés aux poumons FC sont phages 20. Le potentiel métabolique de phage dans les FC et les individus non-FC était significativement différente. En particulier, les communautés de phages chez les individus FC réalisées gènes reflète adaptations hôtes bactériennes à la physiologie des voies aériennes des FC, et bactériennes. virulence 20 études métagénomiques ultérieures de virus dans les tissus pulmonaires FC démontré hétérogénéité spatiale distinct de communautés virales entre les régions anatomiques 22. En outre, le tissu pulmonaire FC nourrissait le plus bas diversité virale observée à ce jour dans tout écosystème 22. La plupart des virus identifiés étaient phagesavec le potentiel d&#39;infecter pathogènes FC. Cependant, les virus eucaryotes tels que des virus herpétiques, les adenovirus et les virus du papillome humain (VPH) ont également été détectées. Dans un cas, où kystes dans les tissus pulmonaires ont été observées lors de la dissection, plus de 99% d&#39;un génome de papillomavirus humain a été récupéré, même si le patient n&#39;a jamais été diagnostiqué avec un papillome ou du carcinome pulmonaire. Cela indique que la diversité virale présente non seulement reflète la gravité des lésions tissulaires, mais peut également exposer et expliquer une maladie sous-jacente non caractérisée. Les protocoles décrits ici fournissent un moyen simple, mais puissant pour isoler des particules virales (VLP) à partir d&#39;échantillons constitués de grandes quantités de mucus épais, hôte et des cellules microbiennes, ADN libre, ainsi que les débris cellulaires. En complément de la métagénomique, metatranscriptomics est utilisé pour suivre la dynamique de l&#39;expression génique dans la communauté microbienne et l&#39;hôte 9,23. Dans ce cas, à la fois microbienne et host ARNm doivent être préférentiellement choisi. Étant donné que les ARNm polyadénylés bactériennes ne sont pas, un procédé déroulant ARNm basée sur oligo-dT ne peut être exploitée. Polyadénylation de l&#39;ARN dépendant de l&#39;amplification peut pas être utilisé dans des échantillons de l&#39;hôte associé si les échantillons sont connues pour contenir de grandes quantités d&#39;ARNm eucaryote. De nombreux échantillons d&#39;origine animale, y compris les expectorations associé CF, contiennent une forte densité de cellules en plus de grandes quantités de débris cellulaires et des nucleases qui comprennent des RNases. Par conséquent, un autre défi est d&#39;éviter une dégradation de l&#39;ARN au cours metatranscriptome traitement. Dans la plupart des cas, l&#39;ARN total extrait de crachats CF est partiellement dégradé, ce qui limite les applications en aval et l&#39;utilité de l&#39;ARN dérivé. Au cours des dernières années, plusieurs approches pour l&#39;ARNr épuisement ont été développés et adaptés dans des kits disponibles dans le commerce. L&#39;efficacité de ces approches est toutefois limitée, en particulier lorsque vous travaillez avec partiellement dégradée ARNr 9,24. Les méthodes employées ici permettented pour la récupération de l&#39;ARN total partiellement dégradé adapté pour aval enlèvement de ARNr totale efficace. La comparaison directe de l&#39;efficacité dans l&#39;élimination de l&#39;ARN total à partir de l&#39;ARNr partiellement dégradé comparant deux kits différents a été illustrée par Lim et al. (2012) 9. Dans l&#39;ensemble, l&#39;objectif de ce manuscrit est de fournir un ensemble complet de protocoles (Figure 1) pour générer métagénomes virales et microbiennes fusil de chasse, et un metatranscriptome, à partir d&#39;un seul échantillon de l&#39;animal associé, en utilisant échantillon d&#39;expectoration induite comme un exemple. Moléculaire flux de travail du laboratoire devrait inclure des zones pré- et post-amplification séparés pour minimiser la contamination croisée. Les méthodes sont facilement adaptables à d&#39;autres types tels que les tissus 22, du nasopharynx et oropharyngés 25, lavage broncho-alvéolaire (LBA) et le corail (données non publiées) échantillons. Chaque échantillon doit être traité dès la collecte surtout quand métagénomique microbiennes et a rencontréétudes de atranscriptomics sont souhaitées. Si les échantillons ont été congelés, il limite l&#39;isolement de cellules microbiennes intactes pour que le gel métagénomes microbiennes potentiellement perturber l&#39;intégrité cellulaire. Cependant, la congélation ne exclut pas metatranscriptomics et isolement viral, mais la qualité de l&#39;ARN et la quantité de particules virales récupérées peuvent être affectés par le processus de congélation-décongélation. Il est important de noter que l&#39;expectoration induite a servi de principale source d&#39;échantillons dans de nombreuses études associés aux patients atteints de mucoviscidose adultes et d&#39;autres maladies pulmonaires chroniques comme 26,27 BAL peut être trop envahissante. Dans nos études, les échantillons d&#39;expectoration ont été recueillies avec une méthode d&#39;échantillonnage minutieuse et cohérente, ce est à dire, à la suite rince-bouche et le rinçage de la cavité buccale en utilisant une solution saline stérile pour maintenir la contamination des microbes oraux dans les échantillons de crachats au minimum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

L&#39;accessibilité de séquençage à haut débit a révolutionné de nombreux domaines de la biologie. Afin de mieux comprendre les communautés microbiennes et virales hôte associé, un flux de travail complet pour extraction de l&#39;ADN et l&#39;ARN a été développé. Le flux de travail génère simultanément de métagénomes virales et microbiennes, ainsi que metatranscriptomes, à partir d&#39;un seul échantillon pour le séquençage de prochaine génération. Le couplage de ces approches donne un aperçu à la fois des caractéristiques taxonomiques et les fonctions communautaires codé. Les méthodes présentées utilisent la fibrose kystique (CF) crachats, un type d&#39;échantillon problématique, car il est exceptionnellement visqueux et contient une quantité élevée de mucines, l&#39;ADN de neutrophiles libre, et d&#39;autres contaminants inconnus. Les protocoles décrits ici ciblent ces problèmes et avec succès récupérer l&#39;ADN viral et microbienne avec une contamination minimale de l&#39;ADN humain. Pour compléter les études de métagénomique, un protocole de metatranscriptomics a été optimisé pour récupérer deux microbienneet l&#39;ARNm hôte qui contient relativement peu de l&#39;ARN ribosomique (ARNr) séquences. Un aperçu des caractéristiques de données est présenté à servir de référence pour évaluer le succès de ces méthodes. Échantillons de crachats CF supplémentaires ont également été recueillies pour (i) évaluer la cohérence des profils sur le microbiome dans sept jours consécutifs dans un seul patient, et (ii) comparer la cohérence de l&#39;approche métagénomique à un séquençage à base de gène ARN ribosomal 16S. Les résultats ont montré que la fluctuation quotidienne des profils microbiens sans perturbation antibiotique était minime et les profils de taxonomie des bactéries communes CF-associés étaient très similaires entre les bibliothèques ADNr 16S et métagénomes générés par la lyse hypotonique (HL) -derived ADN. Toutefois, les différences entre les profils d&#39;ADNr 16S taxonomiques générés à partir de l&#39;ADN total et HL-ADN dérivé suggèrent que la lyse hypotonique et les étapes de lavage à bénéficier non seulement la suppression de l&#39;ADN d&#39;origine humaine, mais également extracellul origine microbiennear ADN qui peuvent déformer les profils microbiens réels.

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Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Utilisation de la fibrose kystique voies aériennes, par exemple, l&#39;article présente un flux de travail complète comprenant une combinaison d&#39;approches metagénomiques metatranscriptomic et de caractériser la communauté microbienne et virale dans des échantillons d&#39;origine animale associée.

Purifier l&#39;impur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons d&#39;animaux associés

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K vues.  San Diego State University.  Utilisation de la fibrose kystique voies aériennes, par exemple, l'article présente un flux de travail complète comprenant une combinaison d'approches metagénomiques metatranscriptomic et de caractériser la communauté microbienne et virale dans des échantillons d'origine animale associée. 

Vidéo: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Purifiant l&#39;ADN plasmidique des colonies bactériennes en utilisant le kit Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

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Biologie

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissection brut de l&#39;estomac du homard, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Une méthode CLHP lectine pour enrichir sélectivement peptides glycosylés d&#39;échantillons biologiques complexes

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Microarray Anticorps chimiquement bloqué pour multiplexée à haut débit de profilage de glycosylation des protéines spécifiques dans les échantillons complexes

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Tirant des Nanotubes de la Membrane des vésicules unilamellaires géant

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Quasi-métagénomique analyse des Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.